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生物工程

Fabrication de microparticules polymères pulsatiles encapsulant l’antigène antirabique

Published: May 12, 2023
doi:
10.3791/65147
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1Department of Bioengineering,Rice University, 2Particles for Humanity, 3IMPACT Technology Development, 4Department of Chemistry,Rice University

Summary

Cette méthode décrit l’encapsulation de l’antigène rabique dans des microparticules polymères biodégradables ayant des propriétés structurelles et matérielles qui permettent une libération pulsatile après un délai prédéterminé. L’évaluation par dosage immunoenzymatique (ELISA) de l’antigène extrait du noyau de particules confirme la présence intacte de glycoprotéine trimérique du virus de la rage par fabrication de particules.

Abstract

Les lignes directrices actuelles sur la prophylaxie post-exposition contre la rage exigent des injections multiples administrées sur plusieurs semaines. Cela peut être disproportionné pour les personnes vivant dans les pays à revenu faible ou intermédiaire (PRFI), où la majorité des expositions mortelles à la rage se produisent. Différentes stratégies d’administration de médicaments ont été explorées pour condenser les schémas vaccinaux en une seule injection en encapsulant des antigènes dans des particules polymères. Cependant, des facteurs de stress sévères pendant le processus d’encapsulation peuvent provoquer une dénaturation de l’antigène encapsulé. Cet article décrit une méthode d’encapsulation de l’antigène du virus de la rage (RABV) dans des microparticules polymériques qui présentent une libération pulsatile accordable. Cette méthode, appelée Particules uniformément liquéfiées et scellées pour encapsuler des médicaments (PULSED), génère des microparticules en utilisant la lithographie douce pour créer des moules polydiméthylsiloxane inverses (PDMS) à partir d’un moule maître multiphotonique imprimé en 3D. Les films de poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA) sont ensuite moulés par compression dans les moules PDMS pour générer des cylindres ouverts remplis de RABV concentré à l’aide d’un robot de distribution piézoélectrique. Ces microstructures sont ensuite scellées en chauffant le sommet des particules, ce qui permet au matériau de s’écouler et de former une barrière polymère continue et non poreuse. Après la fabrication, un test immuno-enzymatique (ELISA) spécifique à la détection de la glycoprotéine intacte du virus trimérique de la rage est utilisé pour confirmer la récupération élevée de l’antigène immunogène des microparticules.

Introduction

La vaccination est un outil de santé extrêmement efficace, ayant permis d’éviter plus de 37 millions de décès entre 2000 et 20191. Malgré cette efficacité, les maladies évitables par la vaccination continuent de poser un risque important pour la santé mondiale, en particulier dans les pays à revenu faible et intermédiaire (PRFI) où les taux élevés de non-vaccination et de sous-vaccination contribuent à 1,5 million de décès évitables par la vaccination chaque année2. La rage ne fait pas exception à ces disparités. Bien qu’elle soit la maladie la plus mortelle connue de l’humanité, presque universellement mortelle, la rage est entièrement traitable et est classée comme éradiquée dans de nombreux pays à revenu élevé. Au lieu de cela, le fardeau de la rage est supporté de manière disproportionnée par les personnes vivant dans certaines régions d’Asie et d’Afrique, où la maladie a des conséquences dévastatrices sur les humains et le bétail 3,4.

La vaccination est essentielle pour gérer l’impact mondial de la rage5. Le coût de la vaccination interdit la mise en œuvre généralisée de la prophylaxie pré-exposition (PrEP), compte tenu de la faible incidence globale de la maladie. De plus, dans les PRFI, l’utilité de la prophylaxie post-exposition (PPE) est limitée par les pressions socioéconomiques exercées sur les patients qui cherchent à obtenir des soins de santé. Des facteurs logistiques, tels que la distance à parcourir pour se rendre aux points d’accès aux soins de santé, la perte de salaire pendant l’obtention d’un traitement, le coût du traitement, les rendez-vous interférant avec les activités quotidiennes et les oublis, entraînent des taux d’observance de la PPE aussi bas que 60%6,7. Ce taux élevé d’attrition des patients offre l’occasion d’affiner les approches pour combler les lacunes dans la vaccination antirabique afin de lutter contre la maladie.

Les systèmes de vaccination par injection unique (SI) qui contrôlent la libération d’antigènes ont été explorés comme moyens d’obtenir une immunisation complète en une seule injection. L’élimination de la nécessité de visites multiples chez un fournisseur de soins de santé atténue les fardeaux qui empêchent les personnes de demander des soins adéquats. Pour obtenir la vaccination SI, un antigène est généralement encapsulé dans une matrice polymère biodégradable qui prend souvent la forme de microparticules injectables. Une fois injecté, le polymère se dégrade et libère l’antigène séquestré. À ce jour, deux stratégies de libération primaires ont été poursuivies pour parvenir à la vaccination contre l’IS. Dans une approche, l’antigène est libéré en continu sur une longue période de temps. Bien qu’elle vise à renforcer l’immunogénicité d’une seule injection, il n’est pas clair si cette approche est suffisante pour provoquer une réponse immunitaire protectrice contre le virus de la rage (RABV) chez les humains8. Dans l’autre, l’antigène est libéré après un délai prédéterminé pour imiter un schéma vaccinal conventionnel et éprouvé. Les méthodes de séchage par atomisation et de fabrication de microparticules basées sur l’émulsion/évaporation de solvants présentent la première stratégie et ont été utilisées avec succès pour encapsuler à la fois des vaccins modèles9 et des antigènes très stables, tels que l’anatoxine tétanique10. Cependant, ces méthodes d’encapsulation impliquent des facteurs de stress, y compris la chaleur, l’interaction avec les solvants et les forces physiques, qui peuvent dénaturer les antigènes11.

Particules uniformément liquéfiées et scellées pour encapsuler des médicaments (PULSED) est une méthode de fabrication récemment mise au point qui peut être utilisée pour encapsuler des produits biologiques dans des microparticules biodégradables. Le micromoulage est utilisé pour générer des particules qui sont remplies d’une charge utile liquide et chauffées pour permettre au polymère de refusionner et d’encapsuler complètement le dépôt central de la cargaison dans une couche contiguë du polymère biodégradable. Cette microstructure entraîne la libération pulsatile de la charge utile, après une durée qui dépend de la vitesse de dégradation de la coque polymère12. Ce manuscrit démontre l’encapsulation du RABV inactivé dans des microparticules composées de poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA), un polymère biodégradable utilisé dans de nombreuses formulations approuvées par la FDA13, en utilisant la méthode de fabrication PULSED pour encapsuler l’antigène RABV stable tel qu’évalué par un test immuno-enzymatique (ELISA). En combinant des particules PLGA de poids moléculaire et/ou de groupes terminaux différents, cette approche a le potentiel d’imiter le temps actuel de vaccination contre la rage après une seule injection.

