בדיקות שאינן תלויות בחמצן למדידת תפקוד המיטוכונדריה ביונקים

1. מבחני התפשטות למדידת הפעילות של קומפלקס I, דיהידרורוט דהידרוגנאז (DHODH) ופעילויות V מורכבות זריעת תאים לבדיקות התפשטותהערה: פרוטוקול זה משתמש בקו תאי אוסטאוסרקומה אנושי 143B שנרכש באופן מסחרי מ-ATCC. קו תאים זה שימש תחת ההנחיות של פרוטוקול הוועדה המוסדית המאושרת שלנו לבטיחות ביולוגית (IBC).מוציאים את הצלחות מאינקובטור תרביות הרקמות. שאפו את התווך מהצלחות, ושטפו במי מלח חוצצים פוספט (PBS) כדי להסיר את שאריות המדיום. שאפו את PBS, וכסו את המנה ב-0.05%-0.25% טריפסין כדי להרים את התאים מתחתית הצלחת. המתן 3-5 דקות עד שהטריפסין ישחרר את התאים מהצלחת, ולאחר מכן הרוה את הטריפסין עם 10 מ”ל של מדיום הגידול הרצוי המכיל 10% נסיוב בקר עוברי (FBS). אספו את התאים בצינור חרוט, וצנטריפוגה ב 1,000 × גרם במשך 5 דקות כדי לגלול את התאים. שאפו את המדיום מהצינור מבלי להפריע לכדור. להשעות את הגלולה עם מדיום מלא. ספרו את התאים, וכמתו את הנפח הדרוש כדי לזרוע בין 10,000 ל-25,000 תאים בצלחת בעלת 6 בארות.הערה: כל קו תאים יצטרך להיות ממוטב עבור מספר התאים שיש לזרוע. המפגש האידיאלי שהושג הוא ~10% בתחילת הניסוי ו~80% בסוף הניסוי. פיפטה את התאים לתוך צלחת 6 בארות, ולהוסיף 2 מ”ל של מדיום שלם לבארות. יש להמתין 24 שעות לפני המעבר לתנאי הניסוי הבינוניים.הערה: זרעו לפחות שלושה עותקים משוכפלים לכל מצב ומספיק בארות כדי לבדוק את מצב הבקרה הלא מטופל, מצב הבקרה שטופל במעכבים, מצב ניסיוני לא מטופל ומצב ניסיוני שטופל במעכבים. שינוי בינוני להערכת פעילות V מורכבת על ידי התפשטותהערה: תאים המתרבים בתווך עם גלקטוז תלויים בפעילות V מורכבת עבור סינתזת ATP 9,10. שלא כמו גלוקוז, אשר מניב נטו שני ATP מגליקוליזה, גלקטוז אינו מניב אף אחד, מה שמאלץ את התאים להיות תלויים בקומפלקס V עבור סינתזת ATP (איור 1). אוליגומיצין מעכב V מורכב משמש כבקרה.לייצר 10 mM גלוקוז המכיל מדיום (ראה טבלה 1). הכינו תווך המכיל גלקטוז בנפח 10 מילימטר (ראו טבלה 1). שנה את התווך בכל באר ל- DMEM המכיל גלוקוז או DMEM המכיל גלקטוז. הוסף אוליגומיצין של 5 מיקרומטר (מעכב V מורכב) לבארות הרלוונטיות ונפח זהה של DMSO לבארות הלא מטופלות. מלאי האוליגומיצין הוא 10 מילימטר מושעה מחדש ב- DMSO. החזירו את הצלחת לאינקובטור תרבית הרקמה למשך יומיים. שינוי בינוני להערכת פעילות I מורכבת על ידי התפשטותהערה: תאים המתרבים בתווך נטול פירובט מסתמכים יותר על פעילות קומפלקס I11,12. ללא פירובט, התאים בתרבית זקוקים לקומפלקס I כדי להקל על רוב החמצון מחדש של NADH בחזרה ל-NAD+ (איור 2). קומפלקס I מעכב rotenone משמש כבקרה.