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生物工程

Terapia sonodinámica para el tratamiento del glioblastoma multiforme en un modelo de ratón utilizando un sistema portátil de ultrasonido focalizado de sobremesa

Published: February 10, 2023
doi:
10.3791/65114
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1Department of Neurosurgery,Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering,Johns Hopkins University, 3Krieger School of Arts and Sciences,Johns Hopkins University, 4Department of Electrical Engineering and Computer Science,Johns Hopkins University, 5Department of Radiology, Cancer Imaging Division,Johns Hopkins University School of Medicine, 6Department of Mechanical Engineering,Johns Hopkins University, 7Department of Anesthesiology and Critical Care Medicine,Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Aquí, describimos un protocolo que detalla cómo realizar la terapia sonodinámica en un modelo de glioblastoma de ratón in vivo utilizando ultrasonido focalizado guiado por resonancia magnética.

Abstract

La terapia sonodinámica (SDT) es una aplicación de ultrasonidos focalizados (FUS) que permite que un agente sonositizante prepare los tumores para aumentar la sensibilidad durante la sonicación. Desafortunadamente, los tratamientos clínicos actuales para el glioblastoma (GBM) son deficientes, lo que lleva a bajas tasas de supervivencia a largo plazo entre los pacientes. La SDT es un método prometedor para tratar el GBM de una manera eficaz, no invasiva y específica para el tumor. Los sonosensibilizadores entran preferentemente en las células tumorales en comparación con el parénquima cerebral circundante. La aplicación de FUS en presencia de un agente sonositizante genera especies oxidativas reactivas que dan lugar a la apoptosis. Aunque esta terapia ha demostrado previamente ser eficaz en estudios preclínicos, hay una falta de parámetros estandarizados establecidos. Son necesarios métodos estandarizados para optimizar esta estrategia terapéutica para su uso preclínico y clínico. En este trabajo, detallamos el protocolo para realizar SDT en un modelo preclínico de roedores GBM utilizando FUS guiado por resonancia magnética (MRgFUS). La MRgFUS es una característica importante de este protocolo, ya que permite la focalización específica de un tumor cerebral sin necesidad de cirugías invasivas (por ejemplo, craneotomía). El dispositivo de sobremesa utilizado aquí puede enfocar una ubicación específica en tres dimensiones haciendo clic en un objetivo en una imagen de resonancia magnética, lo que hace que la selección del objetivo sea un proceso sencillo. Este protocolo proporcionará a los investigadores un método preclínico estandarizado para MRgFUS SDT, con la flexibilidad añadida de cambiar y optimizar los parámetros para la investigación traslacional.

Introduction

El glioblastoma (GBM) es una forma de cáncer cerebral altamente agresivo que tiene una incidencia de 3,21 por cada 100.000 personas y es el tumor cerebral maligno máscomún. El estándar de atención actual incluye resección quirúrgica, radiación y quimioterapia2. Debido a la naturaleza invasiva e infiltrativa del tumor, la resección completa del tumor es poco frecuente. El tejido residual en los márgenes tumorales produce una tasa alta de recidiva tumoral y una tasa de supervivencia baja de menos del 6 % después de 5 años1.

Debido a este pronóstico, los investigadores están explorando nuevas opciones terapéuticas para combatir esta enfermedad mortal. La terapia sonodinámica (SDT) es un tratamiento no invasivo que combina ultrasonidos focalizados (FUS) de baja intensidad y agentes sonosensibilizantes para producir un efecto citotóxico en las células diana3. Por ejemplo, los sonosensibilizadores a base de porfirina, como el ácido 5-aminolevulínico (5-ALA), son absorbidos preferentemente por las células tumorales y aumentan la producción de especies oxidativas reactivas (ROS) a niveles dañinos cuando se exponen a ultrasonidos focalizados. Los niveles sobreexpresados de ROS en las células pueden dañar las estructuras celulares y desencadenar la apoptosis. Dado que el 5-ALA es absorbido preferentemente por las células tumorales, el tejido sano dentro de la región de tratamiento no sufre daños 3,4. Los estudios preliminares in vitro han revelado que muchas células cancerosas se lisan mediante el tratamiento con SDT, aunque la tasa de muerte celular depende de la línea celular. Los estudios preliminares in vivo arrojan resultados similares, confirmando que la SDT puede desencadenar la apoptosis5.

Este protocolo tiene como objetivo describir técnicas y parámetros efectivos para el tratamiento SDT de modelos de roedores con células GBM implantadas intracranealmente utilizando una plataforma de investigación FUS de sobremesa. Los investigadores pueden utilizar este protocolo para realizar y optimizar la SDT para la investigación traslacional de la FUS.

