İn vitro Model Olarak Tüm Yenidoğan Koklear Eksplantları
Summary
Mevcut protokol, önceki protokolleri güncellemekte ve yüksek kaliteli koklear eksplantların kültürlenmesi için nispeten basit yaklaşımlar içermektedir. Bu, canlı ve sabit hücrelerde güvenilir veri toplama ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar. Bu protokol, iç kulak hücrelerini incelemeye yönelik devam eden eğilimi desteklemektedir.
Abstract
Tedavi edilmeyen işitme kaybı, küresel sağlık sistemine önemli maliyetler getirmekte ve bireylerin yaşam kalitesini bozmaktadır. Sensörinöral işitme kaybı, kokleadaki duyusal tüy hücrelerinin ve işitme sinirlerinin kümülatif ve geri dönüşümsüz kaybı ile karakterizedir. Tüm ve hayati koklear eksplantlar, tüylü hücre kaybını tespit etmek ve iç kulak hücrelerinin moleküler mekanizmalarını karakterize etmek için işitme araştırmalarında temel araçlardan biridir. Yıllar önce, yenidoğan koklear izolasyonu için bir protokol geliştirildi ve zaman içinde değiştirilmiş olmasına rağmen, hala iyileştirme potansiyeline sahiptir.
Bu makale, kokleanın tüm uzunluğu boyunca tüy hücrelerinin ve spiral ganglion nöron hücrelerinin incelenmesini sağlayan çok kuyulu kültür odalarında tüm neonatal koklear eksplantların izole edilmesi ve kültürlenmesi için optimize edilmiş bir protokol sunmaktadır. Protokol, farelerden ve sıçanlardan alınan koklear eksplantlar kullanılarak test edildi. Tüy hücreleri, spiral ganglion nöron hücreleri ve çevresindeki destek hücreler arasındaki etkileşimi incelemek için sağlıklı koklear eksplantlar elde edildi.
Bu yöntemin temel avantajlarından biri, eksplantların kalitesinden ödün vermeden organ kültürü adımlarını basitleştirmesidir. Corti organının üç dönüşü de odanın dibine tutturulmuştur, bu da in vitro deneyleri ve eksplantların kapsamlı analizini kolaylaştırır. Canlı ve sabit eksplantlarla yapılan farklı deneylerden elde edilen koklear görüntülerin bazı örneklerini sunuyoruz ve eksplantların ototoksik ilaçlara maruz kalmasına rağmen yapılarını koruduğunu gösteriyoruz. Bu optimize edilmiş protokol, memeli kokleasının bütünleştirici analizi için yaygın olarak kullanılabilir.
Introduction
Sensörinöral işitme kaybı vakalarının çoğu, duyusal tüy hücrelerinin, işitsel sinir hücrelerinin ve/veya işitsel sinapsların dejenerasyonundan kaynaklanır1. Duyu hücrelerindeki bu dejeneratif süreç ilerleyicidir ve genellikle geri döndürülemez, bu nedenle işitme kaybına neden olur2. Bu nedenle, duyusal hücrelerin canlılığı ve stres koşulları altında sinyal yollarındaki değişiklikler hakkındaki bilgiler, hücreleri hasardan ve dolayısıyla kayıptan korumak için çok önemlidir. Kültürde koklear eksplantların araştırılması, doku kompleksinin rekapitülasyonuna ve normal bir hücre-hücre ağının korunmasına izin verir, bu da sinyalleme süreçlerinin daha iyi tanımlanmasını sağlar. Deneysel ototoksisite modelleri oluşturmak için, antibiyotik gentamisin ve kemoterapötik ajan sisplatin sıklıkla kullanılmıştır, çünkü ototoksik yan etkileri olduğu bilinmektedir3.
