3次元浮遊バイオリアクターにおけるヒトニューロゲニン2誘導性ニューロンの生産

注:すべての細胞操作、ならびに培養皿および培地調製は、無菌条件下で実行する必要があります。層流フードは、使用前および処理後に、すべての表面を70%エタノールで拭いて完全に洗浄する必要があります。記載されたプロトコルは、CERO 3Dインキュベーターおよびバイオリアクター(以下ではベンチトップバイオリアクターと呼ぶ)におけるニューロン分化のために最適化されている。このベンチトップバイオリアクターは、それぞれ最大容量50mLの特殊なバイオリアクターチューブ用の4つのスロットを備えています。温度とCO2 レベルは連続的に制御され、培養パラメータ(例えば、回転速度と時間)は、各チューブごとに独立して調整されます。すべての吸引ステップは、特に明記されていない場合、吸引ピペットと真空ポンプを使用して実行されています。 1. ヒプソン細胞の培養と増殖 注:このプロトコルでは、操作されたドキシサイクリン誘導性NGN2 hiPSCラインBIONi010-C-13が使用されます。ここで提供される拡張プロトコルは、6 cmのペトリ皿用に最適化されていますが、必要に応じて代替培養フォーマットを使用できます。 6 cmのペトリ皿に、冷たいダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)/F12(-/-)で最終濃度0.083 mg/mL/10 cm2で希釈した基底膜マトリックスをコーティングします。コーティングされた皿を37°Cで少なくとも30分間インキュベートします。注:基底膜マトリックス溶液を調製するための詳細なプロトコルは、製造元の説明書に記載されています。hiPS細胞は、増殖のために代替の細胞外マトリックス上で培養することができます。 EBiSC細胞株ユーザープロトコル21 に従って、フィーダーフリーiPS細胞維持培地+10 μM ROCK阻害剤(Y-27632)で凍結保存されたhiPS細胞を解凍します。60 mmディッシュあたり1×106 生細胞の播種密度が推奨されます。 翌日、ROCK阻害剤を含まないフィーダーフリーiPS細胞維持培地に培地交換を行い、毎日培地交換を行う。 hiPSC培養が60%〜80%の合流点に達したら継代を開始する。分化した領域を確認し、面積が5%を超える場合は手動でコロニーを清掃します。注:未分化のhiPS細胞は、核小体が目立ち、細胞質が少ない丸い細胞として現れます。平らで密集したコロニーは、解凍または継代後早期に形成される。hiPSC培養物の例示的な明視野画像を 図1に示す。さらなる情報は、EBiSC細胞株ユーザープロトコル21に提供される。継代のために、基底膜マトリックスコーティングディッシュとフィーダーフリーiPS細胞維持培地を準備します。 hiPSC培養液から培地を吸引し、Ca2+ およびMg2+を含まない1xダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)中の0.5 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)で細胞を2回すすぎます(DPS [-/-]、材料の表を参照)。 上清を取り除き、1x DPBS(-/-)中の0.5 mM EDTA2 mLを6 cmペトリ皿に加えます。細胞をインキュベーター内で37°Cで3分間インキュベートします。 1.5 mLのEDTA溶液を吸引し、3〜5分間インキュベーションを続けます。 皿を軽くたたいて細胞の剥離を促進します。注意: 目視評価で取り外しを確認してください。hiPSCコロニーは5分後に剥離を開始するはずですが、コンフルエントなhiPSC培養では、より長いインキュベーション時間が必要になる場合があります。コロニーが剥離しない場合は、インキュベーション時間を10分まで増やしますが、この時間枠を超えないようにしてください。 5 mLのフィーダーフリーiPSC維持培地を6 cmのペトリ皿に加え、10 mLの血清学的ピペットまたはワイドボアピペットチップを使用してコロニーを2回静かに再懸濁します。