Standaardisatie van een cytometrische kralentest op basis van eigeel-antilichamen
Summary
Dit protocol beschrijft een methodologie voor de bereiding van latexkorrels voor assays met behulp van IgY-antilichamen voor antigeendetectie.
Abstract
Immunoassays zijn belangrijke tests voor de detectie van talrijke moleculaire doelwitten. Onder de methoden die momenteel beschikbaar zijn, heeft de cytometrische kralentest de afgelopen decennia aan belang gewonnen. Elke microsfeer die door de apparatuur wordt gelezen, vertegenwoordigt een analysegebeurtenis van de interactiecapaciteit tussen de geteste moleculen. Duizenden van deze gebeurtenissen worden in één test gelezen, waardoor een hoge testnauwkeurigheid en reproduceerbaarheid wordt gegarandeerd. Deze methodologie kan ook worden gebruikt bij de validatie van nieuwe inputs, zoals IgY-antilichamen, voor de diagnose van ziekten. Deze antilichamen worden verkregen door kippen te immuniseren met het antigeen van belang en vervolgens het immunoglobuline uit de dooier van de eieren van de dieren te extraheren; Daarom is dit een pijnloze en zeer productieve methode voor het verkrijgen van de antilichamen. Naast een methodologie voor de zeer nauwkeurige validatie van het antilichaamherkenningsvermogen van deze test, presenteert dit artikel ook een methode voor het extraheren van deze antilichamen, het bepalen van de beste koppelingsomstandigheden voor de antilichamen en latexkorrels en het bepalen van de gevoeligheid van de test.
Introduction
Onder de immunoassay-technieken gericht op het diagnosticeren van ziekten, is de cytometrische kralentest naar voren gekomen als een zeer gevoelige en betrouwbare benadering, omdat het de analyse van duizenden deeltjes in een enkele testmogelijk maakt 1. Deze techniek heeft niet alleen een hoge productiviteit en maakt het gebruik van kleinere volumes monsters mogelijk, maar biedt ook een grote flexibiliteit, omdat het de detectie van verschillende moleculen mogelijk maakt, zoals cytokines, adhesiemoleculen, antilichaamisotypen en eiwitten 2,3.
Verschillende deeltjes worden gebruikt voor de ontwikkeling van deze testen, waaronder latexparels, die een effectieve en goedkope input zijn. Deze kunnen veranderingen op hun oppervlak vertonen, zoals de aanwezigheid van functionele groepen of eiwitten die de covalente of niet-covalente koppeling van bepaalde moleculen 3,4,5 mogelijk maken.
Deze immunoassays gebruiken componenten zoals antigenen en antilichamen om de detectie van ziektemarkers uit te voeren en vereisen vaak antilichamen van zoogdieren zoals muizen, konijnen en geiten. Dit creëert problemen met betrekking tot ethische kwesties, omdat de immunisatie van zoogdieren over het algemeen veel dieren vereist om een goede opbrengst te verkrijgen, evenals de frequente uitvoering van procedures die leiden tot het lijden van de dieren 6,7. Een alternatief hiervoor is het gebruik van IgY-antilichamen geïsoleerd uit de eierdooiers van geïmmuniseerde kippen, omdat hoge concentraties van de specifieke antilichamen tegen de geënte antigenen in de dooiers kunnen worden gevonden; De productie van een kip is gelijk aan de productie van 4,3 konijnen in de loop van een jaar 6,7.
Het doel van dit protocol is dus om een methode te bieden voor het evalueren van IgY-antilichamen verkregen uit kippeneidooiers met behulp van flowcytometrie met latexparels. Hiervoor stellen we een standaardisatiemethode voor voor een cytometrische kralenimmunoassay in sandwichformaat met latexparels. Als model gebruikten we IgY-antilichamen gericht op het Plasmodium falciparum histidine-rijk eiwit II-antigeen (IgY-PfHRP2). We beschrijven een methode voor het extraheren van de antilichamen, bespreken de kritische stappen voor het definiëren van de koppelingsconcentratie hiervan aan de latexkorrels en presenteren een evaluatie van de detectiegrens van het antigeen. De hoge nauwkeurigheid van flowcytometrie, in combinatie met de lage kosten van latexparels, maken deze techniek toepasbaar voor de analyse van immunoassay-instrumenten, zoals antilichamen en antigenen. Deze methode kan worden gebruikt voor de detectie van diverse doelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De methode van precipitatie van het IgY-antilichaam door pH-verlaging gevolgd door lipidenscheiding met caprylzuur is efficiënt in het isoleren van totale antilichamen zonder enig verlies van functionaliteit. De hier voorgestelde methode is eenvoudiger en goedkoper dan die gerapporteerd door Redwan et al.11, die ook precipitatie door verzuring en caprylzuur gebruikten, maar met een complexer en bewerkelijker protocol. Deze methode biedt ook voordelen ten opzichte van veelgebruikte methoden voor I…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag de FIOCRUZ (“Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane – ILMD / Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS / ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA”), het postdoctorale programma in biotechnologie (PPGBIOTEC aan de Universidade Federal do Amazonas – UFAM), de Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) en de Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) bedanken voor het verstrekken van de beurzen. Figuur 2 en Figuur 4 zijn gemaakt met biorender.com.