הפוך מדיום DMEM ללא פירובט בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. הכינו תמיסת פירובט באורך 1 מ’ (ראו טבלה 1). שנו את התווך בכל באר למדיום נטול פירובט או למדיום המכיל פירובט. הוסף 2 מיקרומטר רוטנון (קומפלקס I מעכב) לבארות המטופלות ואת אותו נפח של DMSO לבארות הלא מטופלות. מלאי הרוטנון הוא 25 מילימטר מושעה מחדש ב- DMSO. החזירו את הצלחת לאינקובטור תרבית הרקמה למשך יומיים. שינוי בינוני להערכת פעילות DHODH על ידי התפשטותהערה: תאים המתרבים במדיה נטולת אורידין דורשים פעילות דיהידרורוט דהידרוגנאז (DHODH)11,12,13. בהיעדר אורידין אקסוגני, התאים בתרבית מסנתזים פירימידינים דרך מסלול דה נובו. מעכב DHODH brequinar משמש כבקרה.הפוך DMEM ללא אורידין בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. הכינו תמיסת ציר אורידין של 10 מ”ג/מ”ל ולאחר מכן הכינו מדיום אורידין של 100 מיקרוגרם/מ”ל (ראו טבלה 1). שנה את המדיום בכל באר למדיום ללא אורידין או למדיום המכיל אורידין. הוסף 5 μM brequinar (מעכב DHODH) לבארות המטופלות ואת אותו נפח של DMSO לבארות שאינן מטופלות. מלאי brequinar הוא 10 mM מושעה מחדש DMSO. החזירו את הצלחת לאינקובטור תרבית הרקמה למשך יומיים. ספירת התאים לבדיקות התפשטותעבור כל הניסויים, לחדש את המדיום כל יומיים. אם המדיום הופך לצהוב בצבע, הגדל את תדירות השינויים בתווך. לאפשר לתאים להתרבות עד 7 ימים, ולהפסיק את הניסוי אם אחת הבארות מתחילה להיראות מגודלת יתר על המידה. בארות נחשבות מגודלות כאשר המפגש עולה על 80%. שואפים את המדיום, שוטפים עם 1x PBS, ומכסים את תחתית הבאר עם 0.25% טריפסין (500 μL עבור צלחת 6 באר). המתינו 5 דקות עד שהתאים הרימו את המנה. בדוק זאת תחת מיקרוסקופ. להרוות את טריפסין עם 1 מ”ל של DMEM מלא המכיל 10% FBS. פיפטה למעלה ולמטה כדי לפרק את גושי התא. הכינו כוסות דלפק קולטר על ידי מילוי כל אחת מהן ב-10 מ”ל של חיץ איזוטוני (אחת לכל באר). ספור את התאים במונה תאים ורשום את הנתונים. אם הקריאה היא תאים למיליליטר (תאים/מ”ל), הכפל את הערך שנרשם ב- 1.5 כדי לקבל את מספר התאים הכולל לכל באר.הערה: שיטות אחרות לספירת תאים כגון המוציטומטר יספיקו אם למעבדה אין מונה קולטר. 2. 13C 4-Aspartate מעקב איזוטופים יציבים וניתוח LC-MS למדידת פעילות DHODH 13C 4-aspartate מעקב איזוטופ יציב בתאים דבקיםהערה: ניתן לנטר ישירות את פעילות DHODH על ידי מדידת השילוב של 13 C 4-aspartate לתוך 13C 3-UMP. Brequinar משמש כבקרה לפעילות DHODH (איור 3). הרמות המתקבלות של 13C3-UMP הן מדד לפעילות DHODH.זרעו בין 250,000 ל-500,000 תאים בצלחת של 6 בארות כדי להשיג מפגש של 75% למחרת. הכינו תמיסת מלאי של 250 mM 13 C 4-aspartate ו-10 mM 13C4-aspartate בינוני (ראה טבלה 1). שנה את המדיום בכל באר למדיום המכיל 10 mM 13C 4-aspartate. לדגור במשך מספר השעות המתאים כדי להשיג מצב יציב עבור תיוג התאים המעניינים.