整个新生儿耳蜗外植体作为 体外 模型

所有动物程序均按照瑞士巴塞尔市动物福利委员会的指导方针和规定进行。实验采用出生后C57BL/6JR小鼠、Wistar大鼠和STAT1缺陷小鼠（混合C57BL/6-129/SvEv）7 ，年龄为3-5天，男女不限。 1. 涂覆多孔室 准备完整的培养基。对于Corti外植体的器官，制备含有Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），10%胎牛血清（FBS），25mM HEPES和30U / mL青霉素的培养基。 对于Corti外植体和耳蜗外植体的器官，制备含有DMEM / F12,1x N 2添加剂，1x B27减去抗氧化剂和30 U / mL青霉素的培养基。 通过在层流罩中将 10 mL 细胞培养水加入 5 mg 聚-D-赖氨酸中来制备聚-D-赖氨酸储备溶液。聚-D-赖氨酸的最终浓度为 0.5 mg/mL。注：将剩余的储备溶液分装，并储存在-20°C。通过在无菌水中以1：10稀释储备溶液来制备聚-D-赖氨酸的工作溶液。 用 150 μL/孔的聚-D-赖氨酸工作溶液涂覆 8 孔室，并在室温下孵育 30 分钟。注：如果使用 4 孔室，则涂有 300 μL/孔的聚-D-赖氨酸工作溶液。 通过真空或移液吸出溶液。 用 200 μL 无菌水洗涤 2 次，用 200 μL 完全培养基或 DMEM 洗涤一次。 向每个孔中加入 150 μL 完全培养基。注：如果使用 4 孔室，则加入 250 μL/孔的完全培养基。 在放置外植体之前，将腔室置于37°C和5%CO2 的培养箱中至少30分钟。 2.颞骨解剖 用70%乙醇对手术台进行消毒，并在玻璃微球灭菌器中对所有器械进行灭菌。 将无菌的60毫米培养皿放在装有冰的桶上。 倒入几毫升 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS），并将其放在冰上。注：在1x PBS中使用30 U / mL青霉素以避免细菌污染。 将无菌垫放在无菌托盘上，然后用手术剪刀快速将幼犬斩首。如果污染是频繁发生的事件，则将头部浸入 70% 乙醇中 5 秒。注：该协议针对P3-P5岁的小鼠和大鼠进行了测试。耳蜗组织更难从老年小鼠和大鼠身上解剖，并且外植体在培养物中的存活率有限。 将动物头放在无菌垫上。移除下颌骨。提起皮肤并将其从头骨上剥开。 通过将镊子放入眼眶腔中来握住头骨。 沿着矢状缝合线小心地切开颅骨，然后用锋利的手术刀刀片在冠状缝合区域切开，而不会损坏耳蜗。注意： 避免施加太大的压力，并避免使用手术刀向前和向后移动，因为这可能会损坏耳蜗骨，从而损坏耳蜗管。 小心地从两个头骨半部取出大脑。 将头骨两半转移到60毫米培养皿中，加入步骤2.3中制备的冰冷PBS。 3.耳蜗的隔离 在显微镜下定位颞骨中的耳蜗。将镊子放在上半规管中。 使用胰岛素注射器（小鼠）或镊子（大鼠）松开耳蜗和颞骨之间的周围组织。 小心地将颞骨从耳蜗上拉开，使耳蜗与颞骨一起连接到前庭。在将颞骨推到一边之前，确保耳蜗没有周围组织。注意： 用力过大会损坏耳蜗管。 将耳蜗固定在固定位置，用另一只手小心地取出软骨耳蜗囊。小心地将镊子的尖端插入顶点区域或转弯之间（可见为白线），然后逐块取出胶囊。暴露耳蜗导管。 小心地将镊子放在耳蜗下，并将其与前庭器官和颞骨分离。 将耳蜗转移到含有冰冷PBS的新60毫米培养皿中。 调整显微镜的放大倍率以更好地观察外植体。 按照Corti外植体器官的后续步骤：用镊子将器官固定在底部。用镊子在基钩区域抓住耳蜗管，轻轻地取出耳蜗管。 将耳蜗导管从耳蜗上松开，不要撕裂它。 小心地去除带有血管纹的螺旋韧带，将器官固定在底部并将它们拉开。注意：也可以通过保持顶点区域而不是基部区域来实现组织分离。这在解剖大鼠器官或较老的小鼠幼崽（>P5）时可能会有所帮助。 将器官固定在底部并将其逐块拉下，小心地去除 Reissner 膜。注意：这是一个可选步骤，因为 Reissner 膜不会干扰成像的采集。 按照耳蜗外植体的后续步骤操作：使用胰岛素注射器（小鼠）或镊子（大鼠）将螺旋神经节从骨螺旋层上分离。 