Protocol

1. Génération de moules maîtres de particules REMARQUE: Le processus d’impression 3D peut être effectué avec n’importe quelle imprimante 3D avec une résolution spatiale suffisante; cependant, le protocole actuel décrit le processus d’une imprimante 3D multiphotonique. Concevoir des structures de microparticules à l’aide d’un programme de conception assistée par ordinateur (CAO).NOTE: Les spécifications de conception sont les suivantes: 308 particules (diamètre = 400 μm, hauteur = 500 μm et épaisseur de paroi = 100 μm) sont disposées dans un réseau de 22 par 14, avec un espacement de 600 μm entre elles. La conception contient également une étoile à quatre branches et une étoile à cinq branches comme fiduciaires immédiatement à l’extérieur du réseau (Figure supplémentaire 1). Exportez la conception finale sous forme de fichier STL (fichier de codage supplémentaire 1) et téléchargez le fichier dans un logiciel capable de définir les paramètres d’impression comme indiqué ci-dessous. Ensuite, enregistrez-le en tant que fichier compatible avec l’imprimante 3D (voir Tableau des matériaux).NOTE: Distance de tranchage = 5 μm, distance d’éclosion = 1 μm, contour de la coquille = 50 μm, nombre de tranches de base = 5 μm, échafaudage = creux, mode de balayage = galvo, axe z = lecteur z du microscope, vitesse de balayage = 100 000, puissance = 100. Prétraiter un substrat d’impression au silicium (voir le tableau des matériaux) à l’aide d’un procédé de nettoyage au plasma (gaz : O2 ; puissance : 200 watts ; température : 25 °C ; débit : 20 ; temps : 5 min), puis immerger immédiatement le substrat dans une solution de 30 ml d’éthanol et 60 μl de méthacrylate de 3-(triméthoxysilyle) propyle dans une boîte de Petri en verre. Couvrir de papier d’aluminium et laisser incuber pendant la nuit.REMARQUE: Cette étape augmente l’adhérence d’impression au substrat, ce qui est important lors de la séparation PDMS (étape 2.6). Téléchargez le fichier d’impression sur l’imprimante 3D multiphotonique, appliquez la résine d’impression sur le substrat traité, chargez la lentille 10x (voir Tableau des matériaux) et imprimez les microstructures. Une fois terminé, immerger l’impression dans de l’acétate d’éther méthylique de propylène glycol (voir le tableau des matières) pendant 45 min pour enlever la résine photosensible non exposée, puis plonger l’impression dans de l’alcool isopropylique pendant 5 min. Post-durcir le moule maître en l’exposant à la lumière UV à 254 nm pendant 120 min.REMARQUE: Si disponible, la lumière UV dans la gamme 405 à 365 nm peut être utilisée pendant ~ 20 minutes pour post-durcir les structures imprimées. 2. Génération de moules polydiméthylsiloxane (PDMS) Traitez la surface du moule maître imprimé en 3D en le plaçant dans une chambre à vide contenant une lame de verre contenant 40 μL de silane trichloro (1H, 1H, 2H, 2H, perfluorooctyle) (voir le tableau des matériaux) ajouté à la surface. Tirez le vide (pression relative : -20 po. Hg) pendant 1 h.REMARQUE: Cette étape assure une séparation facile lors de la démolition (étape 2.6). Pendant le traitement de la surface du moule maître, mélanger soigneusement la base du prépolymère polydiméthylsiloxane (PDMS) avec l’agent de durcissement du prépolymère PDMS dans un rapport de 9:1 en masse (au moins 10 g de matériau sont nécessaires pour chaque moule maître). Une fois bien mélangé, transférer le PDMS non durci dans un tube à centrifuger de 50 ml et centrifuger à 300 x g pendant 3 minutes à température ambiante. Une fois le traitement de surface terminé, placez le moule maître dans un plat en aluminium et versez le PDMS non durci sur le moule, en veillant à ce que les caractéristiques soient entièrement immergées. Placez le plat en aluminium dans une chambre à vide et tirez le vide (pression relative: -20 po. Hg) pendant 1 h pour éliminer les bulles d’air. Retirez le plat en papier d’aluminium de la chambre à vide. Placez des entretoises de 800 μm aux extrémités du moule maître et superposez une lame de verre propre sur le moule maître, en prenant soin d’éviter d’introduire des bulles d’air. Utilisez des pinces de liant pour serrer le moule et la glissière ensemble, en localisant la force de serrage sur les entretoises (Figure supplémentaire 2). Placer la structure dans une étuve réglée à 120 °C pendant au moins 4 h pour durcir le prépolymère dans des moules PDMS. Retirez la structure du four, relâchez délicatement les clips de liant et séparez soigneusement le moule maître du moule PDMS durci à l’aide d’une lame de rasoir.REMARQUE: Le moule maître imprimé en 3D peut être réutilisé pour générer des moules PDMS supplémentaires. 3. Fabrication de films PLGA Peser 450 mg de PLGA (voir le tableau des matériaux) et le placer sur une feuille de polymère antiadhésif de 76 mm sur 76 mm dans une cale annulaire de 250 μm d’épaisseur, d’un diamètre intérieur de 50,8 mm. Placez une deuxième feuille de polymère antiadhésive sur la PLGA et comprimez la pile entre deux blocs d’aluminium à l’aide d’une pince C de 101,6 mm jusqu’à ce qu’elle soit serrée aux doigts.NOTE: 502H PLGA a été utilisé exclusivement dans cette étude; cependant, d’autres types de PLGA sont compatibles avec ce processus. Placer l’ensemble serré en C dans une étuve à vide réglée à 120 °C pendant 30 min sous vide, avec une pression relative de -30 po.Hg. Ensuite, retirez l’ensemble et serrez fermement la pince avant de la remettre dans l’étuve à vide pendant encore 30 minutes.REMARQUE: Le but principal de l’utilisation d’un vide est d’éviter la dégradation PLGA, qui est accélérée à des températures élevées. Retirer l’ensemble du four et laisser refroidir pendant 4 h dans un dessiccateur. Une fois refroidi, desserrez la pince, retirez le film PLGA des feuilles de polymère antiadhésives et placez le film dans une boîte de Petri étiquetée. Conservez la boîte de Petri dans un dessiccateur pour une utilisation ultérieure. 4. Génération de particules PLGA Traiter la surface du moule PDMS comme décrit précédemment à l’étape 2.1. À l’aide d’une pince à épiler et/ou d’un scalpel, découpez et placez une partie du film PLGA de 250 μm, à peu près de la taille du réseau, sur le moule PDMS traité. Superposez une lame de microscope en verre propre sur le film PLGA et le moule PDMS et serrez les composants ensemble en plaçant une pince à ressort directement sur le réseau et le film PLGA. Placez le moule serré dans l’étuve à vide réglée à 120 °C et tirez le vide avec une pression relative de -30 po. Hg pendant 1 h.REMARQUE: Le temps nécessaire pour former les particules dépend de la PLGA et peut varier de 1 à 12 h. Retirez le moule serré du four et laissez-le refroidir passivement à température ambiante pendant environ 15 minutes ou jusqu’à ce qu’il refroidisse au toucher. À l’aide d’une lame de rasoir, appliquez doucement une pression entre le moule PDMS et le réseau de particules PLGA pour séparer les deux. Conservez les particules PLGA dans un dessiccateur pour une utilisation ultérieure. 