הערה: המצב היציב מוגדר כמסגרת הזמן שבה אחוז המטבוליטים המסומנים יורד לאורך זמן14. עבור 143B תאי אוסטאוסרקומה, 13C 4-aspartate משיג מצב יציב על ידי 8 שעות. מומלץ לקבוע מסגרת זמן זו לפני הניסוי על ידי ביצוע ניסוי מסלול זמן עם האיזוטופ היציב של עניין. בידוד מטבוליטים מהתאים הדבקיםלפני שתתחילו, הכינו דלי קרח יבש, והכינו 80% MeOH בדרגת HPLC במים ברמת HPLC. קררו את החיץ הזה במקפיא בטמפרטורה של 80°C למשך הלילה או הניחו אותו ישירות על קרח יבש. מוציאים צלחת אחת בכל פעם מהאינקובטור, שואפים את המדיום מהבארות, ושוטפים 2x עם 1x PBS. הסר את כל שאריות PBS מהבארות לפני שתעבור לשלב הבא.הערה: הקפידו להטות את הצלחת בזמן השאיפה ואת הפיפטה כנגד דופן התבשיל כדי למנוע הפרעה לתאים הדבקים. הניחו את הצלחת על קרח יבש, והוסיפו מיד 800 μL של 80% MeOH בדרגת LCMS במים בדרגת LCMS 20% לכל באר. לדגור על הצלחת לפחות 15 דקות במקפיא של -80 מעלות צלזיוס כדי להקל על ליזה של תאים.הערה: בשלב זה, ניתן להוציא את הצלחת הבאה מהאינקובטור ולחזור על שלבים 2.2.1-2.2.4. המשיכו בכך עד שכל הצלחות ידגרו במקפיא של -80°C. מוציאים צלחת אחת בכל פעם מהמקפיא, מגרדים כל באר על קרח יבש באמצעות מרים תאים, ומעבירים את הליזט לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ”ל. שמור את הצינור על קרח יבש עד לשלב הבא. מערבלים את כל הצינורות במשך 10 דקות ב 4 ° C, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 4 ° C במשך 10 דקות במהירות מקסימלית (לפחות 17,000 × גרם). מעבירים את הסופרנאטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ”ל, ומייבשים ברכז ואקום בטמפרטורה של 4°C המצויד במלכודת קרה של -105°C על גבי ואקום גבוה למשך כ-6 שעות או עד שהדגימות מתאדות. לאחר ייבוש הליזט, אחסנו את כדורי המטבוליט בטמפרטורה של -80°C עד שיהיו מוכנים להכין אותם לכרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסות (LCMS). מדידת כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית מסה נוזלית (LC-MS) של מטבוליטים קוטבייםהערה: כל זרימת עבודה כרומטוגרפית וספקטרומטריית מסות המאפשרת זיהוי של אספרטט, מתווכים בביוסינתזה של דה נובו פירימידין ו- UMP תספיק14.הכינו את הדגימות עבור LCMS על קרח על ידי הוספת 100 μL של מים בדרגת HPLC לכדוריות ולמערבולות המיובשות למשך 10 דקות ב-4°C. צנטריפוגו את הדגימות בטמפרטורה של 4°C למשך 10 דקות במהירות מרבית (לפחות 17,000 × גרם) והעבירו 25 μL לכל בקבוקון LC-MS. הזריקו 2 μL של ליזט למערכת LC-MS. להלן מתודולוגיה נפוצה:הכינו שלב נייד A הכולל 20 mM אמוניום פחמתי (בדרגת LC-MS) ו-0.1% אמוניום הידרוקסיד (LC-MS Grade) מומס במים בדרגת LC-MS. בחר 100% אצטוניטריל (LC-MS Grade) כשלב B נייד. עבור הכרומטוגרפיה, בחר עמוד אנליטי בגודל 5 