Estandarización de un ensayo citométrico de perlas basado en anticuerpos de yema de huevo
Summary
Este protocolo describe una metodología para la preparación de perlas de látex para ensayos con anticuerpos IgY para la detección de antígenos.
Abstract
Los inmunoensayos son pruebas importantes para la detección de numerosas dianas moleculares. Entre los métodos disponibles en la actualidad, el ensayo citométrico de perlas ha ganado protagonismo en las últimas décadas. Cada microesfera que es leída por el equipo representa un evento de análisis de la capacidad de interacción entre las moléculas bajo prueba. Miles de estos eventos se leen en un solo ensayo, lo que garantiza una alta precisión y reproducibilidad del ensayo. Esta metodología también se puede utilizar en la validación de nuevos insumos, como los anticuerpos IgY, para el diagnóstico de enfermedades. Estos anticuerpos se obtienen a través de la inmunización de pollos con el antígeno de interés y luego la extracción de la inmunoglobulina de la yema de los huevos de los animales; Por lo tanto, este es un método indoloro y altamente productivo para obtener los anticuerpos. Además de una metodología para la validación de alta precisión de la capacidad de reconocimiento de anticuerpos de este ensayo, este artículo también presenta un método para extraer estos anticuerpos, determinar las mejores condiciones de acoplamiento para los anticuerpos y las perlas de látex, y determinar la sensibilidad de la prueba.
Introduction
Entre las técnicas de inmunoensayo destinadas al diagnóstico de enfermedades, el ensayo de perlas citométricas se ha convertido en un enfoque altamente sensible y fiable, ya que permite el análisis de miles de partículas en un solo ensayo1. Esta técnica, además de tener una alta productividad y permitir el uso de volúmenes más pequeños de muestras, también presenta una gran flexibilidad, ya que permite la detección de varias moléculas, como citoquinas, moléculas de adhesión, isotipos de anticuerpos y proteínas 2,3.
Para el desarrollo de estos ensayos se utilizan diferentes partículas, entre ellas las perlas de látex, que son un insumo efectivo y de bajo costo. Estos pueden presentar modificaciones en su superficie, como la presencia de grupos funcionales o proteínas que permiten el acoplamiento covalente o no covalente de ciertas moléculas 3,4,5.
Estos inmunoensayos utilizan componentes como antígenos y anticuerpos para realizar la detección de marcadores de enfermedades y, por lo general, requieren anticuerpos de mamíferos como ratones, conejos y cabras. Esto crea problemas relacionados con cuestiones éticas, ya que la inmunización de los mamíferos generalmente requiere de muchos animales para obtener un buen rendimiento, así como la frecuente realización de procedimientos que conducen al sufrimiento de los animales 6,7. Una alternativa a esto es el uso de anticuerpos IgY aislados de las yemas de huevo de pollos inmunizados, ya que en las yemas se pueden encontrar altas concentraciones de los anticuerpos específicos contra los antígenos inoculados; La producción de un pollo equivale a la producción de 4,3 conejos en el transcurso de un año 6,7.
Por lo tanto, el objetivo de este protocolo es proporcionar un método para evaluar los anticuerpos IgY obtenidos de yemas de huevo de gallina mediante citometría de flujo con perlas de látex. Para ello, proponemos un método de estandarización para un inmunoensayo citométrico de perlas en formato sándwich utilizando perlas de látex. Como modelo, utilizamos anticuerpos IgY dirigidos al antígeno de la proteína II rica en histidina de Plasmodium falciparum (IgY-PfHRP2). Describimos un método para extraer los anticuerpos, discutimos los pasos críticos para definir la concentración de acoplamiento de estos a las perlas de látex y presentamos una evaluación del límite de detección del antígeno. La alta precisión de la citometría de flujo, junto con el bajo costo de las perlas de látex, hacen que esta técnica sea aplicable para el análisis de herramientas de inmunoensayo, como anticuerpos y antígenos. Este método se puede utilizar para la detección de diversos objetivos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método de precipitación del anticuerpo IgY mediante la reducción del pH seguido de la separación de lípidos mediante ácido caprílico es eficaz para aislar los anticuerpos totales sin pérdida de funcionalidad. El método aquí propuesto es más sencillo y económico que el reportado por Redwan et al.11, que también utilizaron precipitación por acidificación y ácido caprílico, pero con un protocolo más complejo y laborioso. Este método también presenta ventajas sobre las metodolog…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la FIOCRUZ (Programa de excelencia en pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane – ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA), al Programa de Posgrado en Biotecnología (PPGBIOTEC de la Universidade Federal do Amazonas – UFAM), a la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) y a la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) por la concesión de las becas. La Figura 2 y la Figura 4 se crearon con biorender.com.
Materials
| Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF 488A antibody produced in donkey | Sigma-Aldrich | SAB4600031 | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)2 | Sigma-Aldrich | SAB4600388 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | BF-FACSC2 | |
| BD FACSDiva CS&T research beads (CS&T research beads) | BD Biosciences | 655050 | |
| BD FACSDiva software 7.0 | BD Biosciences | 655677 | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | #5000006 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Caprilic acid | Sigma-Aldrich | O3907 | |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | Z606936 | |
| Chloride 37% acid molecular grade | NEON | 02618 NEON | |
| CML latex, 4% w/v | Invitrogen | C37253 | |
| Megafuge 8R | Thermo Scientific | TS-HM8R | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC) | Sigma-Aldrich | E7750-1G | |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672-25G | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | 1003335620 | |
| Sodium hydroxide | Acs Cientifica | P.10.0594.024.00.27 | |
| Sodium hypochlorite | Acs Cientifica | R09211000 | |
| Thermo Mixer Heat/Cool | KASVI | K80-120R |
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