5. Concentration et purification de l’antigène Décongeler une partie aliquote de l’antigène du virus RABV disponible dans le commerce (voir le tableau des matières) à température ambiante. Assemblez la configuration de filtration en plaçant deux filtres centrifuges avec une coupure de poids moléculaire de 100 kDa (MWCO; voir le tableau des matériaux) dans deux tubes de collecte. Prémouillez les deux filtres centrifuges en ajoutant 500 μL d’eau UltraPure. Faites tourner les filtres à 2 400 x g pendant 1 min dans une centrifugeuse de paillasse à température ambiante. Retirez l’eau des compartiments supérieur et inférieur de l’installation de filtration à l’aide d’une pipette de 200 μL.REMARQUE: Ne laissez pas le filtre d’essorage prémouillé sécher. Ajouter 400 μL d’eau distillée dans le compartiment supérieur de chaque filtre d’essorage, puis ajouter 100 μL de l’antigène RABV décongelé et mélanger avec la pipette.NOTE: Cette étude a concentré l’antigène environ cinq fois et réduit la concentration d’excipients <100 kDa de ~50 fois. Chargez les deux filtres centrifuges dans une centrifugeuse de paillasse, en vous assurant que les filtres font face au centre de la centrifugeuse. Marquez de quel côté du filtre fait face vers le centre de la centrifugeuse.REMARQUE: Si elles ne sont pas correctement orientées, les solutions ne seront pas correctement filtrées/concentrées. Centrifuger les filtres à 14 000 x g pendant 10 min à température ambiante. Récupérez les filtres de la centrifugeuse. Les tubes de collecte contiendront le filtrat, tandis que les filtres contiendront l’échantillon concentré (figure supplémentaire 3A). Retirer le filtrat dans les tubes de prélèvement à l’aide d’une pipette et jeter. Ajouter 450 μL d’eau distillée filtrée à chaque filtre et mélanger l’échantillon concentré et l’eau en pipetant de haut en bas six fois. Centrifuger les deux filtres d’essorage une seconde fois à 14 000 x g pendant 10 min à température ambiante. Assurez-vous que les filtres font face au centre de la centrifugeuse dans la même orientation qu’à l’étape 5.7. Récupérez les unités de filtration de la centrifugeuse et, comme précédemment, retirez et jetez le filtrat de chaque tube à l’aide d’une pipette. Retirez les filtres d’essorage des tubes de collecte et recouvrez les boîtiers filtrants à l’aide du haut des tubes de collecte (figure supplémentaire 3B). Placez le fond des boîtiers du filtre de rotation directement sur un vortex et un vortex à 3 000 tr/min pendant 30 s tout en tenant les boîtiers filtrants à la verticale et à des angles de 45° (figure supplémentaire 3C).REMARQUE : Cette étape vise à remettre en suspension tout antigène RABV qui a formé une pastille pendant le processus de centrifugation. Retirez délicatement le bouchon des tubes de collecte des boîtiers du filtre de spin. Replacez les boîtiers filtrants dans les tubes de collecte fournis et faites une rotation rapide (2-3 s) pour recueillir tout volume qui aurait pu être piégé dans le bouchon.REMARQUE: Cette rotation rapide doit être effectuée dans une microcentrifugeuse de paillasse. Les filtres doivent être tangentiels à la centrifugeuse, à l’opposé de la configuration précédente, pour s’assurer qu’aucune solution n’est perdue à travers les filtres. Retourner chaque unité de filtration à essorage dans un nouveau tube de collecte fourni avec le kit de filtre à spin (voir le tableau des matériaux) et centrifuger pendant 2 min à 1 000 x g à température ambiante pour recueillir les échantillons concentrés. Regrouper les échantillons concentrés des deux tubes de prélèvement en un seul tube de prélèvement. Mesurez et enregistrez le volume résultant.NOTE: L’échantillon résultant aura 5x la concentration initiale d’antigène que le stock, aura une petite concentration d’excipient (<100 kDa) environ 50 fois inférieure à celle du stock, et apparaîtra légèrement blanc laiteux. Le volume total devrait être d’environ 44-48 μL. Conserver l’antigène concentré 5x deux fois lavé à 4 °C jusqu’au moment de la distribution, mais pas plus de 16 h. Avant de remplir les particules avec cette solution, centrifuger le tube à 1 000 x g pendant 1 min pour éliminer les bulles. La solution peut être diluée avec de l’eau distillée pour atteindre la concentration cible nominale pour la distribution. 6. Remplissage des particules Filtrer sous vide 500 mL d’eau désionisée à travers un filtre à vide de 0,22 μm, puis dégazer la solution en appliquant un vide (pression relative : -20 po. Hg) pendant la sonication pendant 20 min. Pendant ce temps, fixez les capillaires de distribution piézoélectrique (PDC; voir le tableau des matériaux) au distributeur piézoélectrique. Amorcez la machine conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux) et placez la lame contenant les particules PLGA dans la zone de distribution. Configurez le « Find Target Reference Points », Run, puis configurez le « Target Substrate », conformément à la figure supplémentaire 4. Chargez 25 μL de l’antigène concentré dans la plaque source et chargez-le dans la machine. À l’aide des PDC, aspirer 10 μL d’antigène concentré dans l’embout de distribution, laver l’extérieur de l’embout, puis calibrer l’alignement de distribution (figure supplémentaire 5). Entrez « Paramètres de configuration cible » et cliquez sur Exécuter (Figure 6 supplémentaire). Une fois terminé, retirez les particules remplies et vérifiez qu’elles sont remplies sous un stéréoscope. Passez directement à l’étape suivante du protocole. 7. Scellement et récolte des particules Placez un bloc d’acier inoxydable (voir le tableau des matériaux) sur une plaque chauffante. Placez deux lames de microscope sur le bloc d’acier inoxydable afin qu’elles soient parallèles. Assurez-vous que le bloc d’acier inoxydable est de niveau, puis allumez la plaque chauffante et réglez la température de sorte que la température de surface de l’acier inoxydable soit de 200 °C. Vérifiez la température de la plaque chauffante avant de la sceller. Suspendez les particules PLGA remplies au-dessus de la plaque chauffante en les plaçant sur les deux lames de verre, puis démarrez immédiatement une minuterie pendant 18 s.REMARQUE: Le temps et la chaleur nécessaires aux particules pour sceller varient en fonction des propriétés chimiques de la PLGA utilisée pour fabriquer les particules. Un support de diapositive personnalisé imprimé en 3D peut être utilisé pour manipuler les diapositives à une distance de sécurité de la plaque chauffante. Le fichier STL est fourni en tant que fichier de codage supplémentaire 2. Une fois scellé, retirez le réseau de particules de la plaque chauffante et suspendez-le au-dessus de la paillasse de laboratoire en plaçant le réseau de particules sur deux lames de verre distinctes. Laisser refroidir les particules pendant 1 min. Une fois refroidies, les particules peuvent être récoltées à l’aide d’un scalpel tout en regardant à travers un stéréoscope. Tenez le scalpel avec la lame à un angle de 45° par rapport à la lame et appliquez une pression sur la base de la particule pour la séparer de la lame de verre. Une fois récolté, utilisez le scalpel pour transférer les particules dans des tubes de liaison à faible teneur en protéines de 0,5 mL (voir le tableau des matériaux). Ensuite, remplissez les tubes avec 250 μL d’une solution tampon phosphate (PBS) 1x contenant 30 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) et 1 mg/mL de glucose.REMARQUE : La solution de BSA à 30 mg/mL et de glucose à 1 mg/mL préparée dans du PBS maintiendra la stabilité de l’antigène du RABV. Écrasez les particules sous un stéréoscope à l’aide d’une paire de pincettes à pointe fine. Assurez-vous que l’antigène RABV dans le noyau de la particule est disponible pour être dissous dans la solution environnante. Conservez les échantillons dans un réfrigérateur à 4 °C jusqu’à ce que la puissance antigénique puisse être évaluée à l’aide d’un ELISA. Les échantillons doivent être effectués sur un ELSIA dans les 7 jours suivant la préparation. 