סטנדרטיזציה של בדיקת חרוזים ציטומטרית המבוססת על נוגדנים לחלמון ביצה
Summary
פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה להכנת חרוזי לטקס לבדיקות באמצעות נוגדני IgY לזיהוי אנטיגן.
Abstract
בדיקות חיסוניות הן בדיקות חשובות לזיהוי מטרות מולקולריות רבות. בין השיטות הקיימות כיום, בדיקת החרוזים הציטומטריים זכתה לבולטות בעשורים האחרונים. כל מיקרוספירה שנקראת על ידי הציוד מייצגת אירוע ניתוח של יכולת האינטראקציה בין המולקולות הנבדקות. אלפי אירועים אלה נקראים בבדיקה אחת, ובכך מבטיחים דיוק ושחזור גבוהים של הבדיקה. מתודולוגיה זו יכולה לשמש גם באימות של תשומות חדשות, כגון נוגדנים IgY, לאבחון מחלות. נוגדנים אלה מתקבלים באמצעות חיסון תרנגולות עם האנטיגן של עניין ולאחר מכן חילוץ אימונוגלובולין מן החלמון של ביצים של בעלי חיים; לכן, זוהי שיטה ללא כאבים ופרודוקטיבית מאוד להשגת הנוגדנים. בנוסף למתודולוגיה לאימות מדויק של יכולת זיהוי הנוגדנים של בדיקה זו, מאמר זה מציג גם שיטה לחילוץ נוגדנים אלה, קביעת תנאי הצימוד הטובים ביותר עבור הנוגדנים וחרוזי הלטקס, וקביעת רגישות הבדיקה.
Introduction
בין טכניקות immunoassay שמטרתן לאבחן מחלות, בדיקת החרוזים הציטומטרית התפתחה כגישה רגישה ואמינה ביותר, שכן היא מאפשרת ניתוח של אלפי חלקיקים בבדיקה אחת1. טכניקה זו, בנוסף לפרודוקטיביות גבוהה ומאפשרת שימוש בכמויות קטנות יותר של דגימות, מציגה גם גמישות רבה, שכן היא מאפשרת זיהוי של מספר מולקולות, כגון ציטוקינים, מולקולות הידבקות, איזוטיפים נוגדנים וחלבונים 2,3.
חלקיקים שונים משמשים לפיתוח בדיקות אלה, ביניהם חרוזי לטקס, המהווים תשומה יעילה וזולה. אלה יכולים להציג שינויים על פני השטח שלהם, כגון נוכחות של קבוצות פונקציונליות או חלבונים המאפשרים צימוד קוולנטי או לא קוולנטי של מולקולות מסוימות 3,4,5.
בדיקות חיסוניות אלה משתמשות ברכיבים כגון אנטיגנים ונוגדנים כדי לבצע זיהוי של סמני מחלה ובדרך כלל דורשות נוגדנים מיונקים כגון עכברים, ארנבות ועזים. זה יוצר בעיות הקשורות לסוגיות אתיות, שכן חיסון של יונקים בדרך כלל דורש בעלי חיים רבים כדי להשיג תשואה טובה, כמו גם את הביצועים התכופים של נהלים המובילים לסבל של בעלי חיים 6,7. חלופה לכך היא שימוש בנוגדני IgY שבודדו מחלמוני הביצה של תרנגולות מחוסנות, שכן ניתן למצוא בחלמונים ריכוזים גבוהים של נוגדנים ספציפיים כנגד האנטיגנים המחוסנים; הייצור של עוף שווה לייצור של 4.3 ארנבות במהלך שנה 6,7.