Materials
| Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF 488A antibody produced in donkey | Sigma-Aldrich | SAB4600031 | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)2 | Sigma-Aldrich | SAB4600388 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | BF-FACSC2 | |
| BD FACSDiva CS&T research beads (CS&T research beads) | BD Biosciences | 655050 | |
| BD FACSDiva software 7.0 | BD Biosciences | 655677 | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | #5000006 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Caprilic acid | Sigma-Aldrich | O3907 | |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | Z606936 | |
| Chloride 37% acid molecular grade | NEON | 02618 NEON | |
| CML latex, 4% w/v | Invitrogen | C37253 | |
| Megafuge 8R | Thermo Scientific | TS-HM8R | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC) | Sigma-Aldrich | E7750-1G | |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672-25G | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | 1003335620 | |
| Sodium hydroxide | Acs Cientifica | P.10.0594.024.00.27 | |
| Sodium hypochlorite | Acs Cientifica | R09211000 | |
| Thermo Mixer Heat/Cool | KASVI | K80-120R |
References
- Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies. Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407 (2019).
- de Figueiredo, A. M., Glória, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mariúba, L. A. M. Diagnostic applications of microsphere-based flow cytometry: A review. Experimental Biology and Medicine. 247 (20), 1852-1861 (2022).
- Morgan, E., et al. Cytometric bead array: A multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clinical Immunology. 110 (3), 252-266 (2004).
- Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. The genesis and evolution of bead-based multiplexing. Methods. 158, 2-11 (2019).
- Kellar, K. Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays. Experimental Hematology. 30 (11), 1227-1237 (2002).
- Schade, R., et al. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. ATLA Alternatives to Laboratory Animals. 33 (2), 129-154 (2005).
- Xu, Y., et al. Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases: A review. Biotechnology Advances. 29 (6), 860-868 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Sousa, L. P., et al. A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 49 (2014).
- Klimentzou, P., et al. Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha. Peptides. 27 (1), 183-193 (2006).
- Redwan, E. M., Aljadawi, A. A., Uversky, V. N. Simple and efficient protocol for immunoglobulin Y purification from chicken egg yolk. Poultry Science. 100 (3), 100956 (2021).
- Lee, H. Y., Abeyrathne, E. D. N. S., Choi, I., Suh, J. W., Ahn, D. U. K. Sequential separation of immunoglobulin Y and phosvitin from chicken egg yolk without using organic solvents. Poultry Science. 93 (10), 2668-2677 (2014).
- Pauly, D., Chacana, P., Calzado, E., Brembs, B., Schade, R. IgY Technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation. Journal of Visualized Experiments. (51), e3084 (2011).
- Chang, H. M., Lu, T. C., Chen, C. C., Tu, Y. Y., Hwang, J. Y. Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 (4), 995-999 (2000).
- Ko, K. Y., Ahn, D. U. Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography. Poultry Science. 86 (2), 400-407 (2007).
- Polson, A. Isolation of IgY from the yolks of eggs by a chloroform polyethylene glycol procedure. Immunological Communications. 19 (3), 253-258 (1990).
- Simonova, M. A., et al. xMAP-based analysis of three most prevalent staphylococcal toxins in Staphylococcus aureus cultures. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6447-6452 (2014).
- Sharma, P., et al. A multiplex assay for detection of staphylococcal and streptococcal exotoxins. PLoS One. 10 (8), e0135986 (2015).
- Merbah, M., et al. Standardization of a cytometric p24-capture bead-assay for the detection of main HIV-subtypes. Journal of Virological Methods. 230, 45-52 (2016).
