JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物工程

Изготовление пульсирующих полимерных микрочастиц, инкапсулирующих антиген бешенства

Published: May 12, 2023
doi:
10.3791/65147
, , , , , , ,
1Department of Bioengineering,Rice University, 2Particles for Humanity, 3IMPACT Technology Development, 4Department of Chemistry,Rice University

Summary

Этот метод описывает инкапсуляцию антигена бешенства в биоразлагаемые полимерные микрочастицы со структурными и материальными свойствами, которые обеспечивают пульсирующее высвобождение после заданной задержки. Иммуноферментный анализ (ИФА) антигена, извлеченного из ядра частицы, подтверждает наличие интактного гликопротеина тримерного вируса бешенства путем фабрикации частиц.

Abstract

Действующие рекомендации по постконтактной профилактике бешенства требуют многократных инъекций в течение нескольких недель. Это может быть непропорционально обременительным для тех, кто живет в странах с низким и средним уровнем дохода (СНСД), где происходит большинство смертельных контактов с бешенством. Были изучены различные стратегии доставки лекарств для конденсации схем вакцинации до одной инъекции путем инкапсуляции антигенов в полимерные частицы. Однако жесткие стрессоры в процессе инкапсуляции могут вызвать денатурацию инкапсулированного антигена. В данной статье описан способ инкапсуляции антигена вируса бешенства (RABV) в полимерные микрочастицы, которые демонстрируют перестраиваемое пульсирующее высвобождение. Этот метод, называемый равномерно сжиженными и запечатанными частицами для инкапсуляции лекарств (PULSED), генерирует микрочастицы с помощью мягкой литографии для создания форм обратного полидиметилсилоксана (PDMS) из многофотонной мастер-формы, напечатанной на 3D-принтере. Пленки поли (молочнокислой согликолевой кислоты) (PLGA) затем прессуются в пресс-формы PDMS для создания цилиндров с открытой поверхностью, которые заполняются концентрированным RABV с помощью пьезоэлектрического дозирующего робота. Затем эти микроструктуры герметизируются путем нагревания верхней части частиц, что позволяет материалу течь и образовывать непрерывный непористый полимерный барьер. После изготовления используется иммуноферментный анализ (ИФА), специфичный для обнаружения интактного гликопротеина тримерного вируса бешенства, для подтверждения высокого извлечения иммуногенного антигена из микрочастиц.

Introduction

Вакцинация является чрезвычайно эффективным инструментом здравоохранения, предотвратив более 37 миллионов смертей в период с 2000 по 2019 год1. Несмотря на эту эффективность, болезни, предупреждаемые с помощью вакцин, по-прежнему представляют значительный риск для глобального здравоохранения, особенно в странах с низким и средним уровнем дохода (СНСД), где высокие показатели невакцинации и недостаточной вакцинации ежегодно приводят к 1,5 миллионам смертей, предупреждаемых с помощью вакцин2. Бешенство не является исключением из этих различий. Несмотря на то, что бешенство является самой смертоносной болезнью, известной человечеству, и почти повсеместно приводит к летальному исходу, оно полностью поддается лечению и классифицируется как искорененное во многих странах с высоким уровнем дохода. Вместо этого бремя бешенства непропорционально тяжело несут люди, живущие в некоторых частях Азии и Африки, где болезнь имеет разрушительные последствия для людей и домашнего скота 3,4.

Вакцинация имеет решающее значение для борьбы с глобальным воздействием бешенства5. Стоимость вакцинации запрещает широкое внедрение доконтактной профилактики (ДКП), учитывая общую низкую заболеваемость. Кроме того, в странах с низким и средним уровнем дохода полезность постконтактной профилактики (ПКП) ограничена социально-экономическим давлением на пациентов, обращающихся за медицинской помощью. Логистические факторы, такие как расстояние до пунктов доступа к медицинской помощи, потеря заработной платы при получении лечения, стоимость лечения, встречи, мешающие повседневной деятельности, и забывчивость, приводят к тому, что уровень приверженности ПКП составляет всего 60%6,7. Такой высокий уровень оттока пациентов дает возможность усовершенствовать подходы к устранению пробелов в вакцинации против бешенства в целях борьбы с этим заболеванием.

Системы вакцинации с однократной инъекцией (SI), которые контролируют высвобождение антигенов, были изучены как способы получения полной иммунизации за одну инъекцию. Устранение необходимости многократных посещений поставщика медицинских услуг смягчает бремя, которое мешает людям обращаться за адекватной помощью. Для достижения вакцинации SI антиген обычно инкапсулируют в биоразлагаемую полимерную матрицу, которая часто принимает форму инъекционных микрочастиц. После инъекции полимер разлагается и высвобождает секвестрированный антиген. На сегодняшний день для достижения вакцинации против СИ применяются две стратегии первичного высвобождения. В одном подходе антиген высвобождается непрерывно в течение длительного периода времени. Несмотря на то, что он предназначен для повышения иммуногенности одной инъекции, неясно, достаточен ли этот подход для того, чтобы вызвать защитный иммунный ответ против вируса бешенства (RABV) у людей8. В другом случае антиген высвобождается после заранее определенной задержки, чтобы имитировать традиционную и проверенную схему вакцинации с прайм-бустом. Методы распылительной сушки и изготовления микрочастиц на основе эмульсии/испарения растворителей демонстрируют первую стратегию и используются для успешной инкапсуляции как модельных вакцин9, так и высокостабильных антигенов, таких как столбнячный анатоксин10. Однако эти методы инкапсуляции включают стрессоры, включая тепло, взаимодействие растворителей и физические силы, которые могут денатурировать антигены11.

Частицы, равномерно сжиженные и запечатанные для инкапсуляции лекарств (PULSED) – это недавно разработанный метод изготовления, который можно использовать для инкапсуляции биологических препаратов в биоразлагаемые микрочастицы. Микроформование используется для получения частиц, которые заполняются жидкой полезной нагрузкой и нагреваются, чтобы позволить полимеру оплавляться и полностью инкапсулировать центральный склад груза в непрерывном слое биоразлагаемого полимера. Эта микроструктура приводит к пульсирующему высвобождению полезной нагрузки по истечении времени, которое зависит от скорости разложения полимерной оболочки12. Эта рукопись демонстрирует инкапсуляцию инактивированного RABV в микрочастицы, состоящие из полимолочнокислой кислоты (PLGA), биоразлагаемого полимера, используемого во многих одобренных FDA составах13, с использованием метода изготовления PULSED для инкапсуляции стабильного антигена RABV, оцененного с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Комбинируя частицы PLGA с различной молекулярной массой и/или конечными группами, этот подход может имитировать текущий ход вакцинации против бешенства после однократной инъекции.

