Celgebaseerd elektrisch impedantieplatform om Zika-virusremmers in realtime te evalueren
Summary
Hier demonstreren we het gebruik van celgebaseerde elektrische impedantie (CEI) als een zeer eenvoudige en eenvoudige methode om Zika-virusinfectie en -replicatie in menselijke cellen in realtime te bestuderen. Bovendien is de CEI-test nuttig voor de evaluatie van antivirale verbindingen.
Abstract
Celgebaseerde elektrische impedantie (CEI) -technologie meet veranderingen in impedantie veroorzaakt door een groeiende of gemanipuleerde aanhangende celmonolaag op kweekplaatputten ingebed met elektroden. De technologie kan worden gebruikt om de gevolgen van Zika-virus (ZIKV) -infectie en adherente celreplicatie in realtime te volgen, omdat dit virus zeer cytopathogeen is. Het is een eenvoudige test die geen gebruik van labels of invasieve methoden vereist en het voordeel heeft dat het realtime gegevens oplevert. De kinetiek van ZIKV-infectie is sterk afhankelijk van de gebruikte cellijn, virusstam en multipliciteit van infectie (MOI), die niet gemakkelijk kunnen worden bestudeerd met conventionele eindpunttests. Bovendien kan de CEI-test ook worden gebruikt voor de evaluatie en karakterisering van antivirale verbindingen, die ook dynamische remmende eigenschappen kunnen hebben in de loop van de infectie. Dit methodeartikel geeft een gedetailleerde uitleg van de praktische uitvoering van de CEI-test en de mogelijke toepassingen ervan in ZIKV-onderzoek en antiviraal onderzoek in het algemeen.
Introduction
Uitbraken van het Zika-virus (ZIKV) gaan gepaard met ernstige ziektecomplicaties, zoals microcefalie en guillain-barresyndroom 1,2,3. Hoewel toekomstige epidemieën plausibel zijn vanwege verschillende risicofactoren, zoals de verspreiding van muggenvectoren en de toenemende verstedelijking, heeft tot op heden nog geen vaccin of antiviraal medicijn 3,4 op de markt gebracht. Daarom moeten traditionele ZIKV-onderzoeksmethoden worden aangevuld met nieuwe hulpmiddelen om dit virus en zijn potentiële antivirale verbindingen te bestuderen. Antiviraal onderzoek is vaak gebaseerd op fenotypische assays, waarbij het eindpunt de aanwezigheid van een specifieke parameter is, zoals het optreden van een virus-geïnduceerd cytopathisch effect (CPE) of de productie van een bepaald virus-geïnduceerd eiwit door middel van een reportergen 5,6,7. Deze methoden hebben echter eindpuntuitlezingen, zijn arbeidsintensief en vereisen mogelijk complexe analyse. Daarom bieden op impedantie gebaseerde methoden een aantrekkelijk alternatief.
Celgebaseerde elektrische impedantie (CEI) wordt gedefinieerd als de weerstand tegen stroom van de ene elektrode naar de andere, veroorzaakt door een aanhangende cellaag gezaaid op elektrodehoudende putten. De gevestigde CEI-technologie die in deze methodologie wordt gebruikt, is Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS), oorspronkelijk ontwikkeld door Giaever en Keese 8,9. Dit wordt gebruikt in een breed veld van biologische onderzoeksdomeinen, zoals kankermetastase, toxicologie en wondgenezing10,11,12. Het principe is gebaseerd op een elektrisch veld dat wordt gegenereerd door een continue veeg van wisselstroom (AC) spanningen over een bereik van frequenties13. De cellen worden blootgesteld aan deze niet-invasieve elektrische velden en met vooraf bepaalde intervallen worden de impedantieveranderingen veroorzaakt door celgroei of veranderingen in celtrouw of morfologie gemeten14. Bovendien leidt veranderde levensvatbaarheid van cellen ook tot impedantieveranderingen, waardoor de technologie een nuttig hulpmiddel is om infectie met cytopathogene virussen te monitoren15,16,17. Omdat morfologische veranderingen van de cellaag op nanoschaal worden gedetecteerd, biedt de technologie een zeer gevoelig detectiemiddel. De CEI-test die in dit artikel wordt beschreven, is een eenvoudige, niet-invasieve, real-time, labelvrije methode om de impedantieveranderingen van de cellaag in de loop van de tijd te meten.