Koklear eksplantların in vitro kültür sistemleri zaman içinde geliştirilmiş ve modifiye edilmiştir; Bununla birlikte, tüm koklear eksplantların kültürü için aşamalı protokolün bir açıklaması genellikle bazı yayınlarda eksiktir. Corti’nin murin organının birincil kültürü için ilk video protokollerinden biri, yazarların duyusal epitelin izolasyonu, cam lameller üzerinde kültürleme ve transfeksiyon deneyleri için eksplantların elektroporasyonu için adımları tanımladığıParker ve ark. tarafından yayınlandı 4. İç kulaktaki hücresel yapının organizasyonunun kabul edildiği cam lamellerin kullanıldığı başka bir protokol de daha önce yayınlanmıştı5. Corti organı ve vestibüler organın fare eksplantlarının kültürü için Millicell membranı kullanan alternatif bir protokol bildirilmiştir6. Bu video raporları, yöntemin geliştirilmesine katkıda bulunmuştur, ancak hala çözülmesi gereken zorluklar vardır. Cam lamellerin ve eklerin kullanımından kaynaklanan bir dizi sorunu ele almak için mevcut protokol, organ kültürü adımlarını kolaylaştırmayı ve güvenilir veriler için yüksek kaliteli organları kültürlemeyi amaçlamaktadır. Bu, deneysel prosedürler sırasında organın doğrudan elleçlenmesini en aza indirerek ve canlı ve sabit hücrelerin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etmeden önce organ transferinden kaçınarak elde edilir.
Mevcut protokol, daha önce yayınlanmış in vitro kültür sistemlerini güncellemekte ve Corti organının izolasyonunda ve kültür odalarına transferde çeşitli optimizasyonların yanı sıra kültür koşullarını ve daha fazla analizi iyileştirmek için yeni bir slayt odasının entegrasyonunu sunmaktadır. Bu optimize edilmiş protokol, ortam değişimi sırasında cam lameller kullanıldığında veya organın daha ileri analiz için lamellerden veya membranlardan transferi sırasında ortaya çıkabilecek organa zarar verme riskini azaltır 4,5,6. Cam lameller, plastik olanlardan daha iyi bir yansıtıcı indekse sahiptir; Ancak kırılgandırlar ve daha kolay kırılabilirler. Burada kullanılan çok kuyulu odalar, organ kültürü ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme için çok uygun olan bir mikroskop lamına tutturulmuştur. İzole edilen organların transferi, daha önce önerildiği gibi pipetle kuvvet uygulamak yerine, organın doğru yöne getirilmesini ve hazneye kaydırılmasını sağlayan bir spatula ile gerçekleştirilir 4,5,6.
Yeterli ortam içermesi gereken poli-D-lizin kaplı çok kuyulu odalar, daha önce belirtildiği gibi, yapışkan basınç uygulamadan ve organ üst üste binmesini önlerken, organ transferini ve eksplantların uygun şekilde konumlandırılmasını kolaylaştırır6. Ek olarak, kazara organ örtüşmesi ve düzensiz yapılar, konfokal bir Z-yığını kullanılarak çözülür. Bu protokol, fare ve sıçan eksplantları, Corti ve koklea organının eksplantları, serum içeren ve serumsuz ortamda kültür, ototoksik değerlendirmeler ve genel ilaç yanıtı deneyleri gibi çeşitli uygulamalar için optimize edilmiştir. Koklear eksplantlar, in vitro deneyler sırasında optimum kullanım için koklear eksplantların odacıklara yapışmasını kolaylaştıran, canlı ve sabit koklear eksplantların görüntülenmesi için lamel tabanlı kabinlere monte edilir ve inkübe edilir. Corti organının tüm uzunluğunun görselleştirilmesi ve saç hücrelerinin miktarının belirlenmesi kolaylaştırılmıştır. Ek olarak, destekleyici hücrelerin, spiral ganglion nöron hücrelerinin ve nöritlerin değerlendirmeleri doğrudur. Bu nedenle, bu protokol memeli koklear hücrelerinin kapsamlı bir analizi için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolün güncellenmesinin amacı, eksplantların izolasyonundan canlı ve sabit koklear hücrelerin görüntülenmesine kadar olan adımları kolaylaştırmaktı. İzolasyon sırasında bazı adımları iyileştirdik ve yüksek kaliteli eksplantlar elde etmek için verimli ve sorunsuz çalışan bir protokol oluşturmak amacıyla bazı yenilikçi araçlar sunduk. Açıklanan yöntem, önceki raporlardanoptimize edilmiş bir protokoldür 4,5. Ek olarak, bazı güncel çalışmalar kademeli olarak güncellenmiş bir protokolden yoksundur. Basitleştirilmiş eksplant kültürü adımları ile bu protokol, tekrarlanabilir veriler için gerekli olan iyi korunmuş eksplantların kolay işlenmesini sağlar. İç kulak eksplantları için polimer lamel ile çok kuyucuklu odaların eklenmesi, organ bağlanmasını ve bozulmamış eksplantların korunmasını iyileştirir. Burada, kültürdeki organların saç hücrelerinin kaybına ve nöritlerin zarar görmesine rağmen hücresel organizasyonlarını koruduğunu göstermek için stres koşulları altında birkaç deney örneği sunuyoruz.