Protocol

1. Генерация мастер-формы для частиц ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс 3D-печати может быть выполнен на любом 3D-принтере с достаточным пространственным разрешением; однако текущий протокол описывает процесс для многофотонного 3D-принтера. Проектирование структур микрочастиц с помощью программы автоматизированного проектирования (САПР).ПРИМЕЧАНИЕ: Конструктивные характеристики следующие: 308 частиц (диаметр = 400 мкм, высота = 500 мкм и толщина стенки = 100 мкм) расположены в массиве 22 на 14 с расстоянием между ними 600 мкм. Конструкция также содержит четырехконечную звезду и пятиконечную звезду в качестве фидуциалов непосредственно за пределами массива (дополнительный рисунок 1). Экспортируйте окончательный дизайн в виде файла STL (файл дополнительного кодирования 1) и загрузите файл в программное обеспечение, способное определять параметры печати, как показано ниже. Затем сохраните его как файл, совместимый с 3D-принтером (см. Таблицу материалов).ПРИМЕЧАНИЕ: Расстояние нарезки = 5 мкм, расстояние штриховки = 1 мкм, контур оболочки = 50 мкм, количество базовых срезов = 5 мкм, строительные леса = полые, режим сканирования = гальванический, ось Z = Z-привод микроскопа, скорость сканирования = 100 000, мощность = 100. Предварительно обработайте кремниевую печатную подложку (см. Таблицу материалов) с использованием процесса плазменной очистки (газ: O2; мощность: 200 Вт; температура: 25 °C; расход: 20; время: 5 мин), затем немедленно погрузите подложку в раствор 30 мл этанола и 60 мкл 3-(триметоксисилил) пропилметакрилата в стеклянной чашке Петри. Накройте алюминиевой фольгой и дайте настояться в течение ночи.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг увеличивает адгезию печати к подложке, что важно во время разделения PDMS (этап 2.6). Загрузите файл печати на многофотонный 3D-принтер, нанесите печатную смолу на обработанную подложку, загрузите 10-кратную линзу (см. Таблицу материалов) и распечатайте микроструктуры. После завершения погрузите отпечаток в ацетат метилового эфира пропиленгликоля (см. Таблицу материалов) на 45 минут, чтобы удалить неэкспонированный фоторезист, затем погрузите отпечаток в изопропиловый спирт на 5 минут. Отверждайте мастер-форму, подвергая ее воздействию ультрафиолетового излучения при длине волны 254 нм в течение 120 минут.ПРИМЕЧАНИЕ: Если доступно, ультрафиолетовый свет в диапазоне от 405 до 365 нм можно использовать в течение ~ 20 минут для последующего отверждения печатных структур. 2. Производство пресс-форм из полидиметилсилоксана (PDMS) Обработайте поверхность мастер-формы, напечатанной на 3D-принтере, поместив ее в вакуумную камеру, содержащую предметное стекло с добавлением на поверхность 40 мкл трихлора (1H, 1H, 2H, 2H, -перфтороктила) (см. Таблицу материалов). Потяните вакуум (относительное давление: -20 В). Hg) в течение 1 ч.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг обеспечивает легкое отделение при извлечении из формы (этап 2.6). Во время обработки поверхности мастер-формы тщательно перемешайте основу форполимера полидиметилсилоксана (ПДМС) с отвердителем преполимера ПДМС в соотношении 9:1 по массе (для каждой мастер-формы требуется не менее 10 г материала). После тщательного перемешивания переложите неотвержденный PDMS в центрифужную пробирку объемом 50 мл и центрифугу при 300 x g в течение 3 мин при комнатной температуре. После завершения обработки поверхности поместите мастер-форму в форму из алюминиевой фольги и вылейте неотвержденный PDMS поверх формы, убедившись, что элементы полностью погружены в воду. Поместите чашку из алюминиевой фольги в вакуумную камеру и вытяните вакуум (относительное давление: -20 дюймов). Hg) в течение 1 ч для удаления пузырьков воздуха. Извлеките блюдо из алюминиевой фольги из вакуумной камеры. Поместите прокладки размером 800 мкм на концы мастер-формы и наложите на мастер-форму чистое предметное стекло, стараясь избежать попадания пузырьков воздуха. Используйте зажимы для связующего, чтобы зажать форму и направляющее вместе, локализовав усилие зажима над прокладками (дополнительный рисунок 2). Поместите конструкцию в печь с температурой 120 °C не менее чем на 4 часа для отверждения форполимера в формы PDMS. Извлеките конструкцию из духовки, осторожно освободите зажимы для связующего и осторожно отделите мастер-форму от отвержденной формы PDMS с помощью бритвенного лезвия.ПРИМЕЧАНИЕ: Мастер-форма, напечатанная на 3D-принтере, может быть повторно использована для создания дополнительных форм PDMS. 3. Изготовление пленки PLGA Взвесьте 450 мг PLGA (см. Таблицу материалов) и поместите его на антипригарный полимерный лист размером 76 мм на 76 мм в кольцевой прокладке толщиной 250 мкм с внутренним диаметром 50,8 мм. Поместите второй антипригарный полимерный лист поверх PLGA и сожмите стопку между двумя алюминиевыми блоками с помощью c-образного зажима диаметром 101,6 мм до плотного затягивания пальцев.ПРИМЕЧАНИЕ: 502H PLGA использовался исключительно в этом исследовании; однако другие типы PLGA совместимы с этим процессом. Поместите узел с зажимом в вакуумную печь с температурой 120 °C на 30 мин под вакуумом при относительном давлении -30 дюймов рт.ст. Затем снимите узел и плотно затяните зажим, прежде чем поместить его обратно в вакуумную печь еще на 30 минут.ПРИМЕЧАНИЕ: Основная цель использования вакуума – избежать деградации PLGA, которая ускоряется при высоких температурах. Выньте сборку из духовки и дайте ей остыть в течение 4 часов в эксикаторе. Как только он остынет, ослабьте зажим, снимите пленку PLGA с антипригарных полимерных листов и поместите пленку в помеченную чашку Петри. Храните чашку Петри в эксикаторе для последующего использования. 4. Генерация частиц PLGA Обработайте поверхность пресс-формы PDMS, как описано ранее на шаге 2.1. С помощью пинцета и/или скальпеля вырежьте и поместите часть пленки PLGA размером 250 мкм, примерно размером с массив, на обработанную форму PDMS. Наложите предметное стекло микроскопа на пленку PLGA и пресс-форму PDMS и сожмите компоненты вместе, поместив пружинный зажим непосредственно на матрицу и пленку PLGA. Поместите зажатую пресс-форму в вакуумную печь с температурой 120 °C и вытяните вакуум с относительным давлением -30 В. ртутного столба за 1 ч. ст.ПРИМЕЧАНИЕ: Время, необходимое для образования частиц, зависит от PLGA и может варьироваться от 1 до 12 часов. Выньте зажатую форму из духовки и дайте ей пассивно остыть при комнатной температуре в течение примерно 15 минут или пока она не остынет на ощупь. Используя лезвие бритвы, осторожно надавите между пресс-формой PDMS и массивом частиц PLGA, чтобы разделить их. Храните частицы PLGA в эксикаторе для использования в будущем. 5. Концентрация и очистка антигена Разморозьте одну аликвоту коммерчески доступного антигена RABV (см. Таблицу материалов) при комнатной температуре. Соберите фильтрационную установку, поместив два центробежных спиновых фильтра с отсечкой молекулярной массы 100 кДа (MWCO; см. Таблицу материалов) в две сборные трубки. Предварительно намочите два центробежных спиновых фильтра, добавив 500 мкл воды UltraPure. Вращайте фильтры при 2 400 x g в течение 1 минуты в настольной центрифуге при комнатной температуре. Удалите воду из верхнего и нижнего отсеков фильтрационной установки с помощью пипетки объемом 200 мкл.ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте высыхания предварительно смачиваемого отжимного фильтра. Добавьте 400 мкл дистиллированной воды в верхний отсек каждого спинового фильтра, затем добавьте 100 мкл размороженного антигена RABV и перемешайте пипеткой.ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании антиген был сконцентрирован примерно в пять раз и снижена концентрация вспомогательных веществ <100 кДа в ~ 50 раз. Загрузите два центробежных спиновых фильтра в настольную центрифугу, убедившись, что фильтры обращены к центру центрифуги. Отметьте, какая сторона фильтра обращена к центру центрифуги.ПРИМЕЧАНИЕ: При неправильной ориентации растворы не будут должным образом отфильтрованы / сконцентрированы. Центрифугируйте фильтры при 14 000 x g в течение 10 мин при комнатной температуре. Извлеките фильтры из центрифуги. Сборные пробирки будут содержать фильтрат, в то время как фильтры будут содержать концентрированную пробу (дополнительный рисунок 3А). Удалите фильтрат из сборных пробирок с помощью пипетки и выбросьте. Добавьте 450 мкл отфильтрованной дистиллированной воды в каждый фильтр и смешайте концентрированный образец и воду пипеткой вверх и вниз шесть раз. Центрифуга двух спиновых фильтров во второй раз при 14 000 x g в течение 10 минут при комнатной температуре. Убедитесь, что фильтры обращены к центру центрифуги в той же ориентации, что и на шаге 5.7. Извлеките фильтрующие блоки из центрифуги и, как и раньше, удалите и отбросьте фильтрат из каждой пробирки с помощью пипетки. Снимите спиновые фильтры со сборных трубок и закройте корпуса фильтров верхней частью сборных трубок (дополнительный рисунок 3B). Поместите нижнюю часть корпусов отжимных фильтров непосредственно на вихрь и вихрь при 3,000 об/мин в течение 30 с, удерживая корпуса фильтров в вертикальном положении под углом 45° (дополнительный рисунок 3C).ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап предназначен для ресуспендирования любого антигена RABV, который образовал гранулу в процессе центрифугирования. Осторожно снимите колпачок сборных трубок с корпусов отжимных фильтров. Поместите корпуса фильтров обратно в прилагаемые сборные трубки и выполните быстрое вращение (2-3 с), чтобы собрать любой объем, который мог застрять в крышке.ПРИМЕЧАНИЕ: Это быстрое вращение должно выполняться в настольной микроцентрифуге. Фильтры должны быть расположены по касательной к центрифуге, в отличие от предыдущей конфигурации, чтобы гарантировать, что раствор не будет потерян через фильтры. Переверните каждый блок спинового фильтра в новую сборную трубку, поставляемую с комплектом спинового фильтра (см. Таблицу материалов), и центрифугу в течение 2 мин при 1000 x g при комнатной температуре для сбора концентрированных образцов. Консолидируйте концентрированные образцы из двух пробирок в одну пробирку для сбора. Измерьте и запишите полученный объем.ПРИМЕЧАНИЕ: Полученный образец будет иметь в 5 раз большую начальную концентрацию антигена по сравнению с сырьем, иметь небольшую концентрацию вспомогательного вещества (<100 кДа) примерно в 50 раз ниже, чем у материала, и будет выглядеть слегка молочно-белым. Общий объем должен составлять примерно 44-48 мкл. Храните 5-кратный концентрированный, дважды промытый антиген при температуре 4 °C до момента дозирования, но не более 16 часов. Перед заполнением частиц этим раствором центрифугируйте пробирку при 1,000 x g в течение 1 мин, чтобы удалить пузырьки. Раствор можно разбавлять дистиллированной водой для достижения номинальной целевой концентрации для дозирования. 6. Заполнение частицами Вакуумный фильтр 500 мл деионизированной воды через вакуумный фильтр 0,22 мкм, затем дегазирует раствор, применяя вакуум (относительное давление: -20 дюймов). Hg) при обработке ультразвуком в течение 20 мин. В течение этого времени присоедините пьезодозирующие капилляры (PDC; см. Таблицу материалов) к пьезоэлектрическому дозатору. Заправьте машину в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов) и поместите предметное стекло с частицами PLGA в зону дозирования. Настройте «Найти целевые опорные точки», « Выполнить», а затем настройте «Целевую подложку» в соответствии с дополнительным рисунком 4. Загрузите 25 мкл концентрированного антигена в исходную пластину и загрузите ее в машину. Используя PDC, аспирируйте 10 мкл концентрированного антигена в дозирующий наконечник, промойте внешнюю сторону наконечника, затем откалибруйте выравнивание дозатора (дополнительный рис. 5). Введите «Параметры настройки цели» и нажмите кнопку «Выполнить» (дополнительный рисунок 6). После завершения удалите заполненные частицы и убедитесь, что они заполнены под стереоскопом. Перейдите непосредственно к следующему шагу протокола. 7. Запечатывание и сбор частиц Поместите блок из нержавеющей стали (см. Таблицу материалов) на конфорку. Поместите два предметных стекла микроскопа на блок из нержавеющей стали так, чтобы они были параллельны. Убедитесь, что блок из нержавеющей стали выровнен, затем включите конфорку и установите температуру так, чтобы температура поверхности нержавеющей стали составляла 200 °C. Перед запечатыванием проверьте температуру конфорки. Подвесьте заполненные частицы PLGA над конфоркой, поместив их на два предметных стекла, затем немедленно запустите таймер на 18 секунд.ПРИМЕЧАНИЕ: Время и количество тепла, необходимые для герметизации, будут варьироваться в зависимости от химических свойств PLGA, используемого для изготовления частиц. Специальный держатель слайдов, напечатанный на 3D-принтере, можно использовать для обработки слайдов на безопасном расстоянии от конфорки. Файл STL предоставляется в виде файла дополнительного кодирования 2. После запечатывания снимите массив частиц с конфорки и подвесьте его над лабораторным столом, поместив массив частиц на два отдельных предметных стекла. Дайте частицам остыть в течение 1 минуты. После охлаждения частицы можно собирать с помощью скальпеля, глядя через стереоскоп. Держите скальпель лезвием под углом 45° к предметному стеклу и надавите на основание частицы, чтобы отделить ее от предметного стекла. После сбора урожая используйте скальпель для переноса частиц в пробирки с низким содержанием белка объемом 0,5 мл (см. Таблицу материалов). Затем заполните пробирки 250 мкл 1x фосфатного буферного раствора (PBS), содержащего 30 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 1 мг / мл глюкозы.ПРИМЕЧАНИЕ: 30 мг / мл BSA и 1 мг / мл раствора глюкозы, приготовленного в PBS, будут поддерживать стабильность антигена RABV. Раздавите частицы под стереоскопом с помощью пинцета с тонким наконечником. Убедитесь, что антиген RABV в ядре частицы доступен для растворения в окружающем растворе. Храните образцы в холодильнике при температуре 4 °C до тех пор, пока эффективность антигена не будет оценена с помощью ИФА. Образцы должны быть проверены на ELSIA в течение 7 дней после подготовки. 8. Оценка антигена методом ИФА ВНИМАНИЕ: Ни в коем случае не допускайте высыхания микропланшетов. Всегда складывайте тарелки и всегда накрывайте верхнюю тарелку пластиковой печатью, пустой тарелкой или крышкой, чтобы избежать высыхания. Подготовьте буферы, как указано в дополнительном файле 1. Приготовьте 5 мл раствора оболочки (карбонатно-бикарбонатный буфер, рН 9,6) в концентрации 2,5 мкг/мл, добавив 25 мкл антитела оболочки к 4975 мкл буфера покрытия при рН 9,4-9,6.