8. Évaluation de l’antigène par ELISA ATTENTION : Ne laissez jamais sécher les microplaques. Toujours empiler les assiettes et toujours couvrir la plaque supérieure avec un joint en plastique, une assiette vide ou un couvercle pour éviter le dessèchement. Préparez les tampons comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1. Préparer 5 mL de solution d’enrobage (tampon carbonate-bicarbonate, pH 9,6) à une concentration de 2,5 μg/mL en ajoutant 25 μL d’anticorps d’enrobage à 4975 μL de tampon d’enrobage à pH 9,4-9,6.REMARQUE: 5 mL sont nécessaires pour recouvrir 96 puits de 50 μL chacun (avec un volume supplémentaire pour la perte de pipetage). Augmenter le volume total de 5 mL pour chaque plaque ELISA supplémentaire nécessaire. Utilisez une pipette multicanal pour distribuer 50 μL de la solution de revêtement dans chaque puits de la microplaque. La solution doit être utilisée pour le revêtement immédiatement après sa préparation. Tapotez doucement le long des bords de la plaque sur une paume gantée pour vous assurer que le fond de chaque puits est uniformément recouvert de liquide. Scellez la plaque avec un film adhésif et placez-la à 37 °C pendant 1 h, puis transférez à 4 °C pendant une nuit. Récupérez les plaques de l’entrepôt frigorifique et lavez-les trois fois avec 200 μL de tampon de lavage dans chaque puits. Retirez le tampon de lavage et distribuez 300 μL de tampon de blocage dans chaque puits.ATTENTION : Lorsque vous exécutez plusieurs plaques avec les mêmes échantillons répétés sur différentes plaques, il est important de procéder plaque par plaque (c.-à-d. remplir la plaque 1 avec le matériau avant de passer à la plaque 2, puis à la plaque 3 et ainsi de suite). N’appliquez pas le matériau X sur toutes les plaques, puis sur le matériau Y, etc., car cela augmenterait le risque d’assèchement des puits. Après la dernière étape de lavage, le tampon de lavage doit rester dans les puits de la plaque et n’être jeté qu’immédiatement avant d’ajouter des échantillons à la plaque. Un couvercle en plastique de plaque de 96 puits doit être utilisé pour couvrir tous les puits de la plaque ELISA qui ne sont pas distribués immédiatement, et le couvercle doit être déplacé séquentiellement pour révéler des puits supplémentaires à remplir de matériau. Scellez les plaques avec un film plastique adhésif (voir Tableau des matériaux) et placez-les dans un incubateur pendant 60 ± 5 min à 37 ± 2 °C. Préparer la courbe standard et les échantillons d’essai à évaluer au cours de cette incubation.NOTA : L’antigène évalué doit être prédilué dans un tampon de diluant à une dilution recommandée de 0,125 UI/mL, avec un volume excédentaire d’au moins 40 μL pour tenir compte de la perte par pipetage. Tous les échantillons sont évalués en double (deux répétitions techniques) sur chaque plaque ELISA. Pour la courbe standard, une double série de dilution pour un total de huit points doit être incluse dans les colonnes 2 et 3 de chaque plaque ELISA. Une série de dilutions peut être effectuée pour tous les autres échantillons avec un nombre approprié de points en fonction de la quantité prévue d’antigène évaluée. Bien que moins rigoureuse pour un débit plus élevé, une dilution d’un seul échantillon peut être utilisée comme alternative au placage décrit ci-dessus. Toutefois, la concentration attendue d’une seule dilution doit se situer dans la plage de courbe standard. Dans les plaques à 96 puits à faible liaison, ou dans les tubes à protéines à faible liaison (voir le tableau des matériaux), effectuer une double série de dilution de chaque échantillon le long des colonnes de la plaque. Charger le début de la série de dilution de la ligne A pour chaque échantillon respectif au double du volume final requis (par tôle, 100 μL d’échantillon sont nécessaires par puits, de sorte que tous les puits de A2-A11 devraient contenir au moins 240 μL d’un échantillon, avec un volume supplémentaire de 40 μL pour tenir compte de la perte par pipetage). Charger 120 μL de tampon de diluant dans tous les autres puits de la plaque protéique à faible liaison, à l’exclusion des colonnes 1 et 12 (c.-à-d. B2 à H11). À l’aide d’une pipette multicanal chargée de 10 pointes, effectuer une dilution en série en transférant 120 μL d’échantillon de A2-A11 à B2-B11 et en pipetant de haut en bas plusieurs fois pour mélanger tout en évitant les éclaboussures et les bulles. Répétez ce processus en descendant la plaque le long des colonnes jusqu’aux puits H2-H11. Jetez les 120 μL restants aspirés de la dernière rangée de puits.REMARQUE : Les échantillons sont maintenant prêts pour l’analyse. Si la phase de blocage n’est pas terminée à ce moment-là, assurez-vous que les échantillons sont conservés sur la glace. À la fin de l’étape d’incubation, laver les plaques trois fois avec 200 μL de tampon de lavage. À l’aide d’une pipette multicanal, transférer 100 μL de tampon de diluant dans les colonnes 1 et 12 en tant qu’« ébauches ». À l’aide d’une pipette multicanaux, transférer 100 μL de chaque puits de la plaque à faible teneur en protéines à 96 puits contenant des dilutions d’échantillons sur la plaque ELISA lavée. Répétez l’opération pour toutes les plaques ELISA en cours d’exécution. Scellez les plaques avec un film plastique adhésif et placez-les dans un incubateur pendant 60 ± 5 min à 37 ± 2 °C. Préparer la solution d’anticorps de détection (voir le tableau des matières) à une concentration de 0,2 μg/mL en ajoutant 4,4 μL de la solution d’anticorps à 10 995,6 μL du tampon de diluant et bien mélanger en pipetant de haut en bas.REMARQUE : Un total de 11 mL est nécessaire pour 96 puits de 100 μL chacun (avec un volume supplémentaire pour les pertes par pipetage). Augmenter le volume total de 11 mL pour chaque plaque ELISA supplémentaire évaluée. La solution doit être utilisée immédiatement après la préparation. À la fin de l’étape d’incubation, laver les plaques cinq fois avec 200 μL de tampon de lavage. Aspirer le tampon de lavage restant et distribuer 100 μL de la solution d’anticorps de détection dans chaque puits de la microplaque à l’aide d’une pipette multicanal. Scellez les plaques avec un film plastique adhésif et placez-les dans un incubateur pendant 60 ± 5 min à 37 ± 2 °C. Préparer le conjugué vers la fin de l’étape d’incubation des anticorps de détection en ajoutant 4,4 μL de solution conjuguée streptavidine-peroxydase (voir le tableau des matières) à 10 995,6 μL de tampon de lavage.REMARQUE : Un total de 11 mL est nécessaire pour 96 puits de 100 μL chacun (avec un volume supplémentaire pour le pipetage multicanal). Augmenter le volume total de 11 mL pour chaque plaque ELISA supplémentaire évaluée. Lavez les plaques cinq fois avec 200 μL de tampon de lavage. Aspirer le tampon de lavage restant et distribuer 100 μL de la solution conjuguée dans chaque puits. Scellez les plaques avec un film plastique adhésif et placez-les dans un incubateur à 37 °C pendant 60 ± 5 min à 37 ± 2 °C. Préparer le substrat lors de la dernière étape de lavage conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Pour chaque plaque, dissoudre un comprimé de dichlorhydrate d’o-phénylènediamine (OPD; voir le tableau des matières) dans 9 mL d’eau désionisée dans l’obscurité, puis compléter avec 1 mL de tampon de peroxyde stable 10x. Ajuster le nombre de comprimés et le volume total de solution (10 mL) en fonction du nombre de plaques évaluées. Lavez les plaques cinq fois avec 200 μL de tampon de lavage. Distribuer 100 μL du substrat à chaque puits à l’aide d’une pipette multicanal. Scellez les plaques avec un film plastique adhésif et laissez-les sur le banc pendant 10-20 min, à l’abri de la lumière, en utilisant du papier d’aluminium.REMARQUE: Surveillez visuellement le développement des couleurs pour éviter la saturation. Ajouter 50 μL de solution stop à chaque puits et la plaque de lecture immédiatement pour obtenir une absorbance à 492 nm et une absorbance de référence de 620 nm. Analyser les données en utilisant la lecture d’absorbance corrigée (lecture à 492 nm moins la lecture à 620 nm) et soustraire la moyenne de l’blanc de tous les échantillons. Utiliser une méthode d’interpolation sigmoïde 4PL pour convertir les valeurs d’absorbance en UI/mL. Enfin, multipliez par les 250 μL (volume total de l’échantillon) pour convertir en UI.REMARQUE: Cette analyse peut être effectuée à l’aide d’un logiciel d’analyse de données.