Hoewel CEI niet is gebruikt om het verloop van ZIKV-infectie of de potentiële antivirale middelen te evalueren, is het gebruik ervan als diagnostisch hulpmiddel vóór18 onderzocht. In een recente studie werd het gebruik van de CEI-test om de antivirale activiteit van verschillende ZIKV-remmers in A549-cellen te bepalen voor het eerst gevalideerd19. Dit artikel over methoden beschrijft deze CEI-test in meer detail en breidt deze uit naar verschillende adherente cellijnen, evenals een verscheidenheid aan ZIKV-stammen bij verschillende multiplicities of infection (MOI). Hiermee wordt het veelzijdige gebruik van deze methode in flavivirus antiviraal onderzoek aangetoond. De methode heeft het cruciale voordeel van real-time celmonitoring, die de detectie van belangrijke infectietijdpunten en de dynamische remmende activiteit door potentiële antivirale verbindingen mogelijk maakt. Alles bij elkaar biedt de CEI-technologie een krachtig en waardevol hulpmiddel om het huidige scala aan antivirale methodologieën aan te vullen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel beschrijft het gebruik van de CEI-test in ZIKV-antiviraal onderzoek. De test heeft het voordeel van real-time monitoring en kan daarom worden gebruikt om de kinetiek van ZIKV-infectie en antivirale remming met selectieve verbindingen te evalueren. De gegevens die met deze methode worden verkregen, maken een objectieve en visuele observatie van de door het virus geïnduceerde CPE en de potentie van een potentiële antivirale verbinding mogelijk.
Aangezien CEI een zeer gevoelige methode is, moet grote voorzichtigheid worden betracht bij het uitvoeren van deze cellulaire test. Het is van cruciaal belang dat nauwkeurig pipetteren wordt uitgevoerd om pipetteervariatie zoveel mogelijk te voorkomen. Bovendien moeten andere factoren die de experimentele uitkomsten kunnen beïnvloeden, zoals het aantal cellen en de gebruikte virale voorraad, constant worden gehouden tussen de herhalingen van het experiment. Dit zijn factoren die de kinetiek van celgroei en infectie sterk beïnvloeden en daarom kunnen leiden tot variatie in berekende CIT50-waarden en/of andere parameters.
Bij het uitvoeren van de CEI-test in aanwezigheid van (potentiële) antivirale verbindingen is het belangrijk om te bepalen of ze de impedantie van de cellen beïnvloeden in afwezigheid van een virus. De techniek is zo gevoelig dat impedantieveranderingen ver onder de cytotoxische concentraties van de verbinding kunnen worden gemeten19.
Hoewel in dit artikel alleen ZIKV-gegevens worden getoond, kan de test eenvoudig worden toegepast op andere cytopathogene (flavi) virussen, met slechts minimale optimalisatie-inspanning, zoals optimale CEI-monitoringfrequentiebepaling. Aanpassingen van de CEI-test zijn toegepast met verschillende menselijke en dierlijke virussen, zoals chikungunya, influenza A en herpesvirussen bij mens en paard25,26,27,28. Hier wordt het ook gebruikt als een eenvoudige methode voor de kwantificering van virale titers of voor de identificatie van antivirale verbindingen. Deze studies gebruikten real-time celanalyse, een alternatieve CEI-methode.
Het gebruik van de CEI-technologie is beperkt tot adherente celtypen, omdat het principe van de test afhankelijk is van de eigenschappen van adherente cellen om zich over de in elektroden ingebedde putten te verspreiden. Putoppervlakcoatings zoals fibronectine kunnen worden gebruikt om de celaanhechtingte verbeteren 29. De methodologie heeft enkele andere nadelen, de eerste heeft betrekking op de kosten. Afgezien van de investering in het CEI-bewakingsapparaat en de bijbehorende hard- en software, zijn de verbruiksartikelen ook wat duur. Verder, omdat het protocol vereist dat virale infectie gedurende meerdere dagen wordt gevolgd, kan één 96-well-plaat per week worden geëvalueerd. Samen met de hoge kosten beperkt dit het gebruik tot instellingen voor lage tot gemiddelde doorvoer.