ПРИМЕЧАНИЕ: 5 мл необходимо для покрытия 96 лунок по 50 мкл каждая (с дополнительным объемом для потерь при пипетке). Увеличьте общий объем на 5 мл для каждой дополнительной необходимой пластины ИФА. Используйте многоканальную пипетку для дозирования 50 мкл раствора покрытия в каждую лунку микропланшета. Раствор необходимо использовать для покрытия сразу после его приготовления. Аккуратно постучите по краям тарелки ладонью в перчатке, чтобы дно каждой лунки было равномерно покрыто жидкостью. Запечатайте пластину клейкой пленкой и поместите ее при температуре 37 °C на 1 час, затем переложите на 4 °C на ночь. Извлеките пластины из холодильника и промойте их три раза, поместив 200 мкл буфера для стирки в каждую лунку. Снимите буфер для промывки и вылейте 300 мкл блокирующего буфера в каждую лунку.ВНИМАНИЕ: При работе с несколькими пластинами с одними и теми же образцами, повторяющимися на разных пластинах, важно действовать по тарелке за пластиной (т. е. заполнять пластину 1 материалом, прежде чем переходить к пластине 2, а затем к пластине 3 и так далее). Не наносите материал X на все пластины, а затем материал Y и т. Д., Так как это увеличит риск высыхания скважин. После заключительного этапа промывки буфер для промывки должен оставаться в лунках пластины и выбрасываться только непосредственно перед добавлением образцов в пластину. Пластиковая крышка пластины на 96 лунок должна быть использована для покрытия всех лунок пластины ИФА, которые не дозируются сразу, и крышка последовательно перемещается, чтобы открыть дополнительные лунки для заполнения материалом. Заклейте пластины клейкой полиэтиленовой пленкой (см. Таблицу материалов) и поместите их в инкубатор на 60 ± 5 мин при температуре 37 ± 2 °C. Подготовьте стандартную кривую и тестовые образцы для оценки во время этой инкубации.ПРИМЕЧАНИЕ: Оцениваемый антиген должен быть предварительно разбавлен в буфере-разбавителе в рекомендуемом разведении 0,125 МЕ / мл с избыточным объемом не менее 40 мкл для учета потери при пипетке. Все образцы оцениваются в двух экземплярах (две технические реплики) на каждой пластине ИФА. Для стандартной кривой в колонки 2 и 3 каждой таблички ИФА следует включить двукратный ряд разбавлений, в общей сложности восемь точек. Серия разведения может быть выполнена для всех других образцов с соответствующим числом баллов на основе прогнозируемого количества оцениваемого антигена. Несмотря на то, что разбавление одного образца является менее строгим для более высокой пропускной способности, оно может быть использовано в качестве альтернативы описанному выше покрытию. Однако ожидаемая концентрация одного разбавления должна находиться в пределах диапазона стандартной кривой. В 96-луночных планшетах с низкосвязывающим белком или в белковых пробирках с низким связыванием (см. Таблицу материалов) выполняют двойную серию разведения каждого образца вдоль столбцов пластины. Загрузите начало серии разбавления в ряд А для каждой соответствующей пробы в объеме, удвоенном необходимом конечном объеме (на одну пластину требуется 100 мкл пробы на одну лунку, поэтому все лунки в А2-А11 должны содержать не менее 240 мкл пробы с дополнительным объемом 40 мкл для учета потерь при пипетировании). Загрузите 120 мкл буфера разбавителя во все остальные лунки на белковой пластине с низким связыванием, за исключением столбцов 1 и 12 (т.е. от B2 до H11). Используя многоканальную пипетку, загруженную 10 наконечниками, выполните последовательное разведение, перенеся 120 мкл образца из A2-A11 в B2-B11 и несколько раз пипетируя вверх и вниз для смешивания, избегая разбрызгивания и пузырьков. Повторите этот процесс, двигаясь вниз по плите вдоль колонн до лунки Н2-Н11. Откажитесь от оставшихся 120 мкл объема, отсасываемых из последнего ряда лунок.ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь образцы готовы к анализу. Если фаза блокировки не завершена к этому времени, убедитесь, что образцы хранятся на льду. В конце этапа инкубации трижды вымойте пластины 200 мкл буфера для промывки. С помощью многоканальной пипетки перенесите 100 мкл буфера разбавителя в колонки 1 и 12 в качестве «заготовок». С помощью многоканальной пипетки перенесите 100 мкл из каждой лунки 96-луночной пластины с низкосвязывающим белком, содержащей разведения пробы, в промытую пластину ИФА. Повторите эти действия для всех запускаемых планшетов ИФА. Запечатайте планшеты клейкой полиэтиленовой пленкой и поместите их в инкубатор на 60 ± 5 мин при температуре 37 ± 2 °C. Приготовьте раствор антитела для обнаружения (см. Таблицу материалов) в концентрации 0,2 мкг/мл, добавив 4,4 мкл раствора антитела к 10 995,6 мкл буфера разбавителя, и хорошо перемешайте пипеткой вверх и вниз.ПРИМЕЧАНИЕ: Всего требуется 11 мл для 96 лунок по 100 мкл каждая (с дополнительным объемом для потерь при пипетировании). Увеличьте общий объем на 11 мл для каждой дополнительной оцениваемой планшетной ИФА. Раствор необходимо использовать сразу после приготовления. В конце этапа инкубации вымойте пластины пять раз 200 мкл буфера для промывки. Аспирируйте оставшийся буфер для промывки и распределите 100 мкл раствора антитела для обнаружения в каждую лунку на микропланшете с помощью многоканальной пипетки. Запечатайте планшеты клейкой полиэтиленовой пленкой и поместите их в инкубатор на 60 ± 5 мин при температуре 37 ± 2 °C. Приготовьте конъюгат к концу стадии инкубации антител обнаружения, добавив 4,4 мкл конъюгированного раствора стрептавидин-пероксидазы (см. Таблицу материалов) к 10 995,6 мкл буфера для промывки.ПРИМЕЧАНИЕ: Всего требуется 11 мл для 96 лунок по 100 мкл каждая (с дополнительным объемом для многоканального пипетирования). Увеличьте общий объем на 11 мл для каждой дополнительной оцениваемой планшетной ИФА. Вымойте пластины пять раз с 200 мкл буфера для стирки. Аспирируйте оставшийся буфер для промывки и выдавите по 100 мкл сопряженного раствора в каждую лунку. Запечатайте планшеты клейкой пластиковой пленкой и поместите их в инкубатор с температурой 37 °C на 60 ± 5 мин при температуре 37 ± 2 °C. Подготовьте основание на последнем этапе стирки в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Для каждой пластины растворите одну таблетку дигидрохлорида о-фенилендиамина (OPD; см. Таблицу материалов) в 9 мл деионизированной воды в темноте, затем долейте 1 мл 10-кратного стабильного пероксидного буфера. Отрегулируйте количество таблеток и общий объем раствора (10 мл) в зависимости от количества оцениваемых планшетов. Вымойте пластины пять раз с 200 мкл буфера для стирки. Распределите по 100 мкл субстрата в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки. Заклейте пластины клейкой полиэтиленовой пленкой и оставьте на скамейке на 10-20 мин, защищенных от света, с помощью алюминиевой фольги.ПРИМЕЧАНИЕ: Визуально отслеживайте развитие цвета, чтобы избежать насыщенности. Немедленно добавьте 50 мкл стоп-раствора в каждую лунку и считывающую пластину, чтобы получить поглощение при длине волны 492 нм и эталонное поглощение 620 нм. Проанализируйте данные, используя скорректированные показания поглощения (показания при 492 нм минус показания при 620 нм) и вычтите среднее значение бланка из всех образцов. Используйте метод сигмоидальной интерполяции 4PL для преобразования значений поглощения в МЕ / мл. Наконец, умножьте на 250 мкл (общий объем образца), чтобы преобразовать его в МЕ.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ может быть выполнен с помощью программного обеспечения для анализа данных.

