منصة المعاوقة الكهربائية القائمة على الخلايا لتقييم مثبطات فيروس زيكا في الوقت الحقيقي
Summary
نوضح هنا استخدام المعاوقة الكهربائية القائمة على الخلايا (CEI) كطريقة سهلة ومباشرة للغاية لدراسة عدوى فيروس زيكا وتكراره في الخلايا البشرية في الوقت الفعلي. علاوة على ذلك ، فإن اختبار CEI مفيد لتقييم المركبات المضادة للفيروسات.
Abstract
تقيس تقنية المعاوقة الكهربائية القائمة على الخلايا (CEI) التغيرات في المعاوقة الناتجة عن طبقة أحادية الخلية الملتصقة المتنامية أو المتلاعب بها على آبار ألواح الاستزراع المدمجة مع الأقطاب الكهربائية. ويمكن استخدام هذه التقنية لرصد عواقب العدوى بفيروس زيكا (ZIKV) وتكاثر الخلايا الملتصقة في الوقت الحقيقي، لأن هذا الفيروس شديد الإمراض للخلايا. إنه اختبار مباشر لا يتطلب استخدام الملصقات أو الأساليب الغازية وله فائدة في توفير بيانات في الوقت الفعلي. تعتمد حركية عدوى ZIKV بشكل كبير على خط الخلية المستخدم ، وسلالة الفيروس ، وتعدد العدوى (MOI) ، والتي لا يمكن دراستها بسهولة باستخدام مقايسات نقطة النهاية التقليدية. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا استخدام مقايسة CEI لتقييم وتوصيف المركبات المضادة للفيروسات ، والتي يمكن أن يكون لها أيضا خصائص مثبطة ديناميكية على مدار العدوى. تقدم مقالة الطرق هذه شرحا مفصلا للتنفيذ العملي لمقايسة CEI وتطبيقاتها المحتملة في أبحاث ZIKV والبحوث المضادة للفيروسات بشكل عام.
Introduction
ترتبط فاشيات فيروس زيكا (ZIKV) بمضاعفات مرضية خطيرة ، مثل صغر الرأس ومتلازمة غيلان باريه1،2،3. على الرغم من أن الأوبئة المستقبلية معقولة بسبب عوامل الخطر المختلفة مثل انتشار توزيع البعوض الناقل وزيادة التحضر ، حتى الآن ، لم يصل أي لقاح أو دواء مضاد للفيروسات إلى السوق حتى الآن 3,4. ولذلك، ينبغي استكمال أساليب البحث التقليدية في فيروس زيكا بأدوات جديدة لدراسة هذا الفيروس ومركباته المحتملة المضادة للفيروسات. غالبا ما تعتمد الأبحاث المضادة للفيروسات على مقايسات النمط الظاهري ، حيث تكون نقطة النهاية هي وجود معلمة محددة ، مثل ظهور تأثير الاعتلال الخلوي الناجم عن الفيروس (CPE) أو إنتاج بروتين معين يسببه الفيروس عن طريق جين مراسل5،6،7. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق لها قراءات نقطة النهاية ، وهي كثيفة العمالة ، وقد تتطلب تحليلا معقدا. لذلك ، توفر الطرق القائمة على المعاوقة بديلا جذابا.
تعرف المعاوقة الكهربائية القائمة على الخلية (CEI) بأنها مقاومة تدفق التيار من قطب كهربائي إلى آخر ، بسبب طبقة خلية ملتصقة بذر على آبار تحتوي على قطب كهربائي. تقنية CEI الراسخة المستخدمة في هذه المنهجية هي استشعار مقاومة الخلايا الكهربائية (ECIS) ، الذي طوره في الأصل Giaever و Keese 8,9. يستخدم هذا في مجال واسع من مجالات البحث البيولوجي ، مثل ورم خبيث للسرطان ، وعلم السموم ، والتئام الجروح10،11،12. يعتمد مبدأه على مجال كهربائي يتم إنشاؤه بواسطة اكتساح مستمر لجهد التيار المتردد (AC) على نطاق من الترددات13. تتعرض الخلايا لهذه المجالات الكهربائية غير الغازية ، وعلى فترات محددة مسبقا ، يتم قياس تغيرات المعاوقة الناتجة عن نمو الخلايا أو التغيرات في التصاق الخلية أو مورفولوجيا14. علاوة على ذلك ، تؤدي قابلية بقاء الخلية المتغيرة أيضا إلى تغييرات في المعاوقة ، مما يجعل التكنولوجيا أداة مفيدة لمراقبة العدوى بالفيروسات المسببة للأمراض الخلوية15،16،17. نظرا لأنه سيتم اكتشاف التغيرات المورفولوجية لطبقة الخلية في النطاق النانوي ، فإن التكنولوجيا توفر أداة كشف حساسة للغاية. يعد اختبار CEI الموصوف في هذه المقالة طريقة سهلة وغير جراحية وفي الوقت الفعلي وخالية من الملصقات لقياس تغيرات مقاومة طبقة الخلية بمرور الوقت.
