Standardisierung eines zytometrischen Bead-Assays auf Basis von Eigelb-Antikörpern
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Herstellung von Latexkügelchen für Assays mit IgY-Antikörpern für den Antigennachweis.
Abstract
Immunoassays sind wichtige Tests für den Nachweis zahlreicher molekularer Ziele. Unter den derzeit verfügbaren Methoden hat der zytometrische Bead-Assay in den letzten Jahrzehnten an Bedeutung gewonnen. Jede Mikrosphäre, die vom Gerät gelesen wird, stellt ein Analyseereignis der Wechselwirkungskapazität zwischen den zu testenden Molekülen dar. Tausende dieser Ereignisse werden in einem einzigen Assay abgelesen, wodurch eine hohe Assaygenauigkeit und Reproduzierbarkeit gewährleistet wird. Diese Methodik kann auch bei der Validierung neuer Inputs, wie z. B. IgY-Antikörper, für die Diagnose von Krankheiten eingesetzt werden. Diese Antikörper werden gewonnen, indem Hühner mit dem interessierenden Antigen immunisiert und dann das Immunglobulin aus dem Eigelb der Tiere extrahiert wird. Daher ist dies eine schmerzfreie und hochproduktive Methode zur Gewinnung der Antikörper. Neben einer Methodik zur hochpräzisen Validierung der Antikörpererkennungskapazität dieses Assays wird in dieser Arbeit auch eine Methode zur Extraktion dieser Antikörper, zur Bestimmung der besten Kopplungsbedingungen für die Antikörper und Latexkügelchen und zur Bestimmung der Sensitivität des Tests vorgestellt.
Introduction
Unter den Immunoassay-Techniken zur Diagnose von Krankheiten hat sich der zytometrische Bead-Assay als hochempfindlicher und zuverlässiger Ansatz herausgestellt, da er die Analyse von Tausenden von Partikeln in einem einzigen Assay ermöglicht1. Diese Technik bietet nicht nur eine hohe Produktivität und die Verwendung kleinerer Probenvolumina, sondern auch eine große Flexibilität, da sie den Nachweis mehrerer Moleküle wie Zytokine, Adhäsionsmoleküle, Antikörperisotypen und Proteine ermöglicht 2,3.
Für die Entwicklung dieser Assays werden verschiedene Partikel verwendet, darunter Latexperlen, die ein effektiver und kostengünstiger Input sind. Diese können Modifikationen auf ihrer Oberfläche aufweisen, wie z. B. das Vorhandensein funktioneller Gruppen oder Proteine, die die kovalente oder nicht-kovalente Kopplung bestimmter Moleküle ermöglichen 3,4,5.
Diese Immunoassays verwenden Komponenten wie Antigene und Antikörper, um den Nachweis von Krankheitsmarkern durchzuführen, und erfordern in der Regel Antikörper von Säugetieren wie Mäusen, Kaninchen und Ziegen. Dies führt zu ethischen Problemen, da die Immunisierung von Säugetieren in der Regel viele Tiere erfordert, um einen guten Ertrag zu erzielen, sowie die häufige Durchführung von Verfahren, die zum Leiden der Tiere führen 6,7. Eine Alternative dazu ist die Verwendung von IgY-Antikörpern, die aus dem Eigelb immunisierter Hühner isoliert wurden, da im Eigelb hohe Konzentrationen der spezifischen Antikörper gegen die inokulierten Antigene zu finden sind; Die Produktion eines Huhns entspricht der Produktion von 4,3 Kaninchen im Laufe eines Jahres 6,7.
Daher ist es das Ziel dieses Protokolls, eine Methode zur Bewertung von IgY-Antikörpern bereitzustellen, die aus Hühnereigelb mittels Durchflusszytometrie mit Latexkügelchen gewonnen wurden. Zu diesem Zweck schlagen wir eine Standardisierungsmethode für einen zytometrischen Bead-Immunoassay im Sandwich-Format unter Verwendung von Latex-Beads vor. Als Modell haben wir IgY-Antikörper verwendet, die gegen das histidinreiche Protein-II-Antigen Plasmodium falciparum (IgY-Pf HRP2) gerichtet sind. Wir beschreiben eine Methode zur Extraktion der Antikörper, diskutieren die kritischen Schritte zur Bestimmung der Kopplungskonzentration dieser Antikörper an die Latexkügelchen und präsentieren eine Bewertung der Nachweisgrenze des Antigens. Die hohe Genauigkeit der Durchflusszytometrie, gepaart mit den niedrigen Kosten von Latexkügelchen, machen diese Technik für die Analyse von Immunoassay-Werkzeugen wie Antikörpern und Antigenen anwendbar. Diese Methode kann für die Detektion verschiedener Ziele verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Methode der Fällung des IgY-Antikörpers durch pH-Reduktion mit anschließender Lipidtrennung mit Caprylsäure ist effizient bei der Isolierung von Gesamtantikörpern ohne Funktionsverlust. Die hier vorgeschlagene Methode ist einfacher und billiger als die von Redwan et al.11 beschriebene, die ebenfalls eine Ausfällung durch Versauerung und Caprylsäure verwendeten, jedoch mit einem komplexeren und mühsameren Protokoll. Diese Methode bietet auch Vorteile gegenüber häufig verwendeten Metho…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem FIOCRUZ (“Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane – ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA”), dem Postgraduiertenprogramm in Biotechnologie (PPGBIOTEC an der Universidade Federal do Amazonas – UFAM), der Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) und der Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) für die Bereitstellung der Stipendien. Abbildung 2 und Abbildung 4 wurden mit biorender.com erstellt.
Materials
| Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF 488A antibody produced in donkey | Sigma-Aldrich | SAB4600031 | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)2 | Sigma-Aldrich | SAB4600388 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | BF-FACSC2 | |
| BD FACSDiva CS&T research beads (CS&T research beads) | BD Biosciences | 655050 | |
| BD FACSDiva software 7.0 | BD Biosciences | 655677 | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | #5000006 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Caprilic acid | Sigma-Aldrich | O3907 | |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | Z606936 | |
| Chloride 37% acid molecular grade | NEON | 02618 NEON | |
| CML latex, 4% w/v | Invitrogen | C37253 | |
| Megafuge 8R | Thermo Scientific | TS-HM8R | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC) | Sigma-Aldrich | E7750-1G | |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672-25G | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | 1003335620 | |
| Sodium hydroxide | Acs Cientifica | P.10.0594.024.00.27 | |
| Sodium hypochlorite | Acs Cientifica | R09211000 | |
| Thermo Mixer Heat/Cool | KASVI | K80-120R |
References
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