מיקרומטר, 150 מ”מ x 2.1 מ”מ המצויד בעמוד מגן בגודל 2.1 מ”מ x 20 מ”מ עבור תרכובות הידרופיליות (ראה טבלת חומרים). כוונו את תנור העמודים ל-25°C. השתמש בהגדרות הכרומטוגרפיה הנוזלית הבאות: קצב זרימה קבוע של 0.15 מ”ל/דקה; שיפוע ליניארי מ-80% ל-20% שלב B נייד למשך 20 דקות, ואחריו שיפוע ליניארי מ-20% ל-80% שלב B נייד למשך 0.5 דקות, ואחריו החזקה בשלב B נייד של 80% למשך 7.5 דקות. בחר את הגדרות ספקטרומטר המסות הבאות: סריקה מלאה בין m/z 70 Da ו- 1,000 Da; החלטה של 70,000; יעד AGC של 1 × 106; וזמן הזרקה מקסימלי של 20 אלפיות השנייה. הפעל את המקור במצב מיתוג קוטביות. הגדר את מתח הריסוס ב- 3.0 קילו וולט, את הנימים המחוממים ב- 275 מעלות צלזיוס, את בדיקת HESI ב- 350 מעלות צלזיוס, את זרימת גז הנדן ב- 40 יחידות, את זרימת גז העזר ב- 15 יחידות ואת זרימת הגז המטאטא ביחידה אחת. בצע את ניתוח הנתונים באמצעות כל תוכנה המתממשקת לזרימת העבודה LCMS.הערה: התוכנה המשמשת עם זרימת העבודה לעיל היא XCalibur (Thermo) ו- TraceFinder (Thermo). להלן השיקולים העיקריים לניתוח נתונים:זמני שמירה צפויים: קבע את זמן השמירה של כל מטבוליט על ידי הפעלת הסטנדרטים עבור כל מטבוליט מעניין באמצעות השיטה הכרומטוגרפית לפני הניסוי.הערה: זמני השמירה של UMP והאיזוטופולוגים שלו, כולל 13C 3-UMP, זהים בדיוק. M/Z צפוי עבור מטבוליטים: אם מטבוליט מיינן במצב יון שלילי (כגון UMP), חשב את המסה המדויקת הצפויה באמצעות הנוסחה המולקולרית של UMP פחות פרוטון [C 9 H14N2O9P]. עבור מטבוליטים המייננים במצב יונים חיוביים, חשב את המסה המדויקת באמצעות הנוסחה המולקולרית בתוספת פרוטון. דיוק מסה: בעת שימוש בספקטרומטר מסות אורביטרפ, המטבוליט המעניין והאיזוטופולוגים שלו צפויים להיות בעלי דיוק מסה ±5 mmu. השתמש בתוכנה כדי לחשב זאת, תוך התחשבות ב- M/Z הצפוי וב- M/Z שזוהה בפועל. תיקון שפע טבעי: כל נתוני העקיבה צפויים לעבור תיקון שפע טבעי כדי להסביר את ~1% 13C ו~0.5% 15 N-איזוטופים בטבע 15. 3. 13C 5-גלוטמין מעקב איזוטופים יציבים למדידת פעילות SDH 13C 5-גלוטמין יציב מעקב איזוטופים בתאים דבקיםהערה: ניתן לנטר ישירות את פעילות SDH על ידי מדידת ההמרה ההדדית של איזוטופולוגים מסוימים של פומרט וסוקצינאט על 13 C 5-גלוטמין מעקב 7,16,17. מעכב קומפלקס III אנטימיצין משמש כבקרה לשינוי כיווניות הרשת של קומפלקס SDH (איור 4).זרעו בין 250,000 ל-500,000 תאים בצלחת של 6 בארות כדי להשיג מפגש של 75% למחרת. הכינו מלאי של 50 mM 13C 5-גלוטמין (ראו טבלה 1). הכינו אמצעי מעקב המכיל 2 mM 13C 5-גלוטמין (ראו טבלה 1). שנה את המדיום בכל באר למדיום המכיל 2 mM 13C 5-גלוטמין. יש לדגור במשך מספר השעות המתאים כדי להגיע למצב יציב של תיוג התאים המעניינים (ראה הערה בשלב 2.1.3). בודד את המטבוליטים בהתאם