Protocol

Todos los estudios en animales fueron aprobados y realizados de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Johns Hopkins. Se obtuvieron ratones hembra desnudos atímicos (edad: 10 semanas) de fuentes comerciales (ver Tabla de Materiales). Se siguieron todas las regulaciones de Bioseguridad Nivel 2 (BSL-2), incluido el uso de máscaras, guantes y batas. 1. Implantes tumorales e imágenes de bioluminiscencia Durante la fase inicial del estudio, realizar el implante de tumor intracraneal, siguiendo un reporte previamente publicado6.NOTA: En este estudio, se utilizaron 100.000 células de xenoinjerto de GBM humano M59 en 4 μL de suspensión celular para la implantación a una profundidad de 3,0 mm en el cráneo. Antes del tratamiento, cuantificar el tamaño tumoral en cada ratón de forma no invasiva utilizando un sistema de imágenes de luminiscencia in vivo (ver Tabla de materiales) siguiendo un informe publicado previamente7.NOTA: Esto se hizo en la fecha del tratamiento, 7 días después de los implantes iniciales del tumor. Utilizando la cuantificación por imágenes, divida a los ratones en subgrupos comparables para el tratamiento.NOTA: En este estudio, se incluyeron dos subgrupos: (1) ratones portadores de tumores no tratados (n = 4) y (2) ratones portadores de tumores sometidos a SDT (n = 4). No se observaron diferencias estadísticamente significativas en el tamaño tumoral previo al tratamiento entre los dos grupos (p > 0,05). 2. Configuración del día del tratamiento Saque el clorhidrato de 5-ALA (consulte la Tabla de materiales) del congelador y pese 200 mg/kg de peso del ratón de 5-ALA (p. ej., para un ratón de 25 g, pese 5 mg.). Hágalo solo con luz ambiental.NOTA: Estéril todo el equipo antes de usarlo. Disolver la cantidad total de 5-ALA en solución salina tamponada con fosfato (PBS), de modo que a cada animal se le administre una solución de 60 mg/ml de 5-ALA con la dosis de peso correcta (p. ej., para un ratón de 25 g, disolver 5 mg de 5-ALA en 83,33 μl de PBS). Para cada animal del grupo de ensayo de SDT, inyectar la cantidad adecuada de solución de 5-ALA en el animal por vía intraperitoneal (calculada en los pasos 2.1 y 2.2). Dejar a los animales en sus jaulas durante 3 h para que metabolicen el 5-ALA. 3. Preparación de los requisitos para los experimentos Llene un depósito con agua desionizada (DI).NOTA: La cantidad de agua necesaria se basa en el número de ratones utilizados en el estudio. Conecte los tubos de entrada y salida al desgasificador ultrasónico (consulte la Tabla de materiales) y conecte el desgasificador a la alimentación (1 = ON, 0 = OFF). Coloque el otro extremo de los tubos de entrada y salida en el depósito de agua desionizada. Encienda el desgasificador y hágalo funcionar durante 45 minutos. Llene el agua recién desgasificada hasta la parte superior de un recipiente hermético y sellado que se utilizará durante el estudio. Vierta el gel de ultrasonido (consulte la tabla de materiales) en un tubo cónico y luego colóquelo en una centrífuga y gire a 160 x g durante 5 minutos para eliminar el aire del gel.NOTA: Se necesita suficiente gel para formar una cucharada de gel en la cabeza de cada animal. 4. Configuración del sistema MRgFUS Conecte el sistema MRgFUS (consulte la Tabla de materiales) utilizando el diagrama de cableado como se ve en la Figura 1 (panel inferior).Conecte todos los componentes necesarios (ordenador de sobremesa, monitor, plataforma MRgFUS, osciloscopio, amplificador) a la alimentación. Conecte todos los cables a las ubicaciones correctas. Conecte el transductor deseado a la plataforma MRgFUS a través de los cables BNC y coaxiales, y luego conecte la caja de adaptación de impedancia correspondiente a los cables correctos.NOTA: Para el presente estudio se utilizó un transductor de 515 kHz. Enciende todos los dispositivos. En el sistema operativo del ordenador de sobremesa, abra la aplicación AUREUS, que ya está integrada en el software del sistema FUS. Seleccione Conectar todo el hardware para conectar el hardware al sistema y asegurarse de que los componentes se comunican con el software. Seleccione el transductor utilizado seleccionando el menú desplegable y eligiendo el transductor deseado. 5. Inicialización Desenrosque el tornillo inferior del maniquí y llene la cavidad con agua desionizada y desgasificada hasta que se desborde, y luego vuelva a colocar el tornillo. Inserte el maniquí en la ubicación correspondiente de la cama de resonancia magnética (véase la figura 2) y, a continuación, coloque la cama de resonancia magnética en la base de resonancia magnética en su ranura correspondiente. Coloque la base de RMN en su ubicación correspondiente en el escáner de RMN (consulte la Tabla de materiales). Ajuste la base de modo que la cama de resonancia magnética fantasma pueda deslizarse en el orificio de resonancia magnética sin obstrucciones para obtener una imagen de alta calidad del maniquí. Marque esta ubicación para que sea fácilmente replicable en el futuro.NOTA: Una vez que se encuentra esta ubicación, no se cambiará durante el resto del tratamiento. Por lo tanto, asegúrese de que sea un lugar adecuado para la colocación de resonancias magnéticas de animales, o será necesario repetir todo el registro. Realice una resonancia magnética del maniquí utilizando los ajustes de la Tabla 1. Retire la base del orificio del imán, pero manténgala en el escáner. Retire la cama de resonancia magnética que contiene el maniquí de la base y, a continuación, coloque la cama con el maniquí en el sistema MRgFUS deslizando la clavija de la parte inferior en su ranura correcta. Coloque la punta de registro en las ranuras magnéticas del brazo del transductor de modo que apunte hacia abajo, hacia el maniquí (consulte la Figura 2). En el software, elija Seleccionar una nueva posición de inicio y, a continuación, seleccione Modo de avance activado para comenzar la búsqueda enfocada guiada. Después de alternar el modo jog, use las teclas izquierda, derecha, arriba, abajo, re página y av página para mover manualmente el brazo del transductor en las direcciones izquierda, derecha, adelante, atrás, arriba y