在分离过程中轻轻松开modiolus。注意：外植体可以分成两部分，以便更好地处理。 用镊子抓住钩子区域。 小心地将其拉下，将其与血管纹一起去除。 将器官固定在底部并将其逐块拉下，小心地去除 Reissner 膜。注意：建议此步骤，因为Reissner膜通常会折叠并覆盖神经元细丝，因此可能会影响实验。 4. 耳蜗外植体培养 将外植体从培养皿转移到多孔室。使用实验室刮刀将外植体抬起，毛细胞朝上。包括几微升的 1x PBS，以防止样品粘在刮刀上。注意：严重受损的外植体会粘在刮刀上。 通过在培养基中轻轻挥动刮刀，让外植体从刮刀滑入腔室。在8孔室载玻片的每孔中放置一个外植体。注意： 如果外植体粘在刮刀上，请将刮刀放在培养基中，然后使用镊子分离外植体。始终将镊子放在外植体的内缘（远离毛细胞）。 在显微镜下检查外植体是否以正确的方向转移并放置在孔的中心。注意：毛细胞朝下的定向不正确的外植体往往会沿其宽度向上显示 U 形。通过将外植体移动到腔室的角落（有更多的培养基可用）并引导它们旋转来纠正它们的方向。 使用 100 μL 移液管取出 80 μL 培养基，并将其丢弃。 在显微镜下检查毛细胞和螺旋神经节神经元细胞是否可见。如有必要，使用镊子轻轻推开一些重叠的组织。 取出剩余的培养基，等待~10秒。 将培养基移回。在外植体旁边添加一滴或两滴培养基，并在距离外植体一定距离处添加其余培养基，以防止外植体分离。注意：即使外植体附着在腔室上，也应始终首先通过在外植体旁边移液一到两滴来添加培养基。这样，当添加剩余的完整培养基时，外植体不会被抬起。 将腔室放回培养箱中，孵育2小时，使器官牢固地附着在腔室底部。 取出培养基，并使用 100 μL 或 200 μL 移液管小心加入 300 μL 新鲜预热的完全培养基。不要使用 1 mL 移液器。注：如果需要预处理，在附着 2 小时后，加入 300 μL 含有目标物质的完全培养基。如果使用 4 孔室，则最多使用 500 μL/孔。 将腔室放回培养箱。 5. 耳毒性药物的测试 将外植体放置过夜以适应培养条件并恢复。 准备不同浓度的耳毒性药物，以找到合适的浓度，以建立约50%毛细胞损失的耳毒性模型。庆大霉素使用50μM至250μM，顺铂使用40μM至320μM。新鲜制备顺铂溶液，并避光保存。 取出培养基，小心地加入 300 μL 含有所需耳毒性药物的培养基。 将外植体与庆大霉素和顺铂在37°C孵育24小时至48小时，以确定毛细胞存活。注意：药物浓度和暴露时间是根据研究目的选择的。外植体的保存在这里测试长达72小时。如果计划进行长期培养，请勿使用血清。 按照下一节对耳蜗细胞进行染色。 6. 固定和免疫荧光 在实验结束时弃去培养基，并立即用200μL预热的1x PBS洗涤外植体。 用 200 μL 4% 多聚甲醛 （PFA） 在化学通风橱下固定外植体 15 分钟。注意：PFA 是一种危险化学品;在首次使用 PFA 之前，请阅读材料安全数据表 （MSDS）。 用200μL的1x PBS洗涤外植体两次。将外植体储存在4°C的1x PBS中，以防染色程序需要推迟。 制备由1x PBS和1%-5%Triton-X100组成的透化溶液。 弃去1x PBS，加入200μL透化溶液，并将外植体孵育15分钟。 准备封闭液。对于Corti外植体的器官，制备由1x PBS，10%正常山羊血清（NGS，用于山羊二抗，或来自与二抗相同物种的另一种血清）组成的封闭溶液。或者，如果细胞仅用鬼笔环肽染色，则使用 1%-5% 牛血清白蛋白 （BSA）。 对于耳蜗外植体，如果使用小鼠一抗（例如，小鼠抗TuJ1）染色螺旋神经节细胞，则制备由1x PBS，10%NGS和Fab片段（Fab片段山羊抗小鼠IgG H + L，稀释度1：200）组成的封闭溶液。 加入200μL封闭溶液，将外植体孵育1小时。 丢弃封闭溶液。对于与Fab片段一起孵育的外植体，加入200μL的4%PFA，并孵育5分钟。 用1x PBS洗涤外植体5分钟。 制备由 1x PBS、5% NGS 和 0.1%-0.25% Triton-X100 组成的抗体溶液。 