Representative Results

Le scellage et le remplissage des particules sont deux des étapes les plus critiques de ce protocole. Les particules ont été remplies de sel de sodium fluorescéine pour démontrer un remplissage idéal et certaines erreurs courantes. Le sel de fluorescéine sodique a été utilisé à la place de l’antigène RABV pour faciliter la visualisation. Pendant le remplissage, il est important de distribuer la solution dans le fond des noyaux de particules, puis de laisser suffisamment de temps pour que le solvant / l’eau s’évapore. Une fois terminé, un dépôt du soluté reste dans le fond du noyau de particules (Figure 1A). Une fois remplies, il est essentiel de sceller correctement les particules. La figure 1B illustre plusieurs résultats (réussis et infructueux) du processus de scellement. Après 12 s de temps de scellage, une voie distincte reste du centre de la particule vers l’extérieur de la particule, démontrant une particule qui n’est pas entièrement scellée. Inversement, si on le laisse sceller pendant 36 s, le PLGA fond presque entièrement, ce qui donne une microstructure au profil peu profond. La morphologie idéale peut être visualisée lorsque les particules sont scellées pendant 18 et 24 s, car elles contiennent une cargaison entièrement encapsulée par le polymère tout en conservant une structure particulaire. La figure 1C illustre plusieurs résultats potentiels après le remplissage et le scellage. Pendant la distribution, si le solvant n’atteint pas le fond de la particule, il laisse le soluté séché au milieu du noyau de particules (mal rempli); Bien que ces particules puissent encore sceller, le mauvais chargement de la cargaison peut limiter l’efficacité du chargement. Si les particules sont remplies de trop de cargaison (trop remplie), le processus d’étanchéité est inhibé, car la cargaison empêche la PLGA de s’écouler sur l’ouverture. Lorsqu’elles sont correctement remplies et scellées, les particules de cette géométrie sont suffisamment petites pour tenir facilement dans une aiguille de 19 G. De plus, 10 particules circulaient constamment à travers une aiguille de 19 G (100 % ± 0 %) lorsqu’on leur injectait une solution visqueuse telle que la carboxyméthylcellulose à 2 % (figure supplémentaire 7). Figure 1 : Problèmes courants avec le processus de remplissage et d’étanchéité. (A) Les images montrent l’évaporation du solvant après un cycle de remplissage, où les particules sont chargées de 6 nL de sel de fluorescéine sodique à 100 mg/mL dissous dans l’eau. (B) Images représentatives de particules PLGA 502H retirées du processus d’étanchéité à 0, 12, 18, 24 et 36 s. (C) Résultats différents du processus de scellage lorsque les particules sont remplies correctement, incorrectement ou surchargées. Les images sont générées en empilant plusieurs images et en les fusionnant à l’aide d’un logiciel d’empilement de mise au point. Barre d’échelle = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Le traitement de l’antigène à travers un filtre de spin avant de le charger dans les particules est important pour deux raisons. Tout d’abord, la centrifugation sert à éliminer les excipients mères dans la solution vaccinale, ce qui peut limiter la capacité de chargement des particules tout en conservant l’antigène RABV. Le protocole actuel purifie l’antigène d’environ 50 fois. Deuxièmement, l’antigène est également concentré au cours de ce processus. La figure 2A montre une micrographie des virions intacts du virus RABV dans l’échantillon d’antigène concentré. Cet antigène est environ 4,4 fois plus concentré que la solution mère de départ (figure 2B). La quantité d’antigène initialement chargée dans les filtres centrifuges peut être modifiée pour moduler la concentration finale de pli atteinte. Par exemple, une charge de 40 μL d’antigène stock donne une concentration d’environ 1,75 fois. La figure supplémentaire 8 démontre l’importance du vortex (étape 5.15) dans le processus de concentration. Négliger de vortex ou vortex inapproprié les échantillons limite le processus de concentration. Figure 2 : Concentration d’antigène. Concentration d’antigène par filtration centrifuge démontrée par microscopie électronique à transmission (A) et confirmée par ELISA (B). Les barres d’erreur indiquent l’écart type. L’analyse statistique est effectuée à l’aide des multiples tests de comparaison de Tukey avec l’ANOVA unidirectionnelle. **p < 0,01, ****p < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. La figure 3A représente l’antigène concentré rempli en particules non scellées et scellées. Bien qu’une quantité importante d’antigène soit chargée dans les particules (0,0469 ± 0,0086 UI), ce matériau représente <90% de la capacité des particules, laissant suffisamment d’espace pour le chargement d’antigènes supplémentaires. Fait intéressant, les particules non scellées ne contiennent que 0,0396 ± 0,0077 UI, ne comprenant que 85% ± 16% de la quantité totale chargée. Bien qu’il s’agisse d’une perte statistiquement non significative, une partie de l’antigène RABV peut s’être dénaturée lors de la réhydratation et du séchage répétés dans le processus de remplissage. Après scellement, 69% ± 5% de l’antigène reste encapsulé sous une forme bioactive. Bien que cela suggère qu’une perte importante se produit pendant le processus d’étanchéité en raison du stress thermique, la majeure partie de l’antigène viral inactivé reste intacte (Figure 3B). La co-encapsulation d’excipients stabilisateurs avec l’antigène est une stratégie possible pour augmenter davantage la stabilité de l’antigène tout au long du processus de fabrication, et a déjà été couronnée de succès avec d’autres antigènes de virus inactivés14,15. Figure 3 : Antigène bioactif du RABV après fabrication des particules. (A) Les images montrent des particules non scellées et scellées contenant l’antigène RABV. (B) Stabilité de l’antigène par le procédé de fabrication des particules (n = 4). Le contrôle de la charge est généré en distribuant l’antigène directement dans la solution. Les barres d’erreur indiquent l’écart type. Barre d’échelle = 200 μm. L’analyse statistique est effectuée à l’aide des multiples tests de comparaison de Tukey avec l’ANOVA unidirectionnelle. *p < 0,05. Les images sont générées en empilant plusieurs images et en les fusionnant à l’aide d’un logiciel d’empilement de mise au point. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure supplémentaire 1 : Dimensions des particules, des fiduciaires et des réseaux. La figure montre les propriétés géométriques de l’étoile fiduciale à quatre branches (A), de la microparticule cylindrique (B), de l’étoile fiduciale à cinq branches (C) et d’un réseau de particules avec fiduciaires (D) affichées dans le logiciel de CAO. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Figure supplémentaire 2 : Cette figure montre une coupe transversale de la structure placée dans le four pour durcir les moules PDMS. Les flèches indiquent où les pinces de liant sont appliquées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Figure supplémentaire 3 : Technique appropriée pour récupérer efficacement l’antigène concentré. À la fin du premier essorage, l’échantillon concentré entouré en rouge (A) est retenu dans le filtre, tandis que le filtrat est recueilli dans le fond du tube de collecte (tube extérieur plus grand). Pour remettre en suspension l’antigène granulé, l’unité de filtration centrifuge est recouverte à l’aide du tube de collecte (B) en préparation du vortex. Lors du tourbillon, l’extrémité du tube est maintenue en contact avec le tampon vortex et l’extrémité du bouchon tourne tout en maintenant un angle de 45° avec le tampon vortex (C). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Figure supplémentaire 4 : Distributeur piézoélectrique à programmation préliminaire. (A) Configurez la fonction « Trouver des points de référence cibles » en naviguant de l’onglet « Principal » vers la fonction Configuration du robot > Divers >Div. > Trouver des points de référence cibles. Utilisez les boutons surlignés en bleu pour définir les marques fiduciaires. Tout d’abord, sélectionnez Apprendre le modèle et dessinez une boîte autour de la marque fiduciaire d’intérêt, vérifiez l’exactitude du modèle en cliquant sur Modèle de recherche et enregistrez le modèle. Procédez ainsi pour les étoiles à quatre et cinq branches et enregistrez les noms de fichiers conformément aux instructions sous Utiliser deux images de modèle différentes. Ensuite, assurez-vous que tous les paramètres des boîtes noires correspondent. Chargez le fiducial en étoile à quatre branches à l’aide du modèle de chargement (boîte verte). Enregistrez le programme « Trouver des points de référence cibles » en sélectionnant Liste des tâches (case orange). (B) Configurez l’exécution en accédant à l’onglet Configuration > tâches du robot, puis chargez la séquence de tâches affichée dans la zone bleue en ajoutant des tâches de la liste des tâches (boîte noire) à l’aide de la tâche dans Sélections d’exécution (boîte verte). Enfin, enregistrez la tâche (boîte orange). (C) Configurez le « substrat cible » en accédant à la configuration du robot > au substrat cible, puis ajoutez une cible (boîte bleue). (D) Entrez les paramètres affichés ici et sélectionnez Enregistrer (case bleue). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Figure supplémentaire 5 : Alignement de l’antigène de charge et de l’étalonnage des dépenses. (A) Accédez à l’onglet Nozzle Setup > Do Task et aspirez 10 μL de l’antigène dans l’embout de distribution en sélectionnant TakeProbe10 uL (boîte noire) et en cliquant sur DO (boîte noire). (B) Une fenêtre distincte s’ouvre. Sélectionnez le puits dans lequel l’antigène concentré a été chargé et sélectionnez OK (case bleue). (C) Une fois l’antigène aspiré, laver l’embout en sélectionnant la case bleue et répéter ce lavage deux fois de plus. Sélectionnez la caméra (boîte noire) et déterminez le volume de chute en sélectionnant Volume de chute (case verte). Assurez-vous qu’une goutte stable se forme avec un écart type de volume (%) <2 (case orange). (D) En suivant ces étapes, la Snap Drop Cam s’ouvrira; sélectionnez Image (boîte bleue) dans le menu déroulant et sélectionnez Nozzle Head Camera Wizard. Une nouvelle fenêtre s’ouvre. Effectuez rapidement la séquence d’étapes suivante. (E) Assurez-vous que la cible établie dans la figure supplémentaire 4 est chargée, puis sélectionnez Déplacer vers la cible (case bleue). Ajustez les gouttes à 15 et sélectionnez Spot (boîte noire). Une fois repéré, sélectionnez immédiatement Déplacer (case verte). Assurez-vous que la recherche automatique est sélectionnée et supprimez la taille des particules = 12, puis cliquez sur Démarrer (cases orange). Si la détection automatique échoue, répétez ce processus après avoir déplacé vers une autre zone de la diapositive (boîte violette). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Figure supplémentaire 6 : Programmation du réseau de repérage et début de l’exécution. (A) Accédez à la configuration de la cible > cible, puis remplissez les paramètres indiqués dans la case bleue. (B) Ensuite, accédez à l’onglet « Configuration du champ » et entrez 20 dans le no. (boîte bleue), sélectionnez un puits (boîte noire), puis sélectionnez les cibles/particules à distribuer (boîte verte). En sélectionnant un puits différent et en resélectionnant les cibles/particules, des cycles de remplissage supplémentaires sont effectués au cours d’un seul passage. (C) Sur l’écran principal, assurez-vous que l’exécution et la cible créées dans la figure supplémentaire 5 sont sélectionnées. (D) Accédez à l’onglet « Exécuter » et sélectionnez Démarrer l’exécution (boîte bleue). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Figure supplémentaire 7 : Injectabilité des microparticules. (A-C) Images stéréoscopiques empilées de microparticules remplies de sel de fluorescéine sodique et scellées dans une aiguille de 19 G. (D) Au total, 10 particules ont été injectées à l’aide d’une aiguille de 19 G à l’aide d’une solution de carboxyméthylcellulose à 2 % (n = 8). Barre d’échelle = 1 mm. Les barres d’erreur indiquent l’écart type. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Figure supplémentaire 8 : Problèmes potentiels liés à la concentration d’antigène. La ligne rouge indique l’augmentation attendue de la concentration. Les barres d’erreur indiquent l’écart type. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide des multiples tests de comparaison de Tukey avec l’ANOVA unidirectionnelle. p < 0,001, ****p < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Dossier complémentaire 1 : Préparation des tampons et des solutions pour RABV ELISA. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Fichier de codage supplémentaire 1 : fichier STL contenant un réseau de particules. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Fichier de codage supplémentaire 2 : fichier STL contenant la géométrie du porte-lames personnalisé utilisé pour sceller les particules. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Il est possible de modifier la géométrie des particules pour des besoins spécifiques; Cependant, pour les structures cylindriques, les auteurs recommandent de maintenir un rapport de 5:4:1 de la hauteur:diamètre:épaisseur de paroi décrit dans le protocole. Ce rapport hauteur / largeur garantit que suffisamment de matériau PLGA est présent pour sceller les particules et rester mécaniquement suffisamment robuste pour la manipulation. Les dimensions et les formes des particules peuvent facilement être modifiées au cours du processus de CAO, ce qui permet de générer une myriade de géométries. La combinaison de la flexibilité de la CAO avec l’impression 3D permet l’itération rapide des conceptions de microparticules. Bien que ce protocole utilise une imprimante 3D multiphotonique, toute imprimante 3D avec des spécifications capables d’imprimer les dimensions de la microstructure dans un matériau approprié peut être utilisée pour générer le moule maître initial. En outre, la photolithographie a déjà été utilisée pour fabriquer des structures similaires dans des réseaux beaucoup plus grands que ceux produits dans ce protocole; Cependant, la main-d’œuvre, le retard dans la commande de masques photo sur mesure et l’accessibilité de l’équipement ralentiraient le processus de conception itératif16. Enfin, la génération de moules maîtres peut être sous-traitée à des entreprises rémunérées à l’acte si la fabrication interne du moule maître n’est pas réalisable. Quelle que soit l’imprimante 3D ou la méthode utilisée pour générer les moules maîtres, l’adhérence de l’impression au substrat est essentielle pour les étapes en aval. Plus précisément, si l’adhérence est insuffisante pendant la génération du moule PDMS, les particules imprimées resteront logées dans le moule PDMS, nécessitant le retrait manuel des particules imprimées et la destruction du moule maître.