abajo, respectivamente. Ajuste el puntero manualmente en las tres dimensiones hasta que la punta del puntero toque el centro del patrón de cruz que se encuentra en la parte superior del maniquí (consulte la Figura 2). Descargue las imágenes de resonancia magnética fantasma en la computadora y colóquelas en una carpeta en el directorio elegido, y luego cargue las imágenes de resonancia magnética en el software seleccionando Cargar imágenes fantasma. Las rebanadas fantasma axiales poblarán la pantalla en el lado derecho. Desplácese por estos sectores a través de la barra de desplazamiento del mouse. Ajuste el brillo haciendo clic y manteniendo presionada la imagen y luego moviendo el mouse hacia arriba o hacia abajo.NOTA: Si alguno de los archivos de la carpeta no son archivos DICOM sin comprimir, el software no podrá leerlos e importarlos, así que elimine cualquier otro archivo de esa carpeta. Desplázate hasta cualquier imagen del fantasma donde haya un círculo claro con tres agujeros oscuros en cada uno. Haz clic en el centro del fantasma y aparecerá un círculo rojo. Haga clic y arrastre el círculo hasta que tenga el mismo diámetro y se alinee con la circunferencia del maniquí (consulte la figura 2). Las coordenadas de esta posición se denominan “posición de origen”; guárdelo haciendo clic en Establecer L/R, A/P y S/I. Haga clic en Modo de avance desactivado, retire la punta de registro del brazo del transductor y, a continuación, seleccione Salir de la búsqueda de enfoque. Confirme la posición inicial para completar la secuencia de inicialización. 6. Preparación animal para la SDT Anestesiar al ratón con una mezcla de gas isoflurano-O2 en una cámara de inducción. Ajuste el caudal de gas a 1,0 ml/min y el vaporizador al 2,0% para la inducción de la anestesia, que suele requerir de 3 a 5 minutos en la cámara (véase la tabla de materiales). Evalúe al animal para ver si está sedante adecuadamente pellizcando el dedo del pie. Aplique un ungüento oftálmico en los ojos para evitar la sequedad de las córneas.NOTA: Controle la profundidad de la anestesia durante todo el procedimiento. Inyecte al ratón 40 μL de agente de contraste de gadolinio a través de la vena de la cola (ver Tabla de materiales). Elimina el vello que obstruya el cuero cabelludo por encima del cráneo con una crema depilatoria y una afeitadora electrónica. Asegure al animal a la cama de resonancia magnética siguiendo los siguientes pasos (véase la figura 3).Conecte el tubo de entrada de la cama de resonancia magnética (Figura 3A) a una fuente de isoflurano para anestesia y ajuste el caudal de gas a 1,0 ml/min y el vaporizador a 2,0% para la inducción de la anestesia. Conecte el tubo de salida a un recipiente de filtro de carbón para la absorción de la anestesia. Coloque la pieza cónica de la nariz en su ranura, como se muestra en la Figura 3B. Deslice la barra de mordida a través de los orificios de la barra de mordida tanto en el cono de la nariz como en el extremo de la cama, como se muestra, con el extremo del protector de mordida flotando sobre el pozo abierto en la cama de resonancia magnética. Coloque al animal en la cama de resonancia magnética con las orejas alineadas con los orificios estereotácticos de la barra de la oreja y enganche los dientes a través del protector de mordida para mantenerlo en su lugar. Deslice el cono de la nariz hacia adelante de modo que quede sobre el hocico del animal para proporcionar un flujo constante de anestesia. Deslice las barras de las orejas a través de los orificios a ambos lados de la cama de resonancia magnética y levante la cabeza del animal hasta que ambas barras de las orejas puedan caber en los canales auditivos del ratón.NOTA: No empuje demasiado, ya que esto puede dañar los tímpanos del animal. Asegúrese de que el animal esté en una posición cómoda. Luego, con un destornillador de punta plana, atornille los tornillos compatibles con MRI para bloquear ambas barras auriculares, el cono de la nariz y la barra de mordida. Esto bloqueará al animal en su lugar y evitará cualquier movimiento de la cabeza hasta que el animal sea retirado de la cama.NOTA: Asegúrese de que no haya ninguna alteración en la posición del animal en la cama de resonancia magnética después de este paso. Si el animal se mueve, será necesario repetir toda la configuración (paso 6.5), independientemente de lo avanzado que esté el protocolo. Mientras el animal espera, coloque la cama de resonancia magnética sobre una almohadilla térmica tibia para mantener la temperatura corporal.NOTA: Controle y mantenga la temperatura corporal durante todo el procedimiento. El isoflurano se suministra continuamente al animal a través de tubos conectados a los conos de la nariz durante todo el tratamiento cuando la cama del animal se fija en el sistema FUS, utilizando los accesorios provistos en la plataforma. 7. Procedimientos de resonancia magnética Tome la cama de resonancia magnética con el animal fijado estereotácticamente y colóquela en la cuna de resonancia magnética previamente conectada al escáner de resonancia magnética (consulte la tabla de materiales), colocando el orificio de la cama de resonancia magnética en su extremo a la clavija de la cuna de resonancia magnética, como se muestra en la Figura 3. Conecte los tubos de anestesia de entrada y salida a los tubos correspondientes en la máquina de resonancia magnética. Deslice la base de resonancia magnética que contiene al animal en el orificio de resonancia magnética, asegurándose de mantener la misma posición en la que se colocó el maniquí. Realice un localizador para ver la ubicación del cerebro del animal y, a continuación, una resonancia magnética ponderada en T1 posterior al contraste que cubra todo el cerebro utilizando los ajustes de resonancia magnética de la Tabla 2. Exporte la resonancia magnética como un conjunto de archivos DICOM sin comprimir, uno para cada segmento. 