Representative Results

Запечатывание и заполнение частиц являются двумя наиболее важными шагами в этом протоколе. Частицы были заполнены натриевой солью флуоресцеина, чтобы продемонстрировать идеальное наполнение и некоторые распространенные ошибки. Натриевая соль флуоресцеина использовалась вместо антигена RABV для простоты визуализации. Во время наполнения важно дозировать раствор на дно ядер частиц, а затем дать достаточно времени для испарения растворителя/воды. После завершения депо растворенного вещества остается на дне ядра частиц (рис. 1A). После заполнения очень важно правильно запечатать частицы. На рисунке 1В показано несколько результатов (успешных и неудачных) процесса герметизации. После 12 с времени запечатывания остается отчетливый путь от центра частицы к внешней стороне частицы, демонстрирующий частицу, которая не полностью запечатана. И наоборот, если оставить герметизацию на 36 с, PLGA почти полностью расплавится, в результате чего образуется микроструктура с неглубоким профилем. Идеальная морфология может быть визуализирована, когда частицы запечатаны в течение 18 и 24 с, поскольку они содержат груз, полностью инкапсулированный полимером, сохраняя при этом структуру частиц. На рисунке 1C показано несколько потенциальных результатов после наполнения и запечатывания. Во время дозирования, если растворитель не достигает дна частицы, он оставляет высохшее растворенное вещество в середине ядра частицы (неправильно заполненное); Хотя эти частицы все еще могут герметизироваться, плохая загрузка груза может ограничить эффективность погрузки. Если частицы заполнены слишком большим количеством груза (переполнены), процесс герметизации тормозится, так как груз препятствует протеканию PLGA через отверстие. При правильном заполнении и запечатывании частицы этой геометрии достаточно малы, чтобы легко поместиться внутри иглы 19G. Кроме того, 10 частиц последовательно проходили через иглу 19 G (100% ± 0%) при введении вязкого раствора, такого как 2% карбоксиметилцеллюлоза (дополнительный рисунок 7). Рисунок 1: Распространенные проблемы с процессом наполнения и запечатывания . (A) Изображения показывают испарение растворителя после одного цикла наполнения, когда частицы загружаются 6 нл 100 мг/мл натриевой соли флуоресцеина, растворенной в воде. (B) Репрезентативные изображения частиц PLGA 502H, удаленных из процесса герметизации через 0, 12, 18, 24 и 36 с. (C) Различные результаты процесса герметизации при правильном, неправильном заполнении или переполнении частиц. Изображения создаются путем наложения нескольких изображений и их объединения с помощью программного обеспечения для наложения фокуса. Масштабная линейка = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Обработка антигена через спиновый фильтр перед загрузкой его в частицы важна по двум причинам. Во-первых, центрифугирование служит для удаления исходных эксципиентов в растворе вакцины, которые могут ограничивать способность частиц загружать при сохранении антигена RABV. Текущий протокол очищает антиген примерно в 50 раз. Во-вторых, антиген также концентрируется во время этого процесса. На рисунке 2А показана микрофотография интактных вирионов RABV в концентрированном образце антигена. Этот антиген примерно в 4,4 раза более концентрирован, чем исходный исходный раствор (рис. 2B). Количество антигена, первоначально загруженного в центробежные спиновые фильтры, может быть изменено, чтобы модулировать конечную достигнутую концентрацию складки. Например, загрузка 40 мкл исходного антигена приводит к концентрации примерно в 1,75 раза. Дополнительный рисунок 8 демонстрирует важность вихря (этап 5.15) в процессе концентрирования. Пренебрежение вихревом или неправильное перемешивание образцов ограничивает процесс концентрации. Рисунок 2: Концентрация антигена. Концентрация антигена методом центробежной фильтрации показана просвечивающей электронной микроскопией (А) и подтверждена ИФА (Б). Столбцы погрешности указывают на стандартное отклонение. Статистический анализ проводится с использованием нескольких сравнительных тестов Тьюки с односторонним ANOVA. **p < 0,01, ****p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. На рисунке 3А изображен концентрированный антиген, заполненный в незапечатанные и запечатанные частицы. Хотя в частицы загружается значительное количество антигена (0,0469 ± 0,0086 МЕ), этот материал составляет <90% емкости частиц, оставляя достаточно места для загрузки дополнительного антигена. Интересно, что незапечатанные частицы содержат только 0,0396 ± 0,0077 МЕ, что составляет всего 85% ± 16% от общего загруженного количества. Несмотря на статистически незначимую потерю, некоторые антигены RABV могли денатурироваться во время повторной регидратации и сушки в процессе наполнения. После герметизации 69% ± 5% антигена остается инкапсулированным в биологически активную форму. Хотя это говорит о том, что в процессе герметизации происходит значительная потеря из-за термического стресса, большая часть инактивированного вирусного антигена остается нетронутой (рис. 3B). Совместная инкапсуляция стабилизирующих вспомогательных веществ вместе с антигеном является одной из возможных стратегий дальнейшего повышения стабильности антигена на протяжении всего процесса изготовления и ранее была успешной с другими инактивированными вирусными антигенами14,15. Рисунок 3: Биоактивный антиген RABV после изготовления частиц. (A) На изображениях видны незапечатанные и запечатанные частицы, содержащие антиген RABV. (B) Стабильность антигена в процессе изготовления частиц (n = 4). Контроль загрузки осуществляется путем дозирования антигена непосредственно в раствор. Столбцы погрешности указывают на стандартное отклонение. Масштабная линейка = 200 мкм. Статистический анализ проводится с использованием нескольких сравнительных тестов Тьюки с односторонним ANOVA. *p < 0,05. Изображения создаются путем наложения нескольких изображений и их объединения с помощью программного обеспечения для наложения фокуса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Дополнительный рисунок 1: Размеры частиц, фидуциальных и массивных. На рисунке показаны геометрические свойства четырехконечной звезды (A), цилиндрической микрочастицы (B), пятиконечной звезды (C) и массива частиц с фидуциалами (D), отображаемых в программном обеспечении САПР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок 2: На этом рисунке показано поперечное сечение конструкции, помещенной в печь для отверждения форм PDMS. Стрелки указывают, где применяются зажимы связующего. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок 3: Надлежащая техника эффективного восстановления концентрированного антигена. В конце первого отжима концентрированный образец, обведенный красным цветом (А), задерживается в фильтре, в то время как фильтрат собирается в нижней части сборной трубки (большая внешняя трубка). Для ресуспендирования гранулированного антигена центробежный фильтрующий блок закрывают крышкой с помощью сборной трубки (B) при подготовке к вихревому образованию. При вихревом наконечник трубки находится в контакте с вихревой прокладкой, а конец колпачка вращается, сохраняя при этом угол 45° с вихревой прокладкой (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок 4: Пьезоэлектрический диспенсер перед запуском. (A) Настройте «Найти целевые опорные точки», перейдя с «Главной вкладки» на вкладку « Настройка робота » > «Разное» >Div. Функция > поиска целевых опорных точек. Используйте кнопки, выделенные синим цветом, чтобы установить фидуциарные метки. Сначала выберите « Изучить шаблон» и нарисуйте рамку вокруг интересующего фидуциарного знака, проверьте точность шаблона, нажав « Поиск шаблона», и сохраните шаблон. Сделайте это для четырех- и пятиконечных звезд и сохраните имена файлов в соответствии с инструкциями в разделе «Использовать два разных изображения шаблона». Затем убедитесь, что все параметры в черных ящиках совпадают. Загрузите четырехконечную звезду с помощью шаблона загрузки (зеленое поле). Сохраните программу «Найти целевые опорные точки», выбрав «Список задач » (оранжевое поле). (B) Настройте «Выполнить », перейдя на вкладку « Настройка робота » > «Задачи», затем загрузите последовательность задач, показанную в синем поле, добавив задачи из списка задач (черный ящик) с помощью выбора « Задача в запуске » (зеленое поле). Наконец, сохраните задачу (оранжевое поле). (C) Настройте «Целевую подложку», перейдя в раздел « Настройка робота » > «Целевая подложка», затем добавьте цель (синее поле). (D) Введите параметры, показанные здесь, и нажмите « Сохранить» (синее поле). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок 5: Загрузка антигена и калибровка отменяющего выравнивания. (A) Перейдите на вкладку « Настройка форсунки » > « Выполнение задачи» и вдохните 10 мкл антигена в дозирующий наконечник, выбрав TakeProbe10 мкл (черный ящик) и нажав « DO » (черный ящик). (B) Откроется отдельное окно. Выберите лунку, в которую был загружен концентрированный антиген, и нажмите OK (синее поле). (C) После того, как антиген был аспирирован, вымойте наконечник, выбрав синюю коробку, и повторите эту промывку еще два раза. Выберите камеру (черный ящик) и определите объем сброса, выбрав объем падения (зеленое поле). Убедитесь, что образуется стабильная капля со стандартным отклонением объема (%) <2 (оранжевая рамка). (D) Выполнение этих шагов откроет камеру Snap Drop Cam; выберите « Изображение » (синее поле) в раскрывающемся меню и выберите «Мастер камеры с сопловой головкой». Откроется новое окно. Быстро выполните следующую последовательность шагов. (E) Убедитесь, что цель, показанная на дополнительном рисунке 4 , загружена, затем выберите «Переместить к цели » (синее поле). Отрегулируйте количество капель до 15 и выберите «Пятно» (черный ящик). Как только вы обнаружите, сразу же выберите «Переместить» (зеленое поле). Убедитесь, что выбран параметр «Автоматический поиск », и удалите размер частиц = 12, затем нажмите « Пуск» (оранжевые поля). Если автоматическое определение не удается, повторите этот процесс после перехода в другую область слайда (фиолетовое поле). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок 6: Программирование споттинг-массива и начало запуска. (A) Перейдите в Target Setup > Target, затем заполните параметры, показанные в синем поле. (B) Затем перейдите на вкладку «Настройка поля» и введите 20 в номер. поля капель (синее поле), выберите лунку (черный ящик), затем выберите цели/частицы для дозирования (зеленое поле). При выборе другой скважины и повторном выборе мишеней/частиц выполняются дополнительные циклы заполнения в течение одного прогона. (C) Убедитесь, что на главном экране выбраны запуск и цель, созданные на дополнительном рисунке 5 . (D) Перейдите на вкладку «Выполнить» и выберите « Начать запуск » (синее поле). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок 7: Инъекционная способность микрочастиц. (А-С) Сфокусированные стереоскопические изображения микрочастиц, заполненных натриевой солью флуоресцеина и запечатанных в игле 19G. (D) В общей сложности 10 частиц вводили через иглу 19 G с использованием 2% раствора карбоксиметилцеллюлозы (n = 8). Масштабная линейка = 1 мм. Столбцы погрешности указывают на стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок 8: Потенциальные проблемы с концентрацией антигена. Красная линия указывает на ожидаемое кратное увеличение концентрации. Столбцы погрешности указывают на стандартное отклонение. Статистический анализ был проведен с использованием множественных сравнительных тестов Тьюки с односторонним ANOVA. p < 0,001, ****p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл 1: Приготовление буферов и растворов для RABV ELISA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл кодирования 1: STL-файл, содержащий массив частиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный файл кодирования 2: файл STL, содержащий геометрию для пользовательского держателя предметного стекла, используемого для герметизации частиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Можно изменять геометрию частиц под конкретные нужды; Однако для цилиндрических конструкций авторы рекомендуют поддерживать соотношение высоты:диаметра:толщины стенки 5:4:1, описанное в протоколе. Такое соотношение сторон гарантирует, что присутствует достаточное количество материала PLGA для герметизации частиц и остается достаточно механически прочным для обработки. Размеры и формы частиц могут быть легко изменены в процессе САПР, что позволяет создавать множество геометрий. Сочетание гибкости САПР с 3D-печатью позволяет быстро создавать микрочастицы. Хотя в этом протоколе используется многофотонный 3D-принтер, любой 3D-принтер со спецификациями, способными печатать размеры микроструктуры в соответствующем материале, может быть использован для создания исходной мастер-формы. Кроме того, фотолитография ранее использовалась для создания аналогичных структур в массивах, намного больших, чем те, которые были получены в этом протоколе; Однако трудозатраты, задержки с заказом фотошаблонов на заказ и доступность оборудования замедлят итеративный процесс проектирования16. Наконец, создание мастер-форм может быть передано на аутсорсинг компаниям, предоставляющим платные услуги, если изготовление мастер-форм собственными силами невозможно. Независимо от 3D-принтера или метода, используемого для создания мастер-форм, адгезия отпечатка к подложке имеет решающее значение для последующих этапов. В частности, если адгезия недостаточна во время создания пресс-формы PDMS, напечатанные частицы останутся в пресс-форме PDMS, что потребует ручного удаления напечатанных частиц и разрушения мастер-формы.