على الرغم من أن CEI لم يستخدم لتقييم مسار عدوى ZIKV أو مضادات الفيروسات المحتملة ، فقد تم التحقيق في استخدامه كأداة تشخيصية قبل18. في دراسة حديثة ، تم التحقق من صحة استخدام مقايسة CEI لتحديد النشاط المضاد للفيروسات للعديد من مثبطات ZIKV في خلايا A549 لأول مرة19. تصف مقالة الطرق هذه مقايسة CEI هذه بمزيد من التفصيل وتوسعها لتشمل خطوط الخلايا الملتصقة المختلفة ، بالإضافة إلى مجموعة متنوعة من سلالات ZIKV في مضاعفات مختلفة للعدوى (MOI). بموجب هذا ، يتم إثبات الاستخدام المتنوع لهذه الطريقة في أبحاث الفيروسات المصفرة. تتمتع هذه الطريقة بفائدة حاسمة تتمثل في مراقبة الخلايا في الوقت الفعلي ، والتي تسمح باكتشاف النقاط الزمنية المهمة للعدوى ونشاط التثبيط الديناميكي بواسطة المركبات المضادة للفيروسات المحتملة. مجتمعة ، توفر تقنية CEI أداة قوية وقيمة لاستكمال المجموعة الحالية من منهجيات مكافحة الفيروسات.
Protocol
Representative Results
Discussion
توضح هذه المقالة استخدام مقايسة CEI في أبحاث ZIKV المضادة للفيروسات. وللفحص فائدة الرصد في الوقت الحقيقي، وبالتالي يمكن استخدامه لتقييم حركية عدوى فيروس زيكا وتثبيط مضادات الفيروسات بمركبات انتقائية. تسمح البيانات التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة بمراقبة موضوعية وبصرية ل CPE الناجم عن الفيروس وفعالية مركب مضاد للفيروسات محتمل.
نظرا لأن CEI طريقة حساسة للغاية ، يجب توخي الحذر الشديد عند إجراء هذا الفحص الخلوي. من الأهمية بمكان إجراء سحب دقيق لتجنب اختلاف السحب قدر الإمكان. علاوة على ذلك ، يجب أن تظل العوامل الأخرى التي قد تؤثر على النتائج التجريبية ، مثل عدد الخلايا والمخزون الفيروسي المستخدم ، ثابتة بين تكرار التجربة. هذه هي العوامل التي تؤثر بشكل كبير على حركية نمو الخلايا والعدوى ، وبالتالي يمكن أن تؤدي إلى اختلاف في قيم CIT50 المحسوبة و / أو المعلمات الأخرى.
عند إجراء مقايسة CEI في وجود مركبات مضادة للفيروسات (محتملة) ، من المهم تحديد ما إذا كانت تؤثر على مقاومة الخلايا في حالة عدم وجود فيروس. هذه التقنية حساسة للغاية بحيث يمكن قياس تغيرات المعاوقة أقل بكثير من تركيزات المركب السامةللخلايا 19.
على الرغم من أن بيانات ZIKV فقط تظهر في هذه المقالة ، يمكن تطبيق الفحص بسهولة على الفيروسات المسببة للأمراض الخلوية (flavi) الأخرى ، مع الحد الأدنى من جهد التحسين ، مثل تحديد تردد مراقبة CEI الأمثل. تم استخدام تعديلات مقايسة CEI مع العديد من الفيروسات البشرية والحيوانية ، مثل الشيكونغونيا والأنفلونزا A وفيروسات الهربس البشرية والخيول25،26،27،28. هنا ، يتم استخدامه أيضا كطريقة بسيطة لقياس التتر الفيروسي أو لتحديد المركبات المضادة للفيروسات. استخدمت هذه الدراسات تحليل الخلايا في الوقت الفعلي ، وهي طريقة بديلة ل CEI.