8. Tratamiento con ultrasonido focalizado (Figura 4) Retire al animal de la cuna de resonancia magnética después de completar la exploración y colóquelo en la plataforma colocando la parte delantera de la cama en su clavija correspondiente en la parte posterior de la plataforma y colocando la parte posterior de la cama en su clavija correspondiente. Conecte el tubo de entrada de la cama de resonancia magnética a una fuente de isoflurano para anestesia y ajuste el caudal de gas a 1,0 ml/min y el vaporizador al 2,0% para el mantenimiento de la anestesia. Conecte el tubo de salida a un recipiente de filtro de carbón para la absorción de la anestesia. Transfiera el conjunto de archivos DICOM a la computadora y colóquelos en una carpeta en el directorio de trabajo principal del estudio actual.NOTA: Consulte el paso 5.9 para conocer los requisitos de archivo. En el software, vaya a la página principal de inicialización y active el modo de avance haciendo clic en Búsqueda de enfoque guiado y luego haga clic en Modo de avance activado. Coloque un poco de gel de ultrasonido centrifugado en la cabeza del animal, con suficiente gel para cubrir todo el cuero cabelludo por encima del cráneo. Vierta agua desionizada y desgasificada en el baño de agua hasta el 80% y luego coloque el baño de agua en sus columnas correspondientes en la plataforma. Baje el baño de agua lleno de agua desionizada hasta que la membrana inferior toque el gel de ultrasonido en la cabeza del animal, formando una superficie de acoplamiento entre el agua y el gel. Asegúrese de que el gel de ultrasonido cubra toda la cabeza del animal hasta el baño de agua y que no haya burbujas de aire en el gel de ultrasonido entre el baño de agua y el cuero cabelludo del ratón. Sumerja el transductor de ultrasonido en el baño de agua, asegurándose de que no se formen burbujas de aire en la superficie del transductor. Baje el brazo del transductor usando Jog Mode Down hacia el transductor parcialmente sumergido y conéctelo al transductor alineando las ranuras magnéticas entre sí mientras la superficie del transductor permanece sumergida. Desactive el modo de avance y, a continuación, salga de la búsqueda enfocada, como se hizo durante el paso de inicialización. Asegúrese de confirmar la posición inicial como se hizo antes. Vaya a la pestaña de tratamiento y, a continuación, cargue los archivos de resonancia magnética ponderados en T1 posteriores al contraste haciendo clic en el icono de carpeta en la parte superior central de la pantalla. Seleccione la carpeta que contiene los archivos DICOM que se cargaron en la computadora anteriormente y ábralos. Este paso debería cargar automáticamente todos los archivos DICOM en el panel superior derecho. A continuación, en la pestaña Modo de sonicación , seleccione el modo de tratamiento adecuado eligiendo Ráfaga u Onda continua. Si está en modo de ráfaga, en la pestaña Configuración de sonicación , introduzca la duración de la ráfaga, el período de ráfaga y el número de períodos. Estos parámetros corresponderán a cada lugar de sonicación. Si está en modo de onda continua, introduzca sólo la duración de la sonicación.NOTA: En este estudio, se utilizó el modo de onda continua durante una duración de 120 s. Haga clic en el icono de destino en la parte superior central de la página y seleccione las ubicaciones adecuadas en el corte correcto de la resonancia magnética donde se va a apuntar la región focal de la FUS. Un cuadrado rojo claro con un círculo rojo estará presente donde se haga clic. Se puede elegir más de una selección. A la izquierda de la imagen de resonancia magnética hay una tabla, que se completará con las coordenadas 3D de las regiones focales seleccionadas. En la última columna de la tabla, introduzca el nivel de potencia que se va a sonicar en cada punto focal, que puede calcularse por separado para cada transductor utilizado para obtener los niveles de presión o intensidad deseados. Haga clic en cada punto focal de la tabla para confirmar, lo que dará como resultado que se resalten las coordenadas y la región focal correspondiente en la imagen se volverá azul.NOTA: Consulte la hoja de datos del transductor para determinar cómo traducir el nivel de potencia ingresado en la tabla en presión o intensidad, ya que estos valores son específicos del transductor. Una vez que esté satisfecho con todas las regiones focales, seleccione Prueba de movimiento. Esto hará que el software mueva el transductor a todos los puntos focales para garantizar que los movimientos sean posibles. Después de la confirmación, el software indicará que se ha completado la prueba de movimiento. Si se produce un error, ajuste las regiones focales para que puedan caber dentro de los ejes 3D de los motores del transductor. Una vez listo, seleccione Begin Sonication para comenzar el protocolo de sonicación, moviendo el transductor y aplicando los parámetros FUS correctos en cada región focal seleccionada. Una vez finalizado el protocolo de sonicación, desacople el transductor del brazo del transductor, retire el baño de agua de la plataforma y limpie el gel de ultrasonidos del cuero cabelludo del animal. Desenrosque las barras de mordida y oreja, retire al animal de la cama de resonancia magnética y luego colóquelo en una almohadilla tibia hasta que se despierte de la anestesia. En este punto, regrese al animal a su jaula. Para los animales posteriores, repita el mismo protocolo, a partir de la sección 6. Una vez tratados los animales deseados, limpie todas las superficies tocadas por los animales con etanol al 70% (ver Tabla de Materiales). Salga del software y, a continuación, apague y apague cada equipo. 9. Pasos posteriores al tratamiento Repita el protocolo del sistema de imágenes in vivo (IVIS) de la sección 1 para medir la bioluminiscencia 24 h después del tratamiento. Para analizar la efectividad del tratamiento, compare los registros de bioluminiscencia antes y después del tratamiento para determinar la tasa de crecimiento tanto para los grupos tratados como para los no tratados. Realice resonancias magnéticas de seguimiento con la misma configuración del paso 6.4. Con el uso de exploraciones con contraste, compare la intensidad media en escala de grises de la región tumoral o calcule el volumen total cubierto por el agente de contraste para determinar las diferencias en el volumen tumoral antes y después del tratamiento.