לפיכך, מטרת פרוטוקול זה היא לספק שיטה להערכת נוגדני IgY המתקבלים מחלמוני ביצת תרנגולת באמצעות ציטומטריית זרימה עם חרוזי לטקס. לשם כך, אנו מציעים שיטת סטנדרטיזציה עבור immunoassay חרוז ציטומטרי בפורמט סנדוויץ’ באמצעות חרוזי לטקס. כמודל, השתמשנו בנוגדני IgY המכוונים לאנטיגן Plasmodium falciparum histidine-עשיר בחלבון II (IgY-PfHRP2). אנו מתארים שיטה לחילוץ הנוגדנים, דנים בשלבים הקריטיים להגדרת ריכוז הצימוד שלהם לחרוזי הלטקס, ומציגים הערכה של גבול הזיהוי של האנטיגן. הדיוק הגבוה של ציטומטריית זרימה, יחד עם העלות הנמוכה של חרוזי לטקס, הופכים טכניקה זו לישימה לניתוח כלים חיסוניים, כגון נוגדנים ואנטיגנים. שיטה זו יכולה לשמש לאיתור מטרות מגוונות.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטת המשקעים של נוגדן IgY על ידי הפחתת pH ואחריה הפרדת שומנים באמצעות חומצה קפרילית יעילה בבידוד סך הנוגדנים ללא כל אובדן פונקציונליות. השיטה המוצעת כאן פשוטה וזולה יותר מזו שדווחה על ידי Redwan et al.11, שהשתמשו גם במשקעים על ידי החמצה וחומצה קפרילית אך עם פרוטוקול מורכב ומייגע יותר. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות ל- FIOCRUZ (“Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane – ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA”), לתוכנית לתואר שני בביוטכנולוגיה (PPGBIOTEC באוניברסיטה הפדרלית של אמזונס – UFAM), ל- Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES), ול- Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) על מתן המלגות. איור 2 ואיור 4 נוצרו עם biorender.com.
Materials
| Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF 488A antibody produced in donkey | Sigma-Aldrich | SAB4600031 | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)2 | Sigma-Aldrich | SAB4600388 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | BF-FACSC2 | |
| BD FACSDiva CS&T research beads (CS&T research beads) | BD Biosciences | 655050 | |
| BD FACSDiva software 7.0 | BD Biosciences | 655677 | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | #5000006 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Caprilic acid | Sigma-Aldrich | O3907 | |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | Z606936 | |
| Chloride 37% acid molecular grade | NEON | 02618 NEON | |
| CML latex, 4% w/v | Invitrogen | C37253 | |
| Megafuge 8R | Thermo Scientific | TS-HM8R | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC) | Sigma-Aldrich | E7750-1G | |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672-25G | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | 1003335620 | |
| Sodium hydroxide | Acs Cientifica | P.10.0594.024.00.27 | |
| Sodium hypochlorite | Acs Cientifica | R09211000 | |
| Thermo Mixer Heat/Cool | KASVI | K80-120R |
References
- Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies. Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407 (2019).
- de Figueiredo, A. M., Glória, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mariúba, L. A. M. Diagnostic applications of microsphere-based flow cytometry: A review. Experimental Biology and Medicine. 247 (20), 1852-1861 (2022).
- Morgan, E., et al. Cytometric bead array: A multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clinical Immunology. 110 (3), 252-266 (2004).
- Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. The genesis and evolution of bead-based multiplexing. Methods. 158, 2-11 (2019).
- Kellar, K. Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays. Experimental Hematology. 30 (11), 1227-1237 (2002).
- Schade, R., et al. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. ATLA Alternatives to Laboratory Animals. 33 (2), 129-154 (2005).
- Xu, Y., et al. Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases: A review. Biotechnology Advances. 29 (6), 860-868 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Sousa, L. P., et al. A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 49 (2014).
- Klimentzou, P., et al. Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha. Peptides. 27 (1), 183-193 (2006).
- Redwan, E. M., Aljadawi, A. A., Uversky, V. N. Simple and efficient protocol for immunoglobulin Y purification from chicken egg yolk. Poultry Science. 100 (3), 100956 (2021).
- Lee, H. Y., Abeyrathne, E. D. N. S., Choi, I., Suh, J. W., Ahn, D. U. K. Sequential separation of immunoglobulin Y and phosvitin from chicken egg yolk without using organic solvents. Poultry Science. 93 (10), 2668-2677 (2014).
- Pauly, D., Chacana, P., Calzado, E., Brembs, B., Schade, R. IgY Technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation. Journal of Visualized Experiments. (51), e3084 (2011).
- Chang, H. M., Lu, T. C., Chen, C. C., Tu, Y. Y., Hwang, J. Y. Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 (4), 995-999 (2000).
- Ko, K. Y., Ahn, D. U. Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography. Poultry Science. 86 (2), 400-407 (2007).
- Polson, A. Isolation of IgY from the yolks of eggs by a chloroform polyethylene glycol procedure. Immunological Communications. 19 (3), 253-258 (1990).
- Simonova, M. A., et al. xMAP-based analysis of three most prevalent staphylococcal toxins in Staphylococcus aureus cultures. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6447-6452 (2014).
- Sharma, P., et al. A multiplex assay for detection of staphylococcal and streptococcal exotoxins. PLoS One. 10 (8), e0135986 (2015).
- Merbah, M., et al. Standardization of a cytometric p24-capture bead-assay for the detection of main HIV-subtypes. Journal of Virological Methods. 230, 45-52 (2016).