Vanwege deze doorvoerproblemen is de technologie niet geschikt voor antivirale screeningsinstellingen. Het is echter zeer aantrekkelijk in de eerste experimentele fasen, bijvoorbeeld bij het evalueren van de celgevoeligheid voor de studie van ZIKV-infectie in een bepaalde ziektegerelateerde omgeving. De technologie is ook nuttig met getransfecteerde of knock-out cellijnen om gemakkelijk veranderingen in infectiekinetiek waar te nemen, bijvoorbeeld in de aan- of afwezigheid van bepaalde ingangsreceptoren. Dit is interessant bij het onderzoeken van de betrokkenheid van cellulaire factoren bij ZIKV-infectie. Verder kan in latere preklinische fasen, wanneer een bepaalde hoofdkandidaat is geselecteerd, de CEI-test worden gebruikt voor verdere diepgaande karakterisering van een geselecteerde verbinding. CEI-biosensoren kunnen ook worden gewijzigd door bepaalde bioherkenningselementen, zoals virusspecifieke antilichamen, te immobiliseren voor de detectie vanvirussen 18. Al met al benadrukt dit het veelzijdige gebruik van CEI in een virologische omgeving.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Clément Heymann en Gorrit Lootsma voor het proeflezen van het manuscript. De studie werd ondersteund door interne subsidies van het Laboratorium voor Virologie en Chemotherapie (Rega Instituut, KU Leuven).
Materials
| A549 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-185 | These cells are cultured in MEM Rega-3 supplemented with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 0.075% sodium bicarbonate. |
| Acridine Orange/Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Live/dead stain |
| Cellstar polypropylene tubes, 15 mL | Greiner bio-one | 1,88,271 | |
| Cellstar polypropylene tubes, 50 mL | Greiner bio-one | 2,27,261 | |
| Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 41965-039 | Cell culture medium for U87 and HEL 299 cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| ECIS cultureware 96W20idf | Applied BioPhysics | 96W20idf PET | Assay plate for CEI device |
| Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) Z array station | Applied BioPhysics | CEI device, including 96 well station, external control module and laptop with control, acquisition and display software. The necessary software is installed before shipment. NOTE: this device is currently out of production and has been replaced by the more advanced ECIS Z-Theta device | |
| Falcon polystyrene tubes, 5 mL | Corning | 352054 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SV30160.03 | Cell culture medium additive for all used cells |
| HEL 299 cells | ATCC | CCL-137 | These cells are cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 0.01 M HEPES. |
| HEPES buffer, 1 M | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15630-056 | Cell culture medium additive for U87 cells |
| Labyrinthopeptin A1 | Kind gift from Prof. Dr. Roderich Süssmuth, Technische Universität Berlin, Germany | Antiviral compound used as an example in this protocol. It is dissolved in DMSO. | |
| L-Glutamine, 200 mM | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | Cell culture medium additive for A549 cells |
| Luna cell counting slides | Logos Biosystems | L12001 | |
| Luna-FL dual fluoresence cell counter | Logos Biosystems | L20001 | Cell viability counter |
| Minimum Essential Medium Rega-3 (MEM Rega-3) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 19993013 | Cell culture medium for A549 cells |
| Sodium Bicarbonate, 7.5% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25080-060 | Cell culture medium additive for A549 cells |
| Tissue culture flask T75 | TPP | Y9076 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25200-056 | Dissociation reagent |
| U87 cells | ATCC | HTB-14 | These cells are cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 0.01 M HEPES. |
| Virkon Rely+On tablets | Lanxess | 115-0020 | Disinfectant sollution |
| Zika virus (ZIKV) MR766 | ATCC | VR-84 | ZIKV prototype strain, isolated from sentinel Rhesus monkey in Uganda in 1968 |
| ZIKV PRVABC59 | ATCC | VR-1843 | ZIKV strain isolated from patient in Puerto Rico in 2015 |
References
- Cao-Lormeau, V. M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
- Mlakar, J., et al. Zika virus associated with microcephaly. The New England. Journal of Medicine. 374 (10), 951-958 (2016).