Representative Results

Disminución del tamaño del tumor en animales tratados con SDT 24 h después del tratamiento.El día del tratamiento con SDT, la señal de bioluminiscencia promedio original para los grupos control y tratamiento (N = 4 cada uno) fue de 2,0 x 10 6 ± 3,1 x 10 6 y 2,3 x 10 6 ± 1,3 x 10 6 p/s/cm2/sr, respectivamente. Los valores medios de bioluminiscencia correspondientes al tamaño tumoral antes del tratamiento entre los dos grupos no fueron estadísticamente significativos (p = 0,89). La señal media de bioluminiscencia del grupo de tratamiento fue de 3,57 x 10 6 ± 2,3 x 10 6 24 h después de la SDT, mientras que la señal bioluminiscente del grupo control se incrementó a 5,5 x 10 6 ± 8,2 x 10 6 p/s/cm2/sr. Como se muestra en la Figura 5, esto corresponde a una tasa de crecimiento de 83,4% ± 78% y 172% ± 34%, respectivamente, asumiendo un crecimiento exponencial (p = 0,08). De los cuatro animales tratados, tres tuvieron tasas de crecimiento más bajas después del tratamiento en comparación con los controles. Hubo un valor atípico en el grupo de tratamiento que mostró un crecimiento comparable al de los controles, sesgando las desviaciones. Además, los animales se sometieron a imágenes de RM con contraste al día siguiente del tratamiento para comparar el tumor antes y después del tratamiento. La intensidad promedio en escala de grises del agente de contraste en los tumores se llevó a cabo en cada corte de RM para cada animal para medir la cantidad de agente de contraste que ingresaba a los tumores después del tratamiento, como una estimación del tamaño del tumor. Antes del tratamiento, la intensidad media de la escala de grises del tumor entre los grupos de control y tratados fue similar. En promedio, esta intensidad en escala de grises aumentó en el grupo control a una magnitud mayor que en los grupos tratados, aunque esto no fue significativo (p = 0,47). Estos datos se pueden ver en la Tabla 2. La alta variabilidad de estos resultados se debe potencialmente al hecho de que las resonancias magnéticas se tomaron solo 24 h después del tratamiento, momento en el que el potencial terapéutico de la SDT recién comienza a ocurrir. Aun así, en la Figura 6 se muestra un ejemplo de las lesiones creadas por la SDT. Figura 1: Configuración del sistema FUS. (Arriba) Sistema MRgFUS con componentes etiquetados. (Frente) 1. Plataforma. 2. Brazo transductor motorizado del eje. 3. Transductor FUS. 4. Baño maría. 5. Cama de resonancia magnética. 6. Monitorear. 7. Caja de coincidencia de impedancia del transductor. 8. Caja del amplificador de potencia. 9. Generador de funciones. 10. Canal generador de funciones 1 puerto BNC. 11. Computadora de escritorio. (Abajo) Sistema MRgFUS con esquema de cableado codificado por colores con las siguientes conexiones. (Volver) 1. Cables de alimentación. 2. Monitoree HDMI a HDMI de escritorio. 3. Puerto B USB B a USB A de escritorio. 4. Osciloscopio LAN ethernet a ethernet de escritorio. 5. Ethernet de interfaz de movimiento a ethernet de escritorio. 6. Osciloscopio auxiliar de entrada/salida BNC a entrada AWG BNC. 7. Canal de osciloscopio 1 (frontal) BNC a SYNC BNC. 8. Salida de caja coincidente BNC a entrada de RF coaxial. 9. Salida de RF coaxial a coaxial de caja coincidente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Registro fantasma. (A) Configuración del sistema y software durante el registro fantasma. (B) Captura de pantalla de la pantalla de registro fantasma, donde el círculo rojo es la circunferencia seleccionada de la sección transversal axial. (C) Fantasma colocado en la cama de resonancia magnética, vista superior. (D) Vista lateral del maniquí, donde la línea roja está en el corte axial correspondiente al círculo en C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Colocación de los animales. (A) Cama y cuna para resonancia magnética, con varias partes etiquetadas: 1. Cuna para resonancia magnética. 2. Cama de resonancia magnética estereotáctica. 3. Barras para los oídos. 4. Barra de mordida. 5. Cono de nariz. 6. Orificio de clavija de la cama de la resonancia magnética. 