Formulación y caracterización de nanodiscos que contienen agentes bioactivos

Las lipoproteínas discoidales de alta densidad (HDL) nacientes son progenitores naturales del HDL esférico mucho más abundante presente en el sistema circulatorio humano. Estas partículas nacientes, también denominadas pre-ß HDL, poseen propiedades estructurales únicas y distintivas¹. De hecho, en lugar de existir como una partícula esferoidal, las HDL nacientes tienen forma de disco. Extensos estudios de caracterización estructural en HDL discoidales naturales y reconstituidas han revelado que están compuestas por una bicapa de fosfolípidos cuyo perímetro está circunscrito por una apolipoproteína anfipática intercambiable (apo), como apoA-I. En el metabolismo de las lipoproteínas humanas, las HDL nacientes circulantes acumulan lípidos de las células periféricas y maduran en HDL esféricas en un proceso que depende de mediadores de proteínas clave, incluido el transportador de casete de unión a ATP A1 y la lecitina: aciltransfersa^{de colesterol 2}. Este proceso representa un componente crítico de la vía de transporte inverso del colesterol que se considera protector contra las enfermedades del corazón. Armados con este conocimiento y la capacidad de reconstituir HDL discoidales, los investigadores han empleado estas partículas como una intervención terapéutica para tratar la aterosclerosis³. En esencia, la infusión de HDL reconstituido (rHDL) en pacientes promueve el flujo de colesterol de los depósitos de placa y lo devuelve al hígado para su conversión en ácidos biliares y excreción del cuerpo. Varias empresas biotecnológicas/farmacéuticas están aplicando esta estrategia de tratamiento⁴.

Al mismo tiempo, la capacidad de generar estas partículas en el laboratorio ha provocado una ráfaga de actividades de investigación que ha llevado a nuevas aplicaciones y nuevas tecnologías. Una aplicación destacada implica el uso de partículas de rHDL como una membrana en miniatura para albergar proteínas transmembrana en un ambiente nativo⁵. Hasta la fecha, cientos de proteínas se han incorporado con éxito en la rHDL discoidal, y la investigación ha demostrado que estas proteínas conservan tanto la conformación nativa como la actividad biológica como receptores, enzimas, transportadores, etc. Estas partículas, denominadas “nanodiscos”, también han demostrado ser susceptibles de caracterización estructural, a menudo a alta resolución⁶. Este enfoque para las investigaciones de proteínas transmembrana se reconoce como superior a los estudios con micelas detergentes o liposomas y, como resultado, está avanzando rápidamente. Es importante reconocer que se han reportado dos métodos distintos que son capaces de formar una rHDL. El método de “diálisis de colato”¹³ es popular para aplicaciones relacionadas con la incorporación de proteínas transmembrana en la bicapa⁵ de rHDL. Esencialmente, este método de formulación implica mezclar una bicapa formando fosfolípido, una proteína de andamio y la proteína transmembrana de interés en un tampón que contiene el detergente colato de sodio (o desoxicolato de sodio; peso molecular de micela [MW] de 4.200 Da). El detergente solubiliza eficazmente los diferentes componentes de la reacción, permitiendo que la muestra se dialice contra el tampón que carece de detergente. Durante el paso de diálisis, a medida que se retira el detergente de la muestra, se forma espontáneamente una rHDL. Cuando este enfoque se utiliza para atrapar una proteína transmembrana de interés, las partículas del producto se han denominado nanodiscos⁵. Sin embargo, los intentos de utilizar este método para incorporar agentes bioactivos hidrófobos de moléculas pequeñas (MW <1.000 Da) han sido en gran medida infructuosos. A diferencia de las proteínas transmembrana, los agentes bioactivos de moléculas pequeñas pueden escapar de la bolsa de diálisis junto con el detergente, disminuyendo en gran medida su eficiencia de incorporación en las rHDL. Este problema se resolvió omitiendo detergentes de la mezcla de formulación¹⁴. En cambio, los componentes se agregan a un tampón acuoso secuencialmente, comenzando con la bicapa formando lípidos, formando un agente bioactivo estable que contiene rHDL, denominado nanodisco. Otros han utilizado la rHDL para la incorporación y transporte de agentes de imagen in vivo ⁷. Más recientemente, se han empleado en estudios de unión de ligandos rHDL especializados compuestos por un andamio de apolipoproteína y el glicerofosfolípido aniónico, cardiolipina. Estas partículas proporcionan una plataforma para estudios de la interacción de la cardiolipina con varios ligandos solubles en agua, incluyendo calcio, citocromo c y el agente anticancerígeno doxorrubicina⁸.

El presente estudio se centra en la formulación de rHDL que poseen un agente bioactivo hidrofóbico incorporado de manera estable (es decir, nanodisco). La capacidad de estos agentes para integrarse en el medio lipídico de las partículas discoidales de rHDL les confiere efectivamente solubilidad acuosa. Como tal, los nanodiscos tienen el potencial para aplicaciones terapéuticas in vivo . Al formular nanodiscos, se requieren condiciones específicas de incubación / reacción para incorporar con éxito agentes bioactivos hidrófobos discretos en la partícula del producto, y el objetivo de este informe es proporcionar información práctica detallada que pueda usarse como plantilla fundamental para crear nuevas partículas de nanodiscos para aplicaciones específicas. Por lo tanto, en el contexto de este manuscrito los términos nanodisco y nanodisco no son intercambiables. Mientras que nanodisco se refiere a un rHDL formulado para contener una proteína transmembrana incrustada en su bicapa lipídica⁵, el término nanodisco se refiere a un rHDL formulado para incorporar agentes bioactivos hidrófobos de bajo peso molecular (< 1.000 Da), como la anfotericina B¹⁴.

Una variedad de métodos están disponibles para la adquisición de proteínas de andamio adecuadas. Es posible comprar proteínas de andamio de fabricantes [por ejemplo, apoA-I (SRP4693) o apoE4 (A3234)], sin embargo, el costo puede ser un factor limitante. Un enfoque preferido es expresar proteínas de andamio recombinantes en Escherichia coli. Se publican protocolos para la apoA-I⁹ humana, apoE4¹⁰, así como para la proteína hemolinfática del insecto apolipoforina-III¹¹. Para los experimentos descritos en la presente invención, se utilizó el dominio N-terminal (NT) apoE4 humano recombinante (aminoácidos 1-183). La secuencia de nucleótidos que codifica apoE4-NT humano se sintetizó y se insertó en un vector de expresión pET-22b (+) directamente adyacente a la secuencia líder pelB codificada por vectores. Esta construcción conduce a la expresión de una proteína de fusión pelB leader sequence-apoE4-NT. Después de la síntesis de proteínas, la secuencia líder bacteriana pelB dirige la proteína recién sintetizada al espacio periplásmico donde la peptidasa líder escinde la secuencia pelB. La proteína apoE4-NT resultante, sin etiquetas de secuencia ni colas, escapa posteriormente de las bacterias y se acumula en el medio de cultivo^11,12, simplificando el procesamiento posterior.