İç kulak organlarının kültürlenmesindeki zorluklardan biri, eksplantların bütünlüğünü, tedaviye yanıtı ve sonraki muayeneleri etkilediği için organların ayrılmasını ve yüzmesini önlemektir. Daha önce, eksplantlar cam lameller 4,5 üzerinde kültürleniyordu. Cam yüzeylerde kültür iyi bir alternatif gibi görünse de, camın kaplanması zaman alıcıdır ve lamellerin kendileri kırılgan ve hassastır. Millicell hücre kültürü eklerini kullanan alternatif bir protokol bu sorunu çözmeye çalışır6. Bununla birlikte, membranın eksplantlarla kesilmesi ve aktarılması bu protokolde hassas bir adım gibi görünmektedir. Ek olarak, lamellerin montajı ve sızdırmazlığı sırasında eksplantlar zarar görebilir. Önerdiğimiz yaklaşımda, eksplantlar poli-D-lizin kaplı odalara aktarıldıktan ve doğru konuma yerleştirildikten sonra, başka bir transfer veya lamel ile kaplama gerekmez. Bu protokolün bir diğer avantajı, organ eksplantları için en uygun kültür koşullarını sağlayan ince bir gaz geçirgen polimer lamel içeren odaların kullanılmasıdır. Bu polimer, cama benzer bir optik kaliteye sahiptir, bu nedenle yüksek çözünürlüklü mikroskopide hücre görüntüleme için uygun hale getirir.
Ortama serum ilavesi, %1-10 FBS 4,5,6,16 ile iç kulak eksplantlarının kültürü de dahil olmak üzere hücre ve doku kültürü için çoğu protokolde kullanılır. Serumun varlığı, deneylerin kültür koşullarını etkiler; Bu nedenle, bazı durumlarda, serumsuz kültür tercih edilir. Koklear eksplantların kültüründe serum yokluğu, ya DMEM’e N2 ilavesi ya da Neurobazal-A besiyerineN2 ilavesi ile değiştirildi 5,6. Bu bağlamda, eksplantların kültür koşullarını serumlu ve serumsuz olarak test ettik. Her iki koşulda da, iç kulak hücreleri hayati önem taşıyordu ve ototoksik koşullara yanıt veriyordu. Bu koşulları 72 saat boyunca test ettik, ancak eksplantlar, diğer çalışmalarda önerildiği gibi, özellikle N2, B27 ve büyüme faktörleri ile birlikte serumsuz ortamla inkübe edildiğinde kültürde daha da uzun süre korunabilir 5,16.
İç kulak eksplantlarının izolasyonunda organ izolasyonunun süresi ve kullanılan antibiyotik gibi genel kritik adımlara ek olarak, bu protokolde yönetilebilir bazı kritik adımlar da vardır. Bu yöntemdeki kritik adımlardan biri, organ yerleştirildikten sonra haznede kalan ortamın hacmi ile ilgilidir. Bu, eksplantları canlı tutmak ve alt yüzeye bağlı tutmak için optimize edilmiştir. Diğer bir kritik adım, eksplantların odanın dibine yapışmasına izin vermek için gereken inkübasyon süresi ile ilgilidir. Birkaç mikrolitre ortam ile 2 saatten daha uzun inkübasyon süreleri, eksplantların sağlığını etkileyebilir. Eksplantların ayrılmamasına özen gösterildiği sürece 1 saat gibi daha kısa inkübasyon süreleri de kullanılabilir. Bir diğer önemli husus, poli-D-lizin kalıntılarıdır. Poli-D-lizinin yıkama adımları kesinlikle takip edilmelidir, çünkü poli-D-lizinin bromür tuzunun kalıntıları hücreler için toksik olabilir. Yıkama adımları tam olarak takip edildikten sonra, poli-D-lizin ile kaplama, eksplantların haznelere düzgün yapışmasını kolaylaştırır, böylece haznenin tabanına sıkıca bağlanmadan önce pozisyon düzeltilebilir.