7. Tubos de anestesia con isoflurano. (B) Ilustración que representa la colocación del ratón en la cama de resonancia magnética y la colocación en la base, con la bobina de RF (naranja) (ilustración modificada utilizando la plantilla Biorender 2022). (C) Ilustración que representa la colocación del ratón en la cama de resonancia magnética durante un tratamiento con FUS (ilustración modificada con la plantilla Biorender 2022). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Selección de puntos focales. Ejemplo de selección de un punto de sonicación en un solo animal. Cada columna representa un corte de RM posterior al contraste ponderado en T1, donde cada corte es de 0,5 mm en la dirección proximal (corte 1) a distal (corte 5). El límite tumoral se segmentó manualmente y está delineado en rojo (fila 1), y las ubicaciones de sonicación correspondientes (fila 2) están representadas por un cuadrado verde claro (centro focal máximo) y un círculo azul (circunferencia focal máxima media). Cada ubicación se sonicó durante 2 minutos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Tasa de crecimiento después de SDT. La tasa de crecimiento de los tumores de GBM desde antes hasta 24 h después del tratamiento con SDT en animales tratados y no tratados (control) con tumores intracraneales M59 según la luminiscencia medida. Las barras de error indican la desviación estándar. Se realizó una prueba T de dos muestras de estudiantes para determinar la significación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: Lesión generada por SDT. Resonancias magnéticas potenciadas en T1 antes y después del contraste de un modelo animal con un corte axial representativo que muestra una lesión en el tumor creada por SDT. (Izquierda) Resonancia magnética tomada antes del tratamiento con SDT, con el tumor delineado en rojo. (Medio) Selección del punto focal FUS donde la presión máxima está representada por círculos de color azul claro y las regiones de presión media máxima están representadas por círculos azules. (Derecha) Resonancias magnéticas posteriores a la SDT, en las que el tumor se delinea en rojo. Se muestran las lesiones creadas por SDT y el orificio de la jeringa para la implantación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Secuencia T1 Tiempo de repetición 3000 ms Tiempo de eco 30 ms Grosor de la rebanada 0,5 milímetros Número de rebanadas 25 Espaciado de píxeles 0,187 mm x 0,187 mm Matriz de adquisición 133 x 133 Promedios 4 Tabla 1: Ajustes de RM. Control Grupo SDT Valor P Pre-Tratamiento 7,49 x 10 3 ± 2,2 x 103 7.48 x 10 3 ± 1 x 103 0.99 Post-Tratamiento 8,79 x 103 ± 7,7 x 102  7,95 x 10 3 ± 1,1 x 103  0.33 Diferencia porcentual 16% ± 16% 7% ± 12% 0.47 Tabla 2: Escala de grises de la RM ponderada en T1 mejorada con poscontraste.

Discussion

Se necesitan nuevas opciones terapéuticas y de tratamiento eficaces para los pacientes con GBM. Este protocolo ha esbozado un tratamiento preclínico mediado por FUS para la GBM que actualmente se está investigando exhaustivamente para su traslación clínica. Aunque la SDT tiene un potencial emocionante, todavía hay mucho que entender y optimizar en el entorno preclínico.

Uno de los componentes más importantes de este protocolo es la utilización de FUS guiada por RM para atacar el tumor y lograr la máxima eficacia. Usando un maniquí, se puede crear un espacio de coordenadas 3D, donde a cada píxel de cortes axiales de resonancia magnética se le puede asignar una coordenada. A continuación, un sencillo procedimiento de selección de la ubicación de la sonicación en la imagen de RM informa al transductor hacia dónde apuntar. El sistema FUS preclínico utilizado es muy versátil y aplicable cuando se necesita apuntar a ubicaciones de patología específica, como un tumor, incluidos tumores más profundos que serían difíciles de atacar sin la confirmación de imágenes. Al utilizar el gadolinio como agente de contraste, se obtiene una visualización clara del tumor, lo que permite al usuario tomar decisiones informadas a la hora de elegir los objetivos. La ventaja que tiene la SDT sobre muchos otros tratamientos es que es una terapia específica para el tumor. El FUS de baja intensidad solo debe dirigirse al tejido tumoral, mientras que el parénquima cerebral sano debe permanecer relativamente intacto 3,8.

