פלטפורמת עכבה חשמלית מבוססת תאים להערכת מעכבי נגיף זיקה בזמן אמת

כל השלבים המתוארים מתבצעים בתנאים סטריליים בארון זרימה למינרי של מעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2. כל הנגיפים המשומשים הושגו ושימשו כפי שאושרו, על פי הכללים של ועדת בדיקה מוסדית בלגית (Departement Leefmilieu, Natuur en Energie, protocol SBB 219 2011/0011) וועדת הבטיחות הביולוגית ב- KU Leuven. 1. תחזוקת תרבית תאים הערה: פרוטוקול זה מבוצע עם מבחר קווי תאים, אך ניתן כמובן להתאים אותו לכל קו תאים דבק, הדורש רק אופטימיזציה של צפיפות זריעת תאים. גדל את קו תאי אדנוקרצינומה של הריאה האנושית A549, את קו תאי הגליובלסטומה הממאירים האנושיים U87, ואת תאי פיברובלסט הריאה העוברית האנושית HEL 299 בצלוחיות תרבית T75 בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2 באינקובטור לח. תת-תרבית התאים במפגש של 80%-95%. כל הריאגנטים צריכים להיות בטמפרטורת החדר (RT) לפני תרבית התאים. הסר את מדיום התרבית המותנה מהתאים. השתמש 5 מ”ל של מלח פוספט חוצץ של Dulbecco (DPBS) כדי לשטוף את monolayer התא פעם אחת. יש לפזר 1 מ”ל של 0.25% חומצה טריפסין-אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA) באופן שווה על חד-שכבתי התא. לאחר מכן, לדגור עד 3 דקות ב 37 ° C עד התאים מתחילים להתנתק. הוסף 9 מ”ל של מדיום גידול מלא טרי (ראה טבלת חומרים לפרטים). פיפט בעדינות למעלה ולמטה כדי להשהות מחדש את התאים. העבירו את הנפח הרצוי של תרחיף התאים לבקבוק תרבית T75 חדש והוסיפו נפח מתאים של מדיום גידול טרי לקבלת נפח כולל של 15 מ”ל.הערה: קווי התאים במבחנה המשמשים בפרוטוקול זה מתורבתים בדילול של 1:4 עד 1:10, בהתאם לקו התאים הספציפי, כדי לאפשר תנאי גידול אידיאליים. תת-תרביות מבוצעות כל 3-4 ימים, כך שנפח תרחיף התאים הרצוי יכול להשתנות גם בהתאם למספר ימי הדגירה. 2. הכנת צלחת CEI קחו צלחת של 96 בארות עם אלקטרודות בין-ספרתיות (ראו טבלת חומרים) ומלאו את כל הבארות ב-100 מיקרוליטר של מדיום תרבית גידול. מלא את החללים בין הבארות עם DPBS.הערה: זה נעשה כדי להפחית את אפקט הקצה עקב אידוי שנצפה בעת גידול תאים בלוחות 96 באר. לדגור על הצלחת במשך 4 שעות ב 37 ° C באינקובטור עם 5% CO2. 3. זריעת תאים נתקו את התאים מבקבוק התרבית, כמתואר בסעיף 1, והשעו אותם מחדש במצע גידול טרי בצינור של 50 מ”ל. ספור את מספר התאים בני קיימא באמצעות שיטת הבחירה.הערה: במקרה של תאי A549, הכדאיות מגיעה בדרך כלל ל~100%. כדי לקבוע את מספר התא, אנו משתמשים במערכת אוטומטית לניתוח תאים המבוססת על צביעת תפוז אקרידין/פרופידיום יודיד (ראה טבלת חומרים). שיטות אחרות לספירת תאים פועלות באותה מידה. השהה מחדש את התאים במדיום גידול טרי כדי להשיג את צפיפות התאים הרצויה. במחקר זה, צפיפות התאים האופטימלית של A549 היא 0.15 × 106 תאים (בני קיימא) / מ”ל. קח את צלחת 96 באר עם אלקטרודות interdigitated מתוך האינקובטור ולהסיר את המדיום עם pipet רב ערוצי. הפק 100 μL של השעיית התא (המקביל ל 15 × 103 תאים במקרה זה) לכל באר בצלחת 96 באר. אפשר לתאים להתאזן למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר לפני הכנסתם להתקן CEI. 4. הגדרה והפעלה של בדיקת CEI מקם את האינקובטור המאכלס את מחזיק לוחית המכשיר CEI ב 37 ° C ו 5% CO2. הניחו את צלחת 96 הבארות במכשיר. פתח את תוכנת ההתקן והגדר ניסוי חדש על-ידי לחיצה על הגדרה בחלונית איסוף נתונים. המתן עד שהמחשב הנייד יתחבר להתקן ECIS והגדר את הצלחת על ידי בדיקת עכבות הבארות. בדוק אם כל הבארות מוגדרות כראוי, כפי שמצוין על ידי צבע ירוק. אם לא, חזור על שלב 4.2 עד שכל הבארות יהיו ירוקות. בחלונית Well Configuration, בחר את סוג המערך, בהתאם לתוכנת התרבות המשומשת. בחר מצב תדירות/זמן מרובים.