Le remplissage des particules est un autre aspect critique à considérer. Les microparticules ont des capacités de remplissage limitées, de sorte que la filtration est utilisée non seulement pour concentrer l’antigène RABV, mais aussi pour éliminer les excipients mères qui occuperaient autrement une grande partie du volume du cœur des microparticules. Cependant, étant donné la grande taille de l’antigène RABV (environ 60 nm par 180 nm)17, il est possible d’éliminer partiellement l’antigène pendant les étapes de centrifugation. Pour cette raison, il est important de remettre l’antigène en suspension par pipetage ou vortex après centrifugation pour obtenir une récupération élevée de l’antigène RABV. Une solution hautement concentrée est idéale pour la distribution, car elle réduit les cycles de distribution et limite ainsi la dégradation de l’antigène pendant le remplissage. Cependant, la viscosité est une limitation majeure des robots de distribution piézoélectriques formant une goutte stable, de sorte que la distribution d’une solution à très forte concentration peut ne pas être possible ou conseillée. La dilution de la solution de remplissage est le moyen le plus simple d’obtenir une formation de gouttes stable, mais la stabilité de l’antigène au cours des cycles de remplissage supplémentaires nécessaires pour atteindre la charge souhaitée et le temps plus long nécessaire pour remplir les particules doivent être pris en compte.

Limitations
Cette méthode nécessite un équipement hautement spécialisé pour produire les moules initiaux et un instrument de remplissage spécialisé pour la production de microparticules. Bien que le besoin d’une imprimante 3D avec une résolution d’impression capable de générer les moules maîtres initiaux puisse être subverti par une approche de paiement à l’acte, l’accessibilité à un robot de distribution piézoélectrique est limitée. L’acquisition d’un robot de distribution piézoélectrique nécessite un investissement initial important, souvent de l’ordre de 80 000 $ à 200 000 $, selon la marque, le débit et les capacités. Bien que plusieurs autres méthodes de remplissage soient des alternatives potentielles, ces méthodes n’ont pas été validées à l’aide de l’antigèneRABV 12.

Applications futures
Une proportion importante de l’antigène encapsulé du virus RABV est restée stable tout au long du processus d’étanchéité. En théorie, en incorporant cet antigène dans des particules composées de différents types de PLGA qui imitent le calendrier d’administration du traitement prophylactique post-exposition, toutes les doses pourraient être administrées en une seule injection. L’élimination de la nécessité de répéter les visites à l’hôpital pour administrer des doses supplémentaires améliorera l’observance du traitement, ce qui se traduira par de meilleurs résultats de traitement. De plus, après avoir démontré la capacité de conserver la réactivité ELISA du virus de la rage inactivé très complexe, il est probable que d’autres antigènes, y compris les vaccins sous-unitaires, seraient compatibles avec cette méthode d’encapsulation. L’utilisation d’autres antigènes prophylactiques avec des microparticules PULSÉES pourrait sauver des millions de vies dans les PRFI en augmentant les taux de vaccination des populations sous-vaccinées. Pour ce faire, cependant, les vaccins doivent rester stables non seulement par encapsulation, mais aussi par libération, ce qui peut être difficile car la charge utile sera soumise à des températures élevées et à un microenvironnement potentiellement acide en raison de la chaleur corporelle et des produits de dégradation PLGA18. Les travaux futurs poursuivront des stratégies de stabilisation de l’antigène par la libération, ce qui ouvrirait la voie à une plateforme de vaccination par injection unique largement applicable à la prévention de nombreuses maladies infectieuses.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Chiron Behring et Bharat Biotech International d’avoir fourni à Particles for Humanity l’antigène RABV. Nous tenons également à remercier Charles Rupprecht, VMD, MS, PhD., pour ses précieux conseils et ses contributions techniques. Les auteurs tiennent à remercier la Dre Rebecca Richards-Kortum pour sa générosité d’avoir permis l’utilisation de son appareil de distribution de picoliter SciFLEXARRAYER S3 et les instructions de la Dre Chelsey Smith sur l’utilisation de l’appareil. Nous remercions également la Chan Medical School de l’Université du Massachusetts d’avoir généré des images microscopiques de l’antigène de la rage. Enfin, nous remercions Don Chickering et Erin Euliano d’avoir examiné le document avant sa soumission. Ce travail a été soutenu par une subvention (INV-004360) de la Fondation Bill et Melinda Gates.