לפרוטוקול בשלב 2.2. נתח את הדגימות ב- LC-MS בהתאם לזרימת העבודה המתוארת בשלב 2.3. ניתוח פעילות SDH בהתבסס על דפוסי תיוגהערה: ניתן לנטר את פעילות החמצון של קומפלקס SDH על ידי הערכת היחס בין 13 C 4-fumarate ל- 13 C 4-succinate על 13C5-גלוטמין מעקב. ניתן לנטר את פעילות הפחתת הפומרט של קומפלקס SDH על ידי הערכת היחס בין 13 C 3-succinate ל 13C3-fumarate על 13C5-גלוטמין מעקב.חשב את אחוז הסימון של 13 C 3-fumarate, 13 C 4-fumarate, 13 C3-succinate ו- 13 C4-succinate. לדוגמה, כדי לקבוע את האחוז של 13 C 3-fumarate, לסכם את כל אזורי השיא המשולבים עבור איזוטופולוגים fumarate (fumarate לא מסומן, 13 C 1-fumarate, 13 C2-fumarate, 13 C 3-fumarate, ו 13 C4-fumarate), ולחלק את שטח השיא עבור 13C 3-fumarate על ידי שטח איזוטופולוג כולל. הכפל ב- 100. כדי לחשב את חמצון סוקצינאט, חלק את אחוז 13 C 4-fumarate באחוז 13C4-succinate. כדי לחשב את הפחתת fumarate, לחלק את אחוז 13 C 3-succinate באחוז 13C 3-fumarate. 4. בדיקת פעילות I מורכבת ישירה הערה: DCPIP הוא קולט אלקטרונים מלאכותי; הוא משתנה לצורתו המופחתת בעת קבלת אלקטרונים מיוביקווינול. בבדיקה זו, יוביקינון מופחת ליוביקינול באמצעות חמצון מורכב בתיווך I של NADH ל-NAD+. לפיכך, מדידת התחלופה של DCPIP מחומצן בבדיקה נטולת תאים זו היא פרוקסי לפעילות I מורכבת 7,18. טיהור וכימות המיטוכונדריה מתאיםהערה: ניתן להשתמש בכל פרוטוקול טיהור מיטוכונדריאלי עבור בדיקה זו19.להרחיב את התאים עד 25-100 מיליון תאים מתקבלים. שאפו את המדיום מהכלים, שטפו עם PBS 1x, שאפו את PBS, ונסו לסובב את התאים עם 0.25% טריפסין. להרוות את הטריפסין עם מדיום תרבית, ו pellet את התאים על 1,000 × גרם במשך 5 דקות. שטפו את כדורי התא 2x ב 5 מ”ל של 1x PBS, וחזרו על הצנטריפוגה ב 1,000 × גרם במשך 5 דקות כדי לשטוף את התאים. אחסנו את הכדוריות השטופות במקפיא בטמפרטורה של 20°C עד לטיהור המיטוכונדריה.הערה: אין להקפיא-להפשיר את כדורי התא יותר מפעם אחת. הכינו מאגר בידוד מיטוכונדריה (ראו טבלה 1).הערה: אין להשתמש בריאגנטים המכילים נתרן כגון NaOH להכנת מאגרי בידוד מיטוכונדריה, מכיוון שנתרן מכתים את פוטנציאל קרום המיטוכונדריה20 ומשבש את הומאוסטזיס הסידן המיטוכונדריאלי21. השהה מחדש את כדורי התא ל-10 מיליון תאים לכל 1 מ”ל של מאגר בידוד מיטוכונדריה. לדוגמה, להשהות מחדש 100 מיליון תאים כדוריים ב-10 מ”ל של מאגר בידוד מיטוכונדריה.הערה: הקפד לשבש את גושי התאים מבלי להכניס בועות לתוך המאגר. העבר 2 מ”ל של תרחיף תאים לתוך הומוגנייזר זכוכית מקורר מראש עם נפח עבודה של 3-8 מ”ל התואם למזיק PTFE של Potter-Elvehjem. הומוגנזציה של התאים עם 10-20 שבץ, ניטור התאים תחת מיקרוסקופ כדי לאשר ליזה התא לאורך כל תהליך הומוגניזציה. הגדל את מספר שבץ במידת הצורך כדי להבטיח ליזה תאים יעילה.