הערה: במצב זה, ההתקן מודד שינויי עכבה במגוון תדרים. התחל את המדידה על-ידי לחיצה על התחל.הערה: ניתן לנטר עכבה בזמן אמת בממשק התוכנה. בחר את התדר הרצוי שיוצג. בדוגמה זו, נבחר 16 קילוהרץ. 5. הכנת תרכובת ודגירה הערה: כדוגמה לתרכובת אנטי-ויראלית, משתמשים ב-labyrinthopeptin A1 (ראו טבלת חומרים). מאחר שניתן להכליל פרוטוקול זה לכל התרכובות בעלות הפעילות האנטי-ויראלית הפוטנציאלית, אנו מכנים אותו “התרכובת”. אפשר מדיום תרבית תאים שלם ללא תוספת של סרום בקר עוברי (FBS) (המכונה ‘חיץ בדיקה’) כדי לאזן ב- RT. שמרו את התרכובות על קרח. הכינו דילול מרוכז פי 10 של כל תרכובת במדיום בדיקה בצינורות פוליפרופילן 5 מ”ל. לדלל באופן סדרתי את התרכובות במדיום הבדיקה בצינורות פוליפרופילן 5 מ”ל כדי להשיג את הריכוזים הרצויים פי 10. השהה את התקן CEI על-ידי לחיצה על השהה בחלונית הגדרת איסוף נתונים. המתן להשלמת נקודת הזמן הנוכחית והוציא את צלחת 96 הקידוחים. ודא את ההיצמדות ואת היווצרות monolayer של התאים תחת מיקרוסקופ אור. מוציאים 20 μL מכל באר עם צינור רב ערוצי. הוסף 20 μL של פתרון מורכב או רכב בבארות הרצוי. הכינו פריסה עם התנאים הספציפיים לצנרת נכונה. לדגור על הצלחת במשך 15 דקות ב 37 ° C עם 5% CO2.הערה: אינקובטור תאים רגיל משמש לשלב דגירה זה במקום התקן CEI. בארות בקרת תאים (CC) הן בארות מטופלות ברכב. 6. הכנת וירוסים והדבקה הפשירו בקבוקון של מלאי וירוסים. בדוגמה זו, נעשה שימוש ב- ZIKV MR766 וב- ZIKV PRVABC59. הכן דילול וירוסים ב- MOI הרצוי או דילולים במדיום הבדיקה בצינור פוליפרופילן 15 מ”ל.הערה: בדוגמה מייצגת זו, נעשה שימוש ב- MOI 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.005 ו- 0.00005. הוסף 100 μL של דילול וירוס בבארות שהוקצו של צלחת באר 96. הוסף מדיום בדיקה לבארות CC. לטהר את מיכלי הנגיף המועסקים. החזיר את הלוח להתקן CEI והמשך את המדידות במשך 6 ימים רצופים על-ידי לחיצה על חדש ניסוי.הערה: בארות בקרת וירוסים (VC) הן תאים נגועים המטופלים ברכב, בעוד שבבארות CC, מתווסף מדיום בדיקה במקום דילול וירוסים. אם ציטוטוקסיות של תרכובות מוערך, להוסיף 100 μL של מאגר הבדיקה במקום דילול וירוסים. 7. ניתוח נתונים סיים את הניסוי על-ידי לחיצה על סיום והוסף הערות סיכום אופציונליות, כגון מידע אודות תנאי הניסוי הספציפיים בחלון המופיע. לחץ על אישור לאחר השלמת איסוף הנתונים. בחרו את התדירות הרצויה בחלונית Graph שבה נמדד הפרש העכבה הגדול ביותר בין CC ל-VC בסוף הניסוי.כדי לקבוע את התדירות הטובה ביותר, הפעל ניסוי פיילוט עם תאים לא נגועים ונגועים ובחר את התדירות שבנקודת הזמן שבה העכבה של התאים הנגועים ירדה לרמה הבסיסית שלה – מובילה להפרש העכבה הגדול ביותר שנצפה בין התאים הלא נגועים והנגועים. במקרה של תאי A549 נגועים ZIKV, זה 16 קילוהרץ. כדי לייצא את כל הנתונים בתבנית גיליון אלקטרוני, ודא שכל הבארות נבחרו בחלונית Well Configuration ולחץ על File | ייצוא נתונים | נתוני גרף. נרמל את הנתונים על ידי הפחתת ערך עכבת VC הממוצע שנמדד בסוף הניסוי מכל נקודות הנתונים וחילוק זה בערך עכבת CC הממוצע של נקודת הזמן האחרונה שנמדדה לפני ההדבקה. התווה את הנתונים המנורמלים בפונקציה של זמן כדי לקבל גרפים פרופיל CEI. חשב את האזור המנורמל מתחת לעקומה (AUCn) של כל תנאי כדי לקבוע פרמטרים כגון ריכוזים מעכבים של 50% (IC50). חשב פרמטרים שימושיים אחרים, כגון CIT50, כדי, למשל, להשוות את ההדבקה של זני וירוס שונים.