稀释抗体溶液中的一抗 MYO7A（ab3481 以 1：500 的稀释度或 MYO7A 138-1 以 1：100 的稀释度）标记毛细胞，稀释 TuJ1 （1：400） 标记螺旋神经节神经元。注意：如果毛细胞仅用鬼笔环肽标记，则在1x PBS中以1：150稀释鬼笔环肽，在室温下孵育40分钟至1小时，然后继续执行步骤6.22。 通过省略一抗，包括二抗非特异性结合的对照。 将170μL抗体溶液与一抗一起加入相应的孔中，并在4°C下轻轻摇动（40-60rpm）孵育过夜。 用1x PBS洗涤外植体4次，每次5分钟。 稀释抗体溶液中的二抗（例如，山羊抗兔 Alexa Fluor 488 或山羊抗小鼠 Alexa Fluor 568 IgG，稀释度为 1：500）。 加入170μL抗体溶液和二抗，并在室温下孵育1小时。注意：从这一步开始，保护外植体免受长时间的光照。 用1x PBS洗涤外植体2次，每次5分钟。 继续进行下一步，对外植体进行连续双标记。与目标的第二一抗（例如，用于毛细胞的MYO7A）在4°C下轻轻摇动（40-60rpm）孵育过夜。或者，在室温下与鬼笔环肽（1：150）孵育40分钟至1小时，然后继续执行步骤6.22。注意：如果一抗来自同一宿主物种，则进行顺序标记。最后进行鬼笔环肽标记以进行多重免疫荧光。 用1x PBS洗涤外植体4次，每次5分钟。 稀释抗体溶液中的二抗（例如，山羊抗兔 Alexa Fluor 488 或山羊抗小鼠 Alexa Fluor 568 IgG，稀释度为 1：500）。 加入 170 μL 二抗，并在室温下孵育 1 小时。 用1x PBS洗涤外植体2次，每次5分钟。 制备1mg / mL的DAPI储备溶液，并储存在-20°C。 以1：10稀释DAPI储备溶液以制备0.1mg / mL的工作溶液，并储存在4°C。注意： 如果使用含有 DAPI 的安装介质，请跳过步骤 23 并转到步骤 26。 在1x PBS中以1：100稀释DAPI工作溶液，并将外植体与200μLDAPI溶液孵育5分钟。 用1x PBS洗涤外植体2次，每次5分钟。 尽可能多地取出1x PBS，使腔室底部干燥。不要让外植体干燥。 等待 2-5 秒，将一滴封固剂直接添加到外植体上。注意： 由于表面张力，外植体上的安装介质将保持在原位。可以使用硬化安装介质。 将腔室储存在 4°C 直至成像。 7. 外植体活细胞的免疫荧光 孵育过夜后使用分离的外植体。 取出培养基，小心地加入含有 125 μM 顺铂的 300 μL 培养基。 将外植体孵育18小时以测量活外植体中的线粒体超氧化物。 在药物暴露结束时丢弃培养基。 加入 300 μL 渗透性探针以检测细胞 ROS（例如，250 nM 线粒体氢乙胺）和/或 Caspase-3（例如，与核酸结合染料偶联的 2 μM DEVD 肽）。 在37°C孵育30分钟。 用 200 μL 温热的 Hank 平衡盐溶液 （HBSS） 或适当的缓冲液轻轻洗涤外植体两次。 在2小时内用400nm的荧光激发和590nm的发射检测对细胞进行成像。 在实验结束时弃去培养基，并立即用200μL预热的1x PBS洗涤外植体。 固定外植体，并如上所述对耳蜗细胞进行染色。 8. 共聚焦成像可视化 使用配备有转盘共聚焦单元的显微镜或配备点扫描共聚焦单元的共聚焦显微镜对外植体进行成像。 使用带有20倍空气物镜（数值孔径：0.75）的旋转盘获取图像以进行细胞计数。或者，使用带有40倍空气物镜（数值孔径：0.95）或100倍油物镜（数值孔径：1.45）的点扫描共聚焦显微镜获取图像，以可视化和计数突触或对立体纤毛进行成像。注意： 调整每个通道的激光强度和曝光时间，以避免图像饱和度过高和饱和度不足。将相同的设置应用于同一实验的所有外植体。 设置显微镜，使用 20 倍空气物镜、z 轴堆叠和自动拼接工具捕获整个耳蜗外植体的 3D 图像。使用3 x 3相邻的田地，15%重叠的小鼠外植体，4 x 4个相邻的田地将大鼠外植体缝合在一起。 使用显微镜软件或免费的开源FIJI软件调整图像8.注意：反卷积是一种图像处理技术，可以应用于共聚焦图像，以提高其对比度和分辨率 9-11。