Заполнение частицами является еще одним важным аспектом, который следует учитывать. Микрочастицы имеют ограниченную заполняющую способность, поэтому фильтрация используется не только для концентрирования антигена RABV, но и для удаления исходных вспомогательных веществ, которые в противном случае заняли бы большую часть объема ядра микрочастиц. Однако, учитывая большой размер антигена RABV (примерно 60 нм на 180 нм)17, можно частично вычленить антиген на этапах центрифугирования. По этой причине важно ресуспендировать антиген с помощью пипетки или вихря после центрифугирования для достижения высокого восстановления антигена RABV. Высококонцентрированный раствор идеально подходит для дозирования, поскольку он сокращает циклы дозирования и тем самым ограничивает деградацию антигена во время розлива. Однако вязкость является основным ограничением пьезоэлектрических роботов-дозаторов, образующих стабильную каплю, поэтому дозирование раствора с очень высокой концентрацией может быть невозможным или нецелесообразным. Разбавление наполнительного раствора является самым простым способом достижения стабильного образования капель, но следует учитывать стабильность антигена в течение дополнительных циклов наполнения, необходимых для достижения желаемой загрузки, и более длительное время, необходимое для заполнения частиц.

Ограничения
Этот метод требует узкоспециализированного оборудования для производства исходных форм и специализированного инструмента для наполнения для производства микрочастиц. Хотя потребность в 3D-принтере с разрешением печати, способном генерировать первоначальные мастер-формы, может быть подорвана подходом с оплатой за услугу, доступность пьезоэлектрического робота-дозатора ограничена. Закупка пьезоэлектрического робота-дозатора требует значительных первоначальных инвестиций, часто в диапазоне от 80 000 до 200 000 долларов США, в зависимости от марки, пропускной способности и возможностей. Хотя несколько других методов наполнения являются потенциальными альтернативами, эти методы не были проверены с использованием антигенаRABV 12.

Будущие области применения
Значительная часть инкапсулированного антигена RABV оставалась стабильной в процессе герметизации. Теоретически, включив этот антиген в частицы, состоящие из различных типов PLGA, которые имитируют график введения постконтактной профилактики, все дозы могут быть введены за одну инъекцию. Устранение необходимости повторных посещений больницы для введения дополнительных доз повысит комплаентность пациентов, что приведет к улучшению результатов лечения. Кроме того, продемонстрировав способность сохранять ИФА-реактивность высокосложного инактивированного вируса бешенства, вполне вероятно, что другие антигены, включая субъединичные вакцины, будут совместимы с этим методом инкапсуляции. Использование других профилактических антигенов с импульсными микрочастицами может спасти миллионы жизней в странах с низким и средним уровнем дохода за счет повышения уровня вакцинации недостаточно вакцинированных групп населения. Однако для достижения этой цели вакцины должны оставаться стабильными не только за счет инкапсуляции, но и за счет высвобождения, что может быть сложной задачей, поскольку полезная нагрузка будет подвергаться воздействию повышенных температур и потенциально кислой микросреды из-за тепла тела и продуктов разложения PLGA18. Будущая работа будет направлена на стабилизацию антигена путем высвобождения, что откроет потенциал для платформы вакцинации с однократной инъекцией, которая широко применима для предотвращения многих инфекционных заболеваний.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Хирона Беринга и Bharat Biotech International за предоставление антигена RABV для человечества. Мы также хотели бы поблагодарить Чарльза Рупрехта, VMD, MS, PhD., за его неоценимое руководство и технический вклад. Авторы хотели бы поблагодарить доктора Ребекку Ричардс-Кортум за то, что она разрешила использовать свой дозирующий аппарат для пиколитера SciFLEXARRAYER S3 и инструкцию доктора Челси Смит по использованию устройства. Мы также выражаем признательность Медицинской школе Чана Массачусетского университета за создание микроскопических изображений антигена бешенства. Наконец, мы благодарим Дона Чикеринга и Эрин Эулиано за то, что они рассмотрели документ перед его представлением. Эта работа была поддержана грантом (INV-004360) от Фонда Билла и Мелинды Гейтс.