細胞を15 mLチューブに移します。注:hiPS細胞は機械的ストレスに非常に敏感です。したがって、複数回の再中断は避けてください。最終的な細胞懸濁液は、小さなコロニー断片(50〜200μm)からなるべきである。 コーティングした培養皿から上清を吸引し、6 cmディッシュあたり4 mLのフィーダーフリーiPS細胞維持培地を調製します。 小さなコロニー断片を1:10〜1:40の分割比で作りたての培養皿に移し、毎日培地を交換しながら37°C、5%CO2 で培養します。注:小さなコロニーは、継代後1〜2時間以内に付着する必要があります。 図1:ヒト人工多能性幹細胞培養物の形態 。 (A,B)均質な形態と明確なエッジを持つ圧縮されたhiPSCコロニーを示す、異なるコンフルエンスの高品質のhiPSC培養。(c)コロニー縁部(白破線)の周囲に分化した細胞の新たなクラスターを有するhiPS細胞培養。スケールバー= 200μm。略称:hiPSC = ヒト人工多能性幹細胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 2. ベンチトップバイオリアクターシステムにおけるhiPS細胞の事前培養(2日目) 注:hiPSC培養が60%から80%の間の合流点に達したら、前培養を開始します。分化した領域についてhiPSCコロニーを確認してください。この前培養段階では、hiPS細胞はフィーダーフリーのiPS細胞維持培地で2日間維持されます。 フィーダーフリーのiPS細胞維持培地と10 μM ROCK阻害剤(Y-27632)からなる培地を調製します。 iPS細胞から培地を完全に吸引し、1x DPBS(-/-)で細胞を2回穏やかにすすぎます。 2.0 mLの予熱したトリプシン-EDTA溶液を6 cmのペトリ皿に加え、インキュベーター内で細胞を37°Cで3分間インキュベートします。 皿を軽くたたいて細胞の剥離を促進するか、1〜2分長くインキュベートします。 細胞をディッシュあたり5 mLのフィーダーフリーiPS細胞維持培地+ROCK阻害剤に再懸濁します。細胞懸濁液を15 mLまたは50 mLのチューブに移し、ピペッティングで穏やかに混合して細胞の特異化を確実にします。 100 μLの細胞懸濁液中の細胞数を、前述のように自動セルカウンターを用いて決定します20。バイオリアクターチューブあたり15×106 セルの対応する容量を50 mLチューブに移します。 細胞を300 × g で3分間遠心分離します。 上清を吸引し、2 mLのフィーダーフリーiPS細胞維持培地+ROCK阻害剤に細胞を再懸濁します。 各50 mLチューブに18 mLの培地(細胞播種密度0.75 ×10 6 細胞/mL)を入れます。細胞懸濁液をバイオリアクターチューブに分注します(チューブあたり20 mL)。 チューブをバイオリアクターシステムに配置します。次の栽培パラメータを設定します:2秒の回転周期、60rpmの回転速度、攪拌休止なし、37°C、および無制限の期間20の5%CO2。 バイオリアクターディスプレイ から 培養プログラムを開始します。 翌日メディアを交換してください。凝集体をバイオリアクターチューブに~5分間落ち着かせます。上清を注意深く吸引します。注:骨材が互いにくっついて不均一な骨材の懸濁液を構築する可能性があるため、10分以上落ち着かないでください。バイオリアクターチューブに~5 mLの培地を残すことをお勧めします。 ROCK阻害剤を含まない新鮮なフィーダーフリーiPS細胞維持培地をチューブあたり15 mL添加し、ベンチトップバイオリアクターで24時間培養を続けます。 