הערה: אם הומוגניזציה של התאים בשיטה הנ”ל אינה יעילה להנחת התאים, עבור לשיטת ליזה מזרק22. מעבירים 2 מ”ל של התא ליזט לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה על קרח, ולחזור על השלבים לעיל עד השעיית התא כולו הומוגני. הפילו את הגרעינים ואת פסולת התא ב 650 × גרם במשך 10 דקות בצנטריפוגה 4 ° C. העבר את הסופרנאטנט לצינור חדש של 2.0 מ”ל, וחזור על הצנטריפוגה לעיל ב 650 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. העבירו את הסופרנאטנט לצינור חדש של 2.0 מ”ל, ושחררו את המיטוכונדריה הגולמית בטמפרטורה של 7,000 × גרם למשך 10 דקות בצנטריפוגה של 4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את הגלולה ב-1 מ”ל של מאגר בידוד מיטוכונדריה. העבר 50 μL לתוך צינור חדש לכימות חלבון. חזור על שלב הצנטריפוגה לעיל על שני aliquots של הדגימה (מדגם 50 μL ואת הנותר ~ 950 μL). יש להשליך את הסופרנטנט ולאחסן את הכדוריות במקפיא בטמפרטורה של 80°C עד שהן מוכנות לשימוש. הוסף 200 μL של חיץ RIPA לכדוריות מ 50 μL aliquot כדי לחלץ את החלבון, מערבולת במשך 10 דקות, וצנטריפוגה ב 21,000 × גרם כדי לבודד את החלבון. כמת את כמות החלבון ב- aliquot של 50 μL, והשתמש במספר זה כדי לכמת את החלבון הנותר בדגימה של 950 μL. לדוגמה, אם כימות החלבון עבור אליציטוט 50 μL הוא 1 מיקרוגרם/μL, החלבון הכולל בכדורית המיטוכונדריאלית הנותרת הוא 950 מיקרוגרם (1 מיקרוגרם/μL × 950 μL). ביצוע בדיקת פעילות I מורכבתהערה: קו תאי אוסטאוסרקומה 143B שימש לבדיקה זו, אך ניתן להתאים את הפרוטוקול לכל תא בתרבית.יש להשהות מחדש מיטוכונדריה מטוהרים במאגר תרחיף המיטוכונדריה (ראו טבלה 1) לריכוז סופי של 5 מ”ג חלבון/מ”ל. בצעו חמישה מחזורי הקפאה/הפשרה במקפיא של -20°C כדי לחדור למיטוכונדריה. הפוך את מאגר בדיקת הפעילות I המורכב (ראה טבלה 1). יש לערבב 50 מ”ג ממלאי המיטוכונדריה 5 מ”ג/מ”ל עם 90 מיקרוליטר של מאגר פעילות I מורכב. הכינו חמישה משכפלים לא מטופלים וחמישה שכפולים שטופלו ברוטנון (5 מיקרומטר) כדי לשלוט בפעילות I מורכבת. קרא את הספיגה הבסיסית של 600 ננומטר בקורא לוחות המוגדר ל- 37°C. התחל את התגובה על-ידי הוספת NADH לריכוז סופי של 2 מילימול, ועקוב אחר הספיגה (600 ננומטר) במשך שעה אחת, מדידת לפחות כל 2 דקות לאורך כל הדרך. הירידה בספיגה מעידה על ירידה ב-DCPIP באמצעות פעילות I מורכבת.הערה: יש להוסיף את NADH באמצעות פיפטה רב-ערוצית כדי להבטיח שכל הדגימות מופעלות בו-זמנית. 5. בדיקה מבוססת LC-MS למדידת רמות הסופראוקסיד הערה: התכונות הפלואורסצנטיות של MitoSox Red יכולות להשתנות ללא תלות בתגובה שלו עם סופראוקסיד23. בדיקה מבוססת LC-MS זו מודדת ישירות את המוצר מסופראוקסיד המגיב עם MitoSox Red. הבדיקה הבאה שונה מעט משיאו ואחרים 24. 