Materials

0.22 µm PES filter Cole-Parmer+B4B2:B63 04396-26
0.25 mm Shims McMaster Carr 98090A935
0.75 inch Binder Clips Staples 480114
10 mL Syringe Becton, Dickinson and Company 309604
10 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe Fisherbrand 13-678-11E
101.6 mm C-Clamp Amazon PT-SD-CP01A Black handle will eventually fall off. Use pliers to adjust once this happens.
19 G needle EXCELINT 26438
25 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe Fisherbrand 13-678-11
3-(Trimethoxysilyl) Propyl Methacrylate  Millipore Sigma M6514-25ML
5 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe Eppendorf 22431081
50 mL Centrifuge Tubes Corning  352098
50 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe Fisherbrand 13-678-11F
Acetone Fisher AC268310010
Aluminum Block McMaster Carr 9057K175
Aluminum Foil VWR 89079-069
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters, 100 kDa Millipore Sigma C82301
Anti-Rabies Virus Antibody, Serum Free Antibody, clone 1112-1, 100 Fisherbrand 13-678-11D
Anti-Rabies Virus Mouse Monoclonal Antibody, Clone D1-25, biotinylated Fisherbrand 14-388-100
Carboxymethyl Cellulose Tokyo Chemical Industries C0045
ClipTip 300, Filter, Racked Fisherbrand 13-678-11
Costar 0.65 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube Corning  3206
Costar 1.7 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube Corning  3207
Describe Nanoscribe Software used to define the printing parameters for Nanoscribe 3D printer is step 1.2.
Software provided with the printer.
Desiccator Fisher Scientific 10529901 Or equivalent
Double-Sided Tape Staples 649280
DPBS (10x), No Calcium, No Magnesium Gibco 14200075
Ethanol VWR 89370-084
F1-ClipTip Multichannel Pipettes, 30 to 300 µL Fisherbrand 13-678-11E
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 0.1 – 10 µL Fisherbrand 13-678-11F
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 100 – 1000 µL Fisherbrand 03-448-17
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 2 – 20 µL Fisherbrand FB14955202
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 20 – 200 µL Fisherbrand 13-374-10
Fisherbrand Elite Pipette Kit Fisherbrand 05-408-137
Fisherbrand Pipet Controller  Fisherbrand FB14955202
Glass Petri Dish, 90 mm VWR 470313-346
Glass Slides Globe Scientific 1380-10
Helicon Focus 8 HeliconSoft Software used to focus stack images
IP-Q Resin Nanoscribe Printer resin is compatable with the 10x lens and is used for printing large microstructures on the Nanoscribe Photonic Professional GT2
Lascar EL-USB-TC-LCD Thermocouple Amazon 5053485896236 Or equivalent
Microscope Slide Box Millipore Sigma Z374385-1EA Or equivalent
Nanoscribe Photonic Professional GT2 with 10X Objective Nanoscribe
NanoWrite Nanoscribe Software used to interface with nanoscrive 3D printer.
Software provided with printer.
Nunc MaxiSorp Flat-Bottom 96-well Plate Invitrogen 44-2404-21
OPD Substrate Tablets (o-Phenylenediamine Dihydrochloride) Fisherbrand 02-707-432
Parafilm M Wrapping Film, 4 in. Fisherbrand 13-374-10
PDC 60 with Type 3 Coating Scienion P-2020
PDMS Particle Molds Rice University n/a N/A- Particles are 400 μm in diameter with a wall thickness of 100 μm, and a height of 500 μm, resulting in an inner diameter of 200 μm. The arrays are 14 x 22 particles spaced 600 μm apart from each other. 4- and 5-point stars are used as fiducials, positioned 600 μm to the right and left of the top right and top left particles on the array.
Petri Dish Fisher Scientific 08-757-100D
Pierce Stable Peroxide Substrate Buffer (10x) Fisherbrand 02-707-430
Plastic Cups Fisher Scientific S04170
PLGA Film, 502H Sigma 502H: 719897-1G
Propylene Glycol Monomethyl Ether Acetate Millipore Sigma 484431
Rabies Antigen Chiron Behring and Bharat Biotech International Material was acquired by entering into a materials transfer agreement with the company.
Razor Blades VWR 55411-050
Scalpel VWR 21899-530 and 76457-512
SciFLEXARRAYER S3 with PCD 60 Scienion Or equivalent
Sealing Tape for 96-Well Plates Thermo Scientific 15036
Silicon Wafer University Wafer 1025
Spring Clamps IRWIN VGP58100
Stainless Steel Block McMaster Carr 9083K12
Streptavidin−Peroxidase Polymer, Ultrasensitive Fisherbrand 02-707-404
Sylgard 184 DOW 2646340
Teflon Sheet McMaster Carr 9266K12 Used to make PLGA films. Must be cut into appropriately sized pieces.
Teflon Sheet, 0.8 mm-thick McMaster Carr 9266K81
Trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyl) Silane Sigma 448931-10G
Tweezers  Pixnor ESD-16
UltraPure Distilled Water Fisher Scientific 10977015
UV Oven, CL-1000S UV Crosslinker UVP 95-0174-01 Or equivalent
Vacuum Desiccator Bel-Art F420100000 Note you will need two of these. One will be used exclusively to pre-treat samples with trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane to prevent contamination.
Vacuum Oven Capable of Reaching 120 °C VWR 97027-664 Or equivalent
Vacuum, CRVpro4  Welch 3041-01 Or equivalent
Wooden Tongue Depressors Electron Microscopy Sciences 72320
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, X. Estimating the health impact of vaccination against ten pathogens in 98 low-income and middle-income countries from 2000 to 2030: a modelling study. The Lancet. 397, 398-408 (2021).
  2. Euliano, E. M., Sklavounos, A. A., Wheeler, A. R., McHugh, K. J. Translating diagnostics and drug delivery technologies to low-resource settings. Science Translational Medicine. 14 (666), eabm1732 (2022).
  3. Haider, S. Rabies: old disease, new challenges. Canadian Medical Association Journal. 178 (5), 562-563 (2008).
  4. Fisher, C. R., Streicker, D. G., Schnell, M. J. The spread and evolution of rabies virus: conquering new frontiers. Nature Reviews Microbiology. 16 (4), 241-255 (2018).
  5. Nagarajan, T., Rupprecht, C. E. . Rabies and Rabies Vaccines. , (2020).
  6. Shi, T., Dunham, E. F., Nyland, J. E. Rabies vaccination compliance and reasons for incompletion. The Western Journal of Emergency Medicine. 21 (4), 918-923 (2020).
  7. Shankaraiah, R. H., Rajashekar, R. A., Veena, V., Hanumanthaiah, A. N. D. Compliance to anti-rabies vaccination in post-exposure prophylaxis. Indian Journal of Public Health. 59 (1), 58-60 (2015).
  8. Cleland, J. L. Single-administration vaccines: controlled-release technology to mimic repeated immunizations. Trends in Biotechnology. 17 (1), 25-29 (1999).
  9. Yeh, M. K., Coombes, A. G. A., Jenkins, P. G., Davis, S. S. A novel emulsification-solvent extraction technique for production of protein loaded biodegradable microparticles for vaccine and drug delivery. Journal of Controlled Release. 33 (3), 437-445 (1995).
  10. Peyre, M., Sesardic, D., Merkle, H. P., Gander, B., Johansen, P. An experimental divalent vaccine based on biodegradable microspheres induces protective immunity against tetanus and diphtheria. Journal of Pharmaceutical Sciences. 92 (5), 957-966 (2003).
  11. Mvan de Weert, M., Hennink, W. E., Jiskoot, W. Protein instability in poly(lactic-co-glycolic acid) microparticles. Pharmaceutical Research. 17 (10), 1159-1167 (2000).
  12. Graf, T. P., et al. A scalable platform for fabricating biodegradable microparticles with pulsatile drug release. Advanced Materials. , e2300228 (2023).
  13. Wang, Y., Qin, B., Xia, G., Choi, S. H. FDA’s poly (lactic-co-glycolic acid) research program and regulatory outcomes. The American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 23 (4), 92 (2021).
  14. Wan, Y. Development of stabilizing formulations of a trivalent inactivated poliovirus vaccine in a dried state for delivery in the NanopatchTM microprojection array. Journal of Pharmaceutical Sciences. 107 (6), 1540-1551 (2018).
  15. Smith, T. G., Siirin, M., Wu, X., Hanlon, C. A., Bronshtein, V. Rabies vaccine preserved by vaporization is thermostable and immunogenic. Vaccine. 33 (19), 2203-2206 (2015).
  16. McHugh, K. J. Fabrication of fillable microparticles and other complex 3D microstructures. Science. 357 (6356), 1138-1142 (2017).
  17. Sanchez, M. E. N. Rabies vaccine characterization by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 8149 (2020).
  18. Fu, K., Pack, D. W., Klibanov, A. M., Langer, R. Visual evidence of acidic environment within degrading poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres. Pharmaceutical Research. 17 (1), 100-106 (2000).

Tags

Pulsatile Polymeric MicroparticlesRabies AntigenFabrication3D-printed Master MoldPDMSPLGA FilmSingle-dose VaccineVaccine DeliveryPlatform TechnologyTherapeutic DeliveryProphylactic Delivery

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Graf, T. P., Kadasia, K., Melhorn, S., Kessler, E., Yang, H., Baryakova, T., Brady, S., McHugh, K. J. Fabrication of Pulsatile Polymeric Microparticles Encapsulating Rabies Antigen. J. Vis. Exp. (195), e65147, doi:10.3791/65147 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image