Los resultados de este experimento ponen de manifiesto cómo las ventajas de este protocolo pueden conducir a resultados terapéuticos similares a otros hallazgos en la literatura para la TDS. La figura 5 muestra que en tan solo 24 horas después del día del tratamiento, hubo una desaceleración del crecimiento tumoral en la cohorte tratada. Aunque es insignificante con este pequeño tamaño de muestra, la significación puede resultar con un mayor número de animales. Este retraso en el crecimiento tumoral es similar a lo mostrado en el artículo pionero sobre este tema de Wu et al. (2019), que exhibió un crecimiento tumoral más lento a lo largo del tiempo en los animales tratados, así como un aumento de los tiempos de supervivencia9.

Las consideraciones que se tuvieron en cuenta al diseñar este protocolo incluyeron la cepa animal, el tipo de tumor y la selección del agente sonosensibilizante. Se eligieron ratones desnudos atímicos para este protocolo por múltiples razones. En primer lugar, el ratón desnudo es más fácil de sonicar, ya que la falta de pelo impide cualquier atenuación. Además, la falta de un sistema inmune permite la implantación de xenoinjertos derivados del paciente (PDX) para que el modelo tumoral se asemeje más a la situación clínica. La desventaja de utilizar un modelo atímico es que el sistema inmunitario no puede ser caracterizado, por lo que en estos estudios no se medirá ninguna respuesta inmunitaria generada por la SDT10. La línea tumoral elegida es una línea PDX agresiva y de rápido crecimiento. El momento del tratamiento es muy importante porque se debe verificar el establecimiento del tumor, pero la carga tumoral no debe llenar el hemisferio craneal. Las diferentes líneas celulares requieren diferentes tiempos de incubación para lograr un tumor de tamaño óptimo para la experimentación preclínica. En este protocolo, se utilizó el 5-ALA como sonosensibilizador debido a su captación preferente en tumores de GBM, lo que se ha confirmado in vitro para esta línea celular en experimentos previos (datos no publicados). Se pueden sustituir y probar otros sonosensibilizadores para determinar el compuesto más adecuado en cuanto a eficacia y seguridad. Finalmente, el tratamiento se inició 3 h después de la inyección de 5-ALA, ya que la literatura previa ha demostrado que este es el momento óptimo con esa dosis de inyección5.

Los parámetros FUS elegidos en este protocolo (10 W/cm2 durante 2 min a 515 kHz en cada localización diana) se decidieron a partir de una revisión de la literatura previa y de los experimentos iniciales 4,9. Se eligió una cuadrícula de puntos de sonicación que cubrían todo el tumor para generar el efecto ROS en todo el tumor. La intensidad utilizada aquí es mayor que la de otras publicaciones, pero en un corto período de tiempo, no se espera que esto conduzca a ningún efecto adverso relacionado con la temperatura, ya que intensidades de hasta 25 W/cm2 se han utilizado con éxito en un modelo de ratón sin efectos secundarios significativos11. Es importante destacar que no se ha publicado en la literatura ningún conjunto estandarizado u optimizado de parámetros de FUS. Por lo tanto, los valores específicos que se informan aquí se pueden ajustar para determinar el conjunto óptimo de parámetros, lo que conduce a la máxima reducción del tejido tumoral mientras se mantiene la seguridad. Además, como las diferentes líneas celulares tienen diferentes niveles de vascularización e hipoxia, es posible que sea necesario ajustar este tratamiento. Hemos demostrado una disminución general del crecimiento tumoral (Figura 5) dentro de las 24 h posteriores al tratamiento con SDT, aunque es necesario optimizar los parámetros y analizar más animales para determinar el efecto máximo de este tratamiento. Las resonancias magnéticas posteriores al tratamiento no muestran la aparición de lesiones creadas por el tratamiento con FUS en el tejido sano, con el efecto localizado en el tejido tumoral (Figura 6). También existe la oportunidad de combinar la SDT con otras técnicas de FUS, como la permeabilización transitoria de la barrera hematoencefálica, para maximizar la captación de 5-ALA en el tumor12. Este protocolo se puede complementar con la realización de diversas técnicas histológicas para comprobar la seguridad y eficacia a nivel estructural. Se puede realizar una tinción de hematoxilina y eosina (H&E) para verificar si hay daño estructural o tumoral13, mientras que se puede realizar una tinción terminal de etiquetado de punta de corte de dUTP de desoxinucleotidil transferasa (TUNEL) para verificar la apoptosis celular14. En cualquier caso, este protocolo presenta un tratamiento seguro y específico para el tumor en el que los cambios son perceptibles incluso 24 horas después del tratamiento, lo que se pone de manifiesto al comparar la tasa de crecimiento de los tumores tratados con SDT y los tumores no tratados, así como al comparar los cortes del tumor antes y después de la sonicación.