3. iPS細胞の早期神経細胞への分化(0日目) 神経基礎培地(NBM)の調製:安定化L-アラニル-L-グルタミンジペプチドを含む50%DMEM/F-12、50%神経基礎培地、0.5x無血清サプリメント(50x)、ボッテンシュタインのN-1製剤に基づく0.5x無血清サプリメント(100x)、0.5x安定化L-アラニル-L-グルタミンジペプチド、0.5x MEM非必須アミノ酸溶液(100x)、500 nMピルビン酸ナトリウム(100 mM)、50 nM 2-メルカプトエタノール(50 mM)、0.025%ヒトインスリン溶液、および5 U / mLペニシリン-ストレプトマイシン。注:NBMは4°Cで保存する必要があり、最大2週間使用できます。 hiPS細胞培養物にドキシサイクリン(DOX)を添加して神経分化を開始します。このために、骨材をバイオリアクターチューブに落ち着かせます。細胞からの上清を注意深く吸引し、チューブに~5 mLを残し、NBMと2 μg/mL DOXからなる35 mLの神経誘導培地(NIM)を加えます。注意: DOXは光に敏感であるため、作業中はライトをオフにすることをお勧めします。 チューブをベンチトップバイオリアクターに戻し、培養を続けます。 手順 3.2 の説明に従って、メディアの変更を 2 日間毎日実行します。注:浮遊培養で4日後、凝集体を解離させ、初期のニューロンを凍結保存するか、最終成熟のために直接再播種することができます。 4. 初期ニューロンの凍結保存(2日目) 注:凍結保存は必須ではなく、分化プロセスにとって重要ではありませんが、初期のニューロンの大量のストックを生成して、その後の成熟と分析のために保存できるため、強くお勧めします。 凝集体をバイオリアクターチューブに落ち着かせます。前述のように上清を吸引する。 骨材を滅菌済みの15 mLまたは50 mLチューブに移し、1x DPBS(-/-)で骨材を2回静かにすすぎます。凝集体を乱さずにできるだけ慎重に上清を吸引します。 ペレットサイズに応じて、2〜5 mLの予温した細胞解離酵素を加え、細胞を水浴中37°Cで約10分間インキュベートします。凝集体が解離するまで、沈降した骨材を2分ごとに静かに再懸濁します。注:ほぼ均質な細胞懸濁液は、7〜10分のインキュベーション後に取得する必要があります。 予温したNBM培地を3倍量加え、細胞を慎重に再懸濁して、細胞の特異化を確実にします。 細胞数を決定し、凍結保存用の対応する容量を15 mLまたは50 mLのチューブに移します。注:5〜10×106 細胞/ mLの凍結培地の細胞密度が推奨されます。 細胞を300 × g で3分間遠心分離します。 上清を吸引し、10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を含む対応する容量の凍結培地に細胞ペレットを静かに再懸濁します。 凍結保存に適したバイアル(1 mL /バイアル)に細胞懸濁液を分注します。 バイアルをすぐに2-プロパノールで満たされたプレチルドスローレート凍結容器に移し、容器を-80°Cで一晩置きます。バイアルを翌日-150°Cに置いて長期保存します。注意: 液体2-プロパノールは非常に可燃性であり、接触すると目の損傷を引き起こす可能性があります。熱を避け、保護手袋と眼鏡を着用してください。 5. 単層培養におけるhiPS細胞由来神経細胞の成熟 hiPS細胞由来ニューロンの長期培養のためのポリ-L-オルニチン/ラミニンコーティング培養皿を準備します。ポリ-L-オルニチンストック溶液を1x DPBS(-/-)で0.001%に希釈し、4°Cで一晩、または37°Cで4時間ディッシュをコーティングします。 ポリ-L-オルニチン溶液を吸引し、プレートを1x DPBS(-/-)で1回洗浄します。 ラミニン溶液を1x DPBS(-/-)で最終濃度10 μg/mLに希釈し、4°Cで一晩、または37°Cで4時間インキュベートします。注意: コーティング手順には0.1〜0.15 mL/cm 2の容量が推奨され、すべての洗浄ステップではcm2あたり0.2 mLが推奨されます。代替のコーティング基材を使用することもできますが、細胞の付着と成熟に対する潜在的な影響を評価する必要があります。 凍結保存された細胞を解凍します。このために、クライオバイアルを水浴(37°Cに設定)に入れ、凍結細胞懸濁液の小さな塊が残るまで約1分間回転させます。 