2-הידרוקסי-מיטואתידיום (2-OH MitoE2+) הוא תוצר של תגובת סופראוקסיד (איור 5). קו התאים Caki1 נוצל לבדיקה זו, אך ניתן להתאים את הפרוטוקול לכל תא בתרבית. טיפול בתאים דבקים עם MitoSox Redזרעו בין 250,000 ל-500,000 תאים בצלחת של 6 בארות כדי להשיג מפגש של 75% למחרת. הקפד לזרוע קבוצה של צלחות עבור בדיקת LC-MS וקבוצה כפולה של צלחות עבור נורמליזציה של ספירת תאים. הכינו DMEM מלא המכיל 10% FBS מומת חום ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין בתווך Eagle המותאם של Dulbecco. רענן את המדיום בכל הבארות עבור כל התנאים עם 2 מ”ל של DMEM מלא. הקפד להוסיף תרופות או טיפולים מעניינים בשלב זה. לדגור על התאים באינקובטור תרבית רקמה למשך שעה אחת. הכינו בקרות חיוביות ושליליות. הכינו מלאי של 50 מילימטר של טרט-בוטיל הידרופראוקסיד מדולל ב-PBS ומלאי של 250 מילימטר של N-אצטיל ציסטאין (NAC) מדולל ב-DMSO (ראה טבלה 1).הערה: Tertbutyl hydroperoxide (tBuOOH) הוא זן חמצן תגובתי רב עוצמה שיפעל כבקרה חיובית ויגדיל את כמות 2-OH MitoE2+. NAC הוא נוגד חמצון רב-עוצמה שיפעל כבקרה שלילית וינטרל את ייצור הסופראוקסיד שנגרם על-ידי tBuOOH. הוסף 1 μL של tBuOOH לבארות הבקרה החיוביות ו 1 μL של tBuOOH + 100 μL של NAC לבארות הבקרה השליליות.הערה: שימוש פיפטה P2 (טווח 0.1-2 μL) היא הדרך האופטימלית להעביר 1 μL. דגירה במשך שעה באינקובטור לתרבית רקמות. הכינו מלאי MitoSox Red של 1 mM (ראו טבלה 1), והוסיפו 2 μL של 1 mM MitoSox Red לכל באר כדי להגיע לריכוז סופי של 1 μM. דגרו במשך 30 דקות באינקובטור תרביות רקמות. במהלך הדגירה הסופית, ספרו את אחד הלוחות הכפולים כדי לרכוש את ספירת התאים כדי לנרמל את נתוני LC-MS הסופיים. בידוד המוצר המחומצן Mitosox Red מהתאים הדבקיםקחו דלי של קרח יבש, והניחו איזופרופנול קריר ברמת HPLC על הקרח היבש לפני תחילת הבידוד. מוציאים צלחת אחת בכל פעם, שואפים את המדיום מהבארות, ושוטפים 2x עם 1 מ”ל של 1x PBS. שאפו את כל שאריות ה-PBS מהבארות לפני שתעברו לשלב הבא.הערה: הקפידו להטות את הצלחת בזמן השאיפה ואת הפיפטה כנגד דופן הצלחת כדי למנוע הפרעה לתאים הדבקים. מניחים את הצלחת על קרח יבש, ומוסיפים 800 μL של איזופרופנול באיכות HPLC לכל באר. לדגור על הצלחת לפחות 15 דקות במקפיא של -80 מעלות צלזיוס כדי להקל על ליזה של תאים.הערה: בשלב זה ניתן להוציא את הצלחת הבאה מהאינקובטור ולחזור על שלבים 5.2.1-5.2.4. המשיכו בכך עד שכל הצלחות ידגרו במקפיא של -80°C. מוציאים צלחת אחת בכל פעם מהמקפיא, מגרדים כל באר על קרח יבש באמצעות מרים תאים, ומעבירים את הליזט לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ”ל. שמור את הצינור על קרח יבש עד לשלב הבא. מערבלים את כל הצינורות במשך 10 דקות ב 4 ° C, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 4 ° C במשך 10 דקות במהירות מקסימלית (לפחות 17,000 × גרם). מעבירים את הסופרנאטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ”ל, ומייבשים ברכז ואקום. לאחר התייבשות הליזט, אחסנו את כדוריות המטבוליט בטמפרטורה של -80°C עד שהן מוכנות לשימוש ב-LC-MS. מדידת LC-MS של MitoSox Red ו-2-hydroxy-mitoethidium (2-OH MitoE2+)הכינו את הדגימות עבור LCMS על קרח על ידי הוספת 100 μL של תערובת 3:3:1 של MeOH:chloroform:water. מערבולת במשך 10 דקות ב 4 °C. העבר 25 μL לכל בקבוקון LC-MS. אחסנו את הדגימה הנותרת במקפיא בטמפרטורה של -80°C. הכינו את מאגרי הכרומטוגרפיה הנוזלית הבאים: i) חיץ A: מים בדרגת HPLC עם 0.1% חומצה פורמית; ii) חיץ B: אצטוניטריל בדרגת HPLC עם 0.1% חומצה פורמית. פתח את היישום Thermo XCalibur Instrument Setup כדי להתחיל לפתח את השיטה. חפש שתי תיבות בסרגל הצד השמאלי של חלון זה – התיבה הראשונה מאפשרת פיתוח שיטת כרומטוגרפיה, והתיבה השנייה מאפשרת פיתוח שיטת ספקטרומטריית מסות. פיתוח שיטת כרומטוגרפיה נוזלית:קבעו קצב זרימה של 0.25 מ”ל/דקה, והתחילו את השיטה ב-20% B, תוך עלייה ל-95% B במשך 12 דקות. במהלך הדקה הבאה, הורידו את מאגר B בחזרה ל-20% B, ושמרו על רמה זו במשך 2 הדקות הבאות.הערה: 2 הדקות האחרונות של זרימה ב- 20% B הן קריטיות כדי שלחץ העמודה יירד חזרה ללחץ ההתחלתי ויאזן את העמודה עם יחסי המאגר המתאימים. אי הכללת שלב שיווי משקל זה תגרום לשינוי זמני השמירה עבור כל הדגימות המופעלות לאחר מכן. צור קובץ Tune עם הפרמטרים הבאים:פתחו את האפליקציה Tune וצרו קובץ כוונון חדש. החל הגדרות חופפות ממודול הגדרת השיטה (ראה שלב 5.3.9.3) גם על קובץ כוונון זה, כולל טווח הסריקה, הרזולוציה, הקוטביות, יעד AGC וה – IT המרבי. הגדר את גז הנדן ל- 30, את גז ה- Aux ל- 3, ואת גז ה- Sweep ל- 3 גם כן. הגדר את מתח ההתזה ל- 3 kV, את הטמפרטורה הנימי ל- 300 ואת רמת ה- RF של עדשת S ל- 60. פיתוח שיטת ספקטרומטריית מסות:מהרשימה השמאלית התחתונה של סריקות פוטנציאליות, גרור ושחרר MS מלא למרכז החלון. הקפד ללחוץ על ריבוע MS מלא לאחר השחרור כדי להתאים את ההגדרות. משך שיטת MS הכולל הוא 13 דקות.הערה: שיטת LC ארוכה יותר משיטת MS מכיוון ששתי הדקות האחרונות מיועדות למיזוג מחדש של עמודות ולא לכימות מטבוליטים. בצד השמאלי של המודול, תחת מאפיינים של השיטה, ודא שמשך השיטה וזמן ההפעלה מוגדרים ל- 13.00 דקות. הפעל סריקה מלאה זו במצב חיובי ברזולוציה של 70,000 ויעד AGC של 1 × 106. הגדר את ה-IT המרבי ל-100 אלפיות השנייה ואת טווח הסריקה מ-300 מ”ש ל-700 מ”ש. תחת Tune Files בחלק העליון של המודול, שים לב שקובץ הכוונון שנוצר זה עתה מקושר לשיטה זו. הפעל את השיטה לזיהוי MitoSox Red עם 2 זריקות דגימה μL.