Con cualquier protocolo, siempre hay desventajas o limitaciones que deben sopesarse. La principal limitación del protocolo actual es el tiempo y el gasto. Mientras tanto, una de las ventajas de este protocolo es su puntería enfocada automatizada. Para llevar a cabo este procedimiento enfocado, es necesario realizar resonancias magnéticas de cada animal individual para garantizar que el objetivo del tumor sea correcto, un proceso que puede llevar mucho tiempo y ser costoso. Además, dependiendo del número de puntos focales deseados, la cantidad de tiempo para realizar este protocolo podría ser de horas incluso para unos pocos animales, lo que resulta en un bajo número de animales experimentales. A pesar de estos inconvenientes, este protocolo no invasivo dirigido sigue siendo una preferencia factible en comparación con las opciones de cirugía abierta.

En conclusión, este protocolo mostró la capacidad del tratamiento con SDT para disminuir el crecimiento tumoral en el cerebro dentro de las 24 h posteriores al tratamiento, manteniendo el tejido neural sano en un modelo preclínico de ratón. Son necesarios estudios de la eficacia de la SDT y la optimización de los distintos parámetros para aumentar la producción de ROS para que este tratamiento sea clínicamente adecuado. Se deben explorar nuevas vías para el uso de la SDT como modelo terapéutico no invasivo.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen el apoyo financiero del Premio STTR Fase 1 de la Fundación Nacional de Ciencias (NSF) (#: 1938939), del Premio de la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa (DARPA) de ASME (#: N660012024075) y del Programa de Becarios de Investigación Clínica (KL2) del Instituto Johns Hopkins de Investigación Clínica y Traslacional (ICTR), administrado por el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales (NCATS) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Las células fueron compradas y proporcionadas por la Fundación Mayo para la Educación e Investigación Médica.

Materials

0.5% Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 15400054
1 mL Syringes BD 309597
10 µL Hamilton syringe Hamilton Company 49AL65
10 µL Pipette tips USAScientific
1000 mL Flask Corning MP-34514-25
15 mL conical tubes Corning CLS430791
200 Proof ethanol PharmCo 111000200
5 mL pipettes Falcon 357543
50 mL Conical tubes Corning 430290
500 mL filter Corning 431097
5-Aminolevulinic acid hydrochloride  Research Products International A11250
7T PET-MR system Bruker Biospec 70/30
Aluminum foil Reynolds Brand
Amplifier FUS Instruments 2175
Athymic nude mice Charles River Laboratories Strain Code 490
Bone drill Foredom HP4-917
Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004261
Charcoal isoflourane waste container Patterson scientific 78909457
Computer FUS Instruments 2269
Cover glass Fisherbrand 12-545J
Desktop monitor ASUS VZ239H
D-Luciferin Gold Biotechnology LUCK-1G
DMEM Thermo Fisher Scientific 11965092
Electronic shaver Wahl  93235-002
Eppendorf tubes Posi-Click 1149K01
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 16000044
Formalin Thermo Fisher Scientific SF100-20
Function generator Siglent QS0201X-E01B
Gadolinium contrast agent (Gadavist) McKesson Corporation 2068062
Gauze Henry Schein 101-4336
Heat lamp
Heat pad Kent Scientific RT-0501
Hemocytometer Electron Microscopy Sciences 63514-12
Induction chamber Patterson scientific 78933388
Isofluorane vaporizer Patterson scientific 78916954
Isoflurane  Covetrus 29405
Isoflurane system Patterson Scientific 78935903
IVIS spectrum Perkin Elmer 124262
Lightfield microscope BioTek Cytation 5
Nair Church and Dwight Co. 42010553
Ophthalmic ointment  Puralube vet ointment
P-20 pippette Rainin 17008650
Patient derived xenographs Mayo Clinic M59
Penicillin/Streptomyosin Thermo Fisher Scientific 10378016
Phosphate buffered saline Thermo Fisher Scientific 70-011-069
Pippetter Drummond 4-000-101
Povidone-iodine Covetrus PI050CV
RK-50 MRgFUS system  FUS Instruments 2182
Scale
Scalpel blade Covetrus 7319
Scalpel handle Fine Science Tools 91003-12
Screwdriver set Jakemy JM-8160
Skin marker Time Out D538,851
Staple remover MikRon ACR9MM
Stapler MikRon ACA9MM
Staples Clay Adams 427631
Stereotactic frame Kopf Instruments 5000
Stereotactic MRI prototype plastic imaging fixture FUS Instruments
T-25 culture flask Corning 430641U
Transducer and matching box FUS Instruments T515H750-118
Ultrasonic degasser FUS Instruments 2259
Ultrasound gel ParkerLabs  01-08
Water bath FUS Instruments
Xylazine Covetrus 1XYL006
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References

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Mess, G., Anderson, T., Kapoor, S., Thombre, R., Liang, R., Derin, E., Kempski-Leadingham, K. M., Yadav, S. K., Tyler, B., Manbachi, A. Sonodynamic Therapy for the Treatment of Glioblastoma Multiforme in a Mouse Model Using a Portable Benchtop Focused Ultrasound System. J. Vis. Exp. (192), e65114, doi:10.3791/65114 (2023).
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