- Pierson, T. C., Diamond, M. S. The emergence of Zika virus and its new clinical syndromes. Nature. 560 (7720), 573-581 (2018).
- Pergolizzi, J., et al. The Zika virus: Lurking behind the COVID-19 pandemic. Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics. 46 (2), 267-276 (2021).
- Bernatchez, J. A., et al. Development and validation of a phenotypic high-content imaging assay for assessing the antiviral activity of small-molecule inhibitors targeting Zika virus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (10), e00725 (2018).
- Zou, J., Shi, P. Y. Strategies for Zika drug discovery. Current Opinion in Virology. 35, 19-26 (2019).
- Mottin, M., et al. Discovery of new Zika protease and polymerase inhibitors through the open science collaboration Project OpenZika. Journal of Chemical Information and Modeling. 62 (24), 6825-6843 (2022).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences. 81 (12), 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
- Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. Journal of Visualized Experiments. (50), e2792 (2011).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
- Li, X., et al. Hsp70 suppresses mitochondrial reactive oxygen species and preserves pulmonary microvascular barrier integrity following exposure to bacterial toxins. Frontiers in Immunology. 9, 1309 (2018).
- Wegener, J., Keese, C. R., Giaever, I. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces. Experimental Cell Research. 259 (1), 158-166 (2000).
- Xu, Y., et al. A review of impedance measurements of whole cells. Biosensors and Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).
- Pennington, M. R., Van de Walle, G. R. Electric cell-substrate impedance sensing to monitor viral growth and study cellular responses to infection with alphaherpesviruses in real time. mSphere. 2 (2), e00039 (2017).
- Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
- McCoy, M. H., Wang, E. Use of electric cell-substrate impedance sensing as a tool for quantifying cytopathic effect in influenza a virus infected MDCK cells in real-time. Journal of Virological Methods. 130 (1-2), 157-161 (2005).
- Stukovnik, Z., Bren, U. Recent developments in electrochemical-impedimetric biosensors for virus detection. International Journal of Molecular Sciences. 23 (24), 15922 (2022).
- Oeyen, M., Meyen, E., Doijen, J., Schols, D. In-depth characterization of Zika virus inhibitors using cell-based electrical impedance. Microbiology Spectrum. 10 (4), e0049122 (2022).
- Prochnow, H., et al. Labyrinthopeptins exert broad-spectrum antiviral activity through lipid-binding-mediated virolysis. Journal of Virology. 94 (2), e01471 (2020).
- Oeyen, M., et al. Labyrinthopeptin A1 inhibits dengue and Zika virus infection by interfering with the viral phospholipid membrane. Virology. 562, 74-86 (2021).
- Vicenti, I., et al. Comparative analysis of different cell systems for Zika virus (ZIKV) propagation and evaluation of anti-ZIKV compounds in vitro. Virus Research. 244, 64-70 (2018).
- Gobillot, T. A., Humes, D., Sharma, A., Kikawa, C., Overbaugh, J. The robust restriction of Zika virus by type-I interferon in A549 cells varies by viral lineage and is not determined by IFITM3. Viruses. 12 (5), 503 (2020).
- Verma, N. K., Moore, E., Blau, W., Volkov, Y., Babu, P. R. Cytotoxicity evaluation of nanoclays in human epithelial cell line A549 using high content screening and real-time impedance analysis. Journal of Nanoparticle Research. 14, 1137 (2012).
- Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
- Labadie, T., Grassin, Q., Batéjat, C., Manuguerra, J. -. C., Leclercq, I. Monitoring influenza virus survival outside the host using real-time cell analysis. Journal of Visualized Experiments. (168), e61133 (2021).
- Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 54 (8), 2120-2127 (2016).
- Zandi, K. A real-time cell analyzing assay for identification of novel antiviral compounds against chikungunya virus. Methods in Molecular Biology. 1426, 255-262 (2016).
- Ebrahim, A. S., et al. Functional optimization of electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) using human corneal epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 14126 (2022).