Materials

0.22 µm PES filter Cole-Parmer+B4B2:B63 04396-26
0.25 mm Shims McMaster Carr 98090A935
0.75 inch Binder Clips Staples 480114
10 mL Syringe Becton, Dickinson and Company 309604
10 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe Fisherbrand 13-678-11E
101.6 mm C-Clamp Amazon PT-SD-CP01A Black handle will eventually fall off. Use pliers to adjust once this happens.
19 G needle EXCELINT 26438
25 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe Fisherbrand 13-678-11
3-(Trimethoxysilyl) Propyl Methacrylate  Millipore Sigma M6514-25ML
5 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe Eppendorf 22431081
50 mL Centrifuge Tubes Corning  352098
50 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe Fisherbrand 13-678-11F
Acetone Fisher AC268310010
Aluminum Block McMaster Carr 9057K175
Aluminum Foil VWR 89079-069
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters, 100 kDa Millipore Sigma C82301
Anti-Rabies Virus Antibody, Serum Free Antibody, clone 1112-1, 100 Fisherbrand 13-678-11D
Anti-Rabies Virus Mouse Monoclonal Antibody, Clone D1-25, biotinylated Fisherbrand 14-388-100
Carboxymethyl Cellulose Tokyo Chemical Industries C0045
ClipTip 300, Filter, Racked Fisherbrand 13-678-11
Costar 0.65 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube Corning  3206
Costar 1.7 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube Corning  3207
Describe Nanoscribe Software used to define the printing parameters for Nanoscribe 3D printer is step 1.2.
Software provided with the printer.
Desiccator Fisher Scientific 10529901 Or equivalent
Double-Sided Tape Staples 649280
DPBS (10x), No Calcium, No Magnesium Gibco 14200075
Ethanol VWR 89370-084
F1-ClipTip Multichannel Pipettes, 30 to 300 µL Fisherbrand 13-678-11E
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 0.1 – 10 µL Fisherbrand 13-678-11F
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 100 – 1000 µL Fisherbrand 03-448-17
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 2 – 20 µL Fisherbrand FB14955202
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 20 – 200 µL Fisherbrand 13-374-10
Fisherbrand Elite Pipette Kit Fisherbrand 05-408-137
Fisherbrand Pipet Controller  Fisherbrand FB14955202
Glass Petri Dish, 90 mm VWR 470313-346
Glass Slides Globe Scientific 1380-10
Helicon Focus 8 HeliconSoft Software used to focus stack images
IP-Q Resin Nanoscribe Printer resin is compatable with the 10x lens and is used for printing large microstructures on the Nanoscribe Photonic Professional GT2
Lascar EL-USB-TC-LCD Thermocouple Amazon 5053485896236 Or equivalent
Microscope Slide Box Millipore Sigma Z374385-1EA Or equivalent
Nanoscribe Photonic Professional GT2 with 10X Objective Nanoscribe
NanoWrite Nanoscribe Software used to interface with nanoscrive 3D printer.
Software provided with printer.
Nunc MaxiSorp Flat-Bottom 96-well Plate Invitrogen 44-2404-21
OPD Substrate Tablets (o-Phenylenediamine Dihydrochloride) Fisherbrand 02-707-432
Parafilm M Wrapping Film, 4 in. Fisherbrand 13-374-10
PDC 60 with Type 3 Coating Scienion P-2020
PDMS Particle Molds Rice University n/a N/A- Particles are 400 μm in diameter with a wall thickness of 100 μm, and a height of 500 μm, resulting in an inner diameter of 200 μm. The arrays are 14 x 22 particles spaced 600 μm apart from each other. 4- and 5-point stars are used as fiducials, positioned 600 μm to the right and left of the top right and top left particles on the array.
Petri Dish Fisher Scientific 08-757-100D
Pierce Stable Peroxide Substrate Buffer (10x) Fisherbrand 02-707-430
Plastic Cups Fisher Scientific S04170
PLGA Film, 502H Sigma 502H: 719897-1G
Propylene Glycol Monomethyl Ether Acetate Millipore Sigma 484431
Rabies Antigen Chiron Behring and Bharat Biotech International Material was acquired by entering into a materials transfer agreement with the company.
Razor Blades VWR 55411-050
Scalpel VWR 21899-530 and 76457-512
SciFLEXARRAYER S3 with PCD 60 Scienion Or equivalent
Sealing Tape for 96-Well Plates Thermo Scientific 15036
Silicon Wafer University Wafer 1025
Spring Clamps IRWIN VGP58100
Stainless Steel Block McMaster Carr 9083K12
Streptavidin−Peroxidase Polymer, Ultrasensitive Fisherbrand 02-707-404
Sylgard 184 DOW 2646340
Teflon Sheet McMaster Carr 9266K12 Used to make PLGA films. Must be cut into appropriately sized pieces.
Teflon Sheet, 0.8 mm-thick McMaster Carr 9266K81
Trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyl) Silane Sigma 448931-10G
Tweezers  Pixnor ESD-16
UltraPure Distilled Water Fisher Scientific 10977015
UV Oven, CL-1000S UV Crosslinker UVP 95-0174-01 Or equivalent
Vacuum Desiccator Bel-Art F420100000 Note you will need two of these. One will be used exclusively to pre-treat samples with trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane to prevent contamination.
Vacuum Oven Capable of Reaching 120 °C VWR 97027-664 Or equivalent
Vacuum, CRVpro4  Welch 3041-01 Or equivalent
Wooden Tongue Depressors Electron Microscopy Sciences 72320
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References

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Graf, T. P., Kadasia, K., Melhorn, S., Kessler, E., Yang, H., Baryakova, T., Brady, S., McHugh, K. J. Fabrication of Pulsatile Polymeric Microparticles Encapsulating Rabies Antigen. J. Vis. Exp. (195), e65147, doi:10.3791/65147 (2023).
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