يقتصر استخدام تقنية CEI على أنواع الخلايا الملتصقة ، حيث يعتمد مبدأ الفحص على خصائص الخلايا الملتصقة للانتشار عبر الآبار المدمجة في القطب الكهربائي. يمكن استخدام طلاء سطح الآبار مثل الفبرونيكتين لتحسين ارتباط الخلية29. المنهجية لها بعض العيوب الأخرى ، أولها يتعلق بتكلفتها. بصرف النظر عن الاستثمار في جهاز مراقبة CEI والبرامج الصلبة المصاحبة له ، فإن المواد الاستهلاكية باهظة الثمن إلى حد ما. علاوة على ذلك ، نظرا لأن البروتوكول يتطلب مراقبة العدوى الفيروسية لعدة أيام ، يمكن تقييم لوحة واحدة من 96 بئرا في الأسبوع. إلى جانب التكلفة العالية ، يحد هذا من الاستخدام لإعدادات الإنتاجية المنخفضة إلى المتوسطة.
بسبب مشكلات الإنتاجية هذه ، فإن التكنولوجيا غير مناسبة لإعدادات الفحص المضاد للفيروسات. ومع ذلك ، فهو جذاب للغاية في المراحل التجريبية الأولية ، على سبيل المثال ، عند تقييم حساسية الخلايا لدراسة عدوى ZIKV في بيئة معينة مرتبطة بالمرض. هذه التقنية مفيدة أيضا مع خطوط الخلايا المنقولة أو الضربة القاضية لمراقبة التغيرات في حركية العدوى بسهولة ، على سبيل المثال ، في وجود أو عدم وجود مستقبلات دخول معينة. هذا مثير للاهتمام عند التحقيق في تورط العوامل الخلوية في عدوى ZIKV. علاوة على ذلك ، في المراحل قبل السريرية اللاحقة ، عندما يتم اختيار مرشح رئيسي معين ، يمكن استخدام اختبار CEI لمزيد من التوصيف المتعمق لمركب محدد. يمكن أيضا تعديل أجهزة الاستشعار الحيوية CEI عن طريق شل حركة بعض عناصر التعرف البيولوجي ، مثل الأجسام المضادة الخاصة بالفيروسات ، للكشف عن الفيروسات18. إجمالا ، يسلط هذا الضوء على الاستخدام المتنوع ل CEI في بيئة علم الفيروسات.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون كليمان هيمان وغوريت لوتسما على التدقيق اللغوي للمخطوطة. تم دعم الدراسة من خلال المنح الداخلية لمختبر علم الفيروسات والعلاج الكيميائي (معهد ريغا ، جامعة لوفين).
Materials
| A549 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-185 | These cells are cultured in MEM Rega-3 supplemented with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 0.075% sodium bicarbonate. |
| Acridine Orange/Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Live/dead stain |
| Cellstar polypropylene tubes, 15 mL | Greiner bio-one | 1,88,271 | |
| Cellstar polypropylene tubes, 50 mL | Greiner bio-one | 2,27,261 | |
| Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 41965-039 | Cell culture medium for U87 and HEL 299 cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| ECIS cultureware 96W20idf | Applied BioPhysics | 96W20idf PET | Assay plate for CEI device |
| Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) Z array station | Applied BioPhysics | CEI device, including 96 well station, external control module and laptop with control, acquisition and display software. The necessary software is installed before shipment. NOTE: this device is currently out of production and has been replaced by the more advanced ECIS Z-Theta device | |
| Falcon polystyrene tubes, 5 mL | Corning | 352054 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SV30160.03 | Cell culture medium additive for all used cells |
| HEL 299 cells | ATCC | CCL-137 | These cells are cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 0.01 M HEPES. |
| HEPES buffer, 1 M | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15630-056 | Cell culture medium additive for U87 cells |
| Labyrinthopeptin A1 | Kind gift from Prof. Dr. Roderich Süssmuth, Technische Universität Berlin, Germany | Antiviral compound used as an example in this protocol. It is dissolved in DMSO. | |
| L-Glutamine, 200 mM | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | Cell culture medium additive for A549 cells |
| Luna cell counting slides | Logos Biosystems | L12001 | |
| Luna-FL dual fluoresence cell counter | Logos Biosystems | L20001 | Cell viability counter |
| Minimum Essential Medium Rega-3 (MEM Rega-3) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 19993013 | Cell culture medium for A549 cells |
| Sodium Bicarbonate, 7.5% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25080-060 | Cell culture medium additive for A549 cells |
| Tissue culture flask T75 | TPP | Y9076 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25200-056 | Dissociation reagent |
| U87 cells | ATCC | HTB-14 | These cells are cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 0.01 M HEPES. |
| Virkon Rely+On tablets | Lanxess | 115-0020 | Disinfectant sollution |
| Zika virus (ZIKV) MR766 | ATCC | VR-84 | ZIKV prototype strain, isolated from sentinel Rhesus monkey in Uganda in 1968 |
| ZIKV PRVABC59 | ATCC | VR-1843 | ZIKV strain isolated from patient in Puerto Rico in 2015 |
References
- Cao-Lormeau, V. M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
- Mlakar, J., et al. Zika virus associated with microcephaly. The New England. Journal of Medicine. 374 (10), 951-958 (2016).