Bu yöntemin sınırlamalarından biri, dik mikroskopi kullanılarak hücrelerin görüntülenmesidir. Bu, ters mikroskoplu laboratuvarlar için önemli bir sorun olabilir. Dik ve ters mikroskopi için çıkarılabilir silikon hazneli cam slaytlar kullanılabilir; bununla birlikte, önce poli-D-lizin ile kaplama koşullarımızın test edilmesi gerekir. Diğer bir sınırlama, odaların depolanmasıdır, çünkü ekler çıkarılabilir değildir ve kapaklı bir bölmenin toplam yüksekliği, standart bir mikroskop lamının 1 mm yüksekliğine kıyasla yaklaşık 11 mm’dir. Bununla birlikte, 8 oyuklu oda,16’dan önce önerilen 4 oyuklu plakalardan daha az yer kaplar.
Burada iki mikroskopla elde edilen görüntüleri sunuyoruz. Nokta taramalı konfokal mikroskop, ince optik kesiti sayesinde dokuların yüksek çözünürlüklü görüntülerini sağlarken, dönen disk konfokal mikroskobu, iyi çözünürlükle daha hızlı görüntüleme süresi sağlar. İç saç hücrelerinin (IHC’ler) ve dış saç hücrelerinin (OHC’ler) stereosilileri konfokal mikroskopi kullanılarak görselleştirilir. IHC’lerin stereosiliaları OHC’lerinkinden daha büyük olduğundan, bu çalışmada tekrar tekrar ve iyi görselleştirildiler. OHC stereosilia için, süper çözünürlüklü mikroskopi (SRM) gibi diğer alternatif mikroskoplar görselleştirmeyi iyileştirebilir. Dönen disk mikroskobu ile elde edilen eksplant görüntüleri, derin öğrenme yaklaşımı12 kullanılarak otomatik saç hücresi sayımının kolay entegrasyonu için yeterlidir. Ayrıca, kısa edinme süresi, canlı hücreler ve dokularla yapılan deneyler için önemlidir. Ayrıca bu protokol neonatal koklear eksplantlarla sınırlı değildir. Bazı optimizasyonlarla, vestibüler organlar veya embriyonik dokular gibi diğer eksplantlar da kültürlenebilir.
Tüy hücreleri ve nöronlar gibi koklear hücrelerin in vitro olarak ölçülmesi, hücre canlılığını ve dolayısıyla hasarlı veya kayıp hücrelerin yüzdesini değerlendirmek için önemlidir. Sinyal yolaklarının ve hücre fonksiyonlarının araştırılması, ölüm ve hayatta kalma mekanizmalarının ortaya çıkarılmasına yardımcı olur. Embriyonik ve neonatal koklear dokuların incelenmesi, kokleanın gelişim evrelerinin araştırılmasında yararlıdır. Bu nedenle, bu protokol, örneğin ototoksik modeller oluşturmak, gelişim aşamalarını araştırmak, sinyal yollarını değerlendirmek ve ilaç tarama çalışmaları yapmak için iç kulak eksplantlarının in vitro çalışmalarını optimize etmeye yardımcı olacaktır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Basel Üniversitesi Biyotıp Bölümü Hayvan Tesisi’ne hayvan bakımındaki destekleri için, Mikroskopi Çekirdek Tesisleri’ne ve Biyotıp Bölümü Bilgi Teknolojileri Servisi’ne teknik yardımları için ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı’na (SNSF) mali destek için teşekkür ederiz (MD-PhD bursu. Hibe numarası 323530_191222).