- Pierson, T. C., Diamond, M. S. The emergence of Zika virus and its new clinical syndromes. Nature. 560 (7720), 573-581 (2018).
- Pergolizzi, J., et al. The Zika virus: Lurking behind the COVID-19 pandemic. Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics. 46 (2), 267-276 (2021).
- Bernatchez, J. A., et al. Development and validation of a phenotypic high-content imaging assay for assessing the antiviral activity of small-molecule inhibitors targeting Zika virus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (10), e00725 (2018).
- Zou, J., Shi, P. Y. Strategies for Zika drug discovery. Current Opinion in Virology. 35, 19-26 (2019).
- Mottin, M., et al. Discovery of new Zika protease and polymerase inhibitors through the open science collaboration Project OpenZika. Journal of Chemical Information and Modeling. 62 (24), 6825-6843 (2022).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences. 81 (12), 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
- Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. Journal of Visualized Experiments. (50), e2792 (2011).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
- Li, X., et al. Hsp70 suppresses mitochondrial reactive oxygen species and preserves pulmonary microvascular barrier integrity following exposure to bacterial toxins. Frontiers in Immunology. 9, 1309 (2018).
- Wegener, J., Keese, C. R., Giaever, I. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces. Experimental Cell Research. 259 (1), 158-166 (2000).
- Xu, Y., et al. A review of impedance measurements of whole cells. Biosensors and Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).
- Pennington, M. R., Van de Walle, G. R. Electric cell-substrate impedance sensing to monitor viral growth and study cellular responses to infection with alphaherpesviruses in real time. mSphere. 2 (2), e00039 (2017).
- Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
- McCoy, M. H., Wang, E. Use of electric cell-substrate impedance sensing as a tool for quantifying cytopathic effect in influenza a virus infected MDCK cells in real-time. Journal of Virological Methods. 130 (1-2), 157-161 (2005).
- Stukovnik, Z., Bren, U. Recent developments in electrochemical-impedimetric biosensors for virus detection. International Journal of Molecular Sciences. 23 (24), 15922 (2022).
- Oeyen, M., Meyen, E., Doijen, J., Schols, D. In-depth characterization of Zika virus inhibitors using cell-based electrical impedance. Microbiology Spectrum. 10 (4), e0049122 (2022).
- Prochnow, H., et al. Labyrinthopeptins exert broad-spectrum antiviral activity through lipid-binding-mediated virolysis. Journal of Virology. 94 (2), e01471 (2020).
- Oeyen, M., et al. Labyrinthopeptin A1 inhibits dengue and Zika virus infection by interfering with the viral phospholipid membrane. Virology. 562, 74-86 (2021).
- Vicenti, I., et al. Comparative analysis of different cell systems for Zika virus (ZIKV) propagation and evaluation of anti-ZIKV compounds in vitro. Virus Research. 244, 64-70 (2018).
- Gobillot, T. A., Humes, D., Sharma, A., Kikawa, C., Overbaugh, J. The robust restriction of Zika virus by type-I interferon in A549 cells varies by viral lineage and is not determined by IFITM3. Viruses. 12 (5), 503 (2020).
- Verma, N. K., Moore, E., Blau, W., Volkov, Y., Babu, P. R. Cytotoxicity evaluation of nanoclays in human epithelial cell line A549 using high content screening and real-time impedance analysis. Journal of Nanoparticle Research. 14, 1137 (2012).
- Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
- Labadie, T., Grassin, Q., Batéjat, C., Manuguerra, J. -. C., Leclercq, I. Monitoring influenza virus survival outside the host using real-time cell analysis. Journal of Visualized Experiments. (168), e61133 (2021).
- Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 54 (8), 2120-2127 (2016).
- Zandi, K. A real-time cell analyzing assay for identification of novel antiviral compounds against chikungunya virus. Methods in Molecular Biology. 1426, 255-262 (2016).
- Ebrahim, A. S., et al. Functional optimization of electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) using human corneal epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 14126 (2022).