Materials
| 15 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube 17 x 120 mm style | FALCON | 352096 | |
| 45° Angled Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm style | FALCON | 352070 | |
| Antifade Mounting Medium | VECTASHIELD | H-1000 | |
| Alexa Fluor 568 phalloidin | Thermofisher | 2151755 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody [TUJ-1] | Abcam | ab14545 | |
| Antifade Mounting Medium With DAPI | VECTASHIELD | H-1200 | |
| Anti-myosin VII rabbit polyclonal | Abcam | ab3481 | |
| B-27 Supplement (50x), minus antioxidants | Thermofisher | 10889038 | |
| CARBON STEEL surgical blades 23 | Swann Moiton | 210 | |
| CellEvent™ Caspase-3/7 Green Detection Reagent | Thermofisher | C10723 | |
| DMEM/F-12/(1:1)(1x) + GlutaMAX | Thermofisher | 31331028 | |
| Double spatulas, one curved end | VWR | RSGA038.150 | |
| Ethyl alcohol 70% V/V 1,000 mL | bichsel | 160 0 106 00 | |
| Fetal Bovine Serum, certified | Thermofisher | 16000036 | |
| Fixative Solution 4% paraformaldehyde prepared in PBS | Thermofisher | 201255309/201255305 | |
| High Intensity Cold Halogen Light Source | Intralux® | 5100 | |
| Huygens Professional version 21.10 | Scientific Volume Imaging | ||
| ibidi µ-Slide 8 well | ibidi | 80826 | |
| microscope | LEICA | M80 | |
| microscope | LEICA | MS5 | |
| MitoSOX™ Red Mitochondrial Superoxide Indicator, for live-cell imaging | Thermofisher | M36008 | |
| N2 supplement (100x) | Thermofisher | 17502048 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope with a Yokogawa CSU-W1 spinning disk confocal unit, and a Photometrics Prime 95B camera. | NIKON | ||
| Nikon Eclipse Ti microscope with an A1 point-scanning confocal unit | NIKON | ||
| Operating scissors | Fine Science Tools | 14005-16 | |
| Operating scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Operating tweezers | Fine Science Tools | 11008-15 | |
| PBS pH 7.2 (1x), 500mL | Thermofisher | 20012-019 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| POLY-D-LYSINE HYDROBROMIDE MOL WT GT 30 | Sigma-Aldrich | P7405 | |
| Scalpel Handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Steri 250 Second sterilizer | Simon Keller AG | 031100 | |
| Sterilizer, desiccant pellets | Simon Keller AG | 31120 | |
| Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353802 | |
| Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353004 | |
| Trito X-100 | Sigma | T9284 | |
| Unconventional myosin-VIIa | Developmental Studies Hybridoma Bank | 138-1s | |
| WFI for Cell Culture[-]Antimicrobial, 500 mL | Thermofisher | A12873-01 |
References
- Mukherjea, D., et al. The design and screening of drugs to prevent acquired sensorineural hearing loss. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (5), 491-505 (2011).
- Takeda, H., Dondzillo, A., Randall, J. A., Gubbels, S. P. Challenges in cell-based therapies for the treatment of hearing loss. Trends in Neurosciences. 41 (11), 823-837 (2018).
- Schacht, J., Talaska, A. E., Rybak, L. P. Cisplatin and aminoglycoside antibiotics: Hearing loss and its prevention. The Anatomical Record. 295 (11), 1837-1850 (2012).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. Journal of Visualized Experiments. (36), e1685 (2010).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Durbin, J. E., Hackenmiller, R., Simon, M. C., Levy, D. E. Targeted disruption of the mouse Stat1 gene results in compromised innate immunity to viral disease. Cell. 84 (3), 443-450 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Etournay, R., et al. Cochlear outer hair cells undergo an apical circumference remodeling constrained by the hair bundle shape. Development. 137 (8), 1373-1383 (2010).
- MacDonald, G. H., Rubel, E. W. Three-dimensional imaging of the intact mouse cochlea by fluorescent laser scanning confocal microscopy. Hearing Research. 243 (1-2), 1-10 (2008).
- Sibarita, J. B. Deconvolution microscopy. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 201-243 (2005).
- Cortada, M., Sauteur, L., Lanz, M., Levano, S., Bodmer, D. A deep learning approach to quantify auditory hair cells. Hearing Research. 409, 108317 (2021).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Ershov, D., et al. TrackMate 7: Integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nature Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
- Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: A generalist algorithm for cellular segmentation. Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
- Zhang, L. W., Cang, X. H., Chen, Y., Guan, M. X. In vitro culture of mammalian inner ear hair cells. Journal of Zhejiang University of Science B. 20 (2), 170-179 (2019).