細胞懸濁液を、10 mLの予熱したNBMで調製した15 mLチューブに慎重に滴下します。クライオバイアルを1 mLのNBMですすぎ、細胞懸濁液を同じ15 mLチューブに移します。 細胞を300 × g で3分間遠心分離します。 上清を吸引し、10 μM ROCK阻害剤を添加した1〜2 mLのNIMを追加します。 細胞ペレットを注意深く再懸濁し、細胞数を決定します。 コーティングした細胞培養皿から残りのラミニン溶液を吸引し、10 μM ROCK阻害剤を添加したNIMに1×105 細胞/cm2の播種密度で細胞を播種します。 24時間後に培地をROCK阻害剤なしのNIMに切り替えます。 4日間、毎日培地交換を行います。 NGN2誘導のこの初期段階の後、DOXを省略し、NBMで細胞を培養し、成熟の所望の段階に達するまで週に2回ハーフ培地交換を行います。注:iNGN2ニューロンとアストロサイトとの共培養は、細胞の生存、付着、成熟、および電気的活動を増加させるために推奨されます13,22。 6. ヒPS細胞由来ニューロンのキャラクタリゼーション 注:神経細胞誘導体への分化は、以下の手法によって評価することができる。 免疫細胞化学とイメージングhiPS細胞由来のニューロンから培地を吸引し、Ca2+ およびMg2+ (+/+)を含む1x DPBSで細胞を1回洗浄します。注:細胞が表面から非常に簡単に剥がれる可能性があるため、慎重に、優先的にウェルエッジでピペットを貼ってください。1x DPBS (+/+) で細胞を完全にカバーするために、すべての洗浄ステップで 0.2 mL/cm2 の容量が推奨されます。 DPBS中の4%パラホルムアルデヒド(+/+)を含む固定溶液を使用して、室温(RT)で15分間神経細胞を固定します。cm2 あたり0.1mLの容量が推奨されます。注:DPBS中のパラホルムアルデヒド(4%)は、急性毒性と潜在的な発がん性を伴う危険で皮膚刺激性の溶液です。.熱を避け、保護手袋と眼鏡を着用し、吸入を避け、換気された環境でのみ溶液を使用してください。 細胞を1x DPBSで2回(+/+)穏やかにすすぎ、染色を続行します。注:固定セルは、さらに処理されるまで、DPBS(+/+)で4°Cで最大1か月間保存できます。 サンプルからDPBSを吸引(+/+)します。細胞を透過処理し、1%のBSAと0.2%のTriton-X-100を含む1x DPBS(+/+)でRTで60分間非特異的結合部位をブロックします。注:cm2 あたり0.2mLの容量が推奨されます。 上清を除去し、染色バッファー(1%BSAを含む1x DPBS [+/+])で希釈した各一次抗体を用いて、細胞を4°Cで一晩インキュベートします( 材料の表を参照)。セルが溶液で完全に覆われていることを確認してください。注:cm2 あたり0.1〜0.15mLの容量が推奨されます。 染色バッファーを吸引し、細胞を1x DPBSで3回すすぎます(+/+)。 対応する二次抗体( 材料の表を参照)を染色バッファーで最終濃度1:1,000に希釈します。 細胞を希釈した抗体溶液中で、暗所のRTで1時間インキュベートします。セルが溶液で完全に覆われていることを確認してください。注:cm2 あたり0.1〜0.15mLの容量が推奨されます。 二次抗体溶液を吸引し、1x DPBSで細胞を2回すすぎます(+/+)。 DPBSで希釈した4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)でRTで5分間対比染色します。注:cm2 あたり0.1〜0.15mLの作業容量をお勧めします。 細胞を1x DPBSで2回すすぎます(+/+)。 イメージングするまで、細胞をDPBS(+/+)で4°Cで保存します。注:明視野イメージングは、形態学的変化と神経突起の成長を追跡するのに適しています。さらに、常同型マーカー発現は、蛍光顕微鏡によって評価することができる。未分化なiPS細胞はOCT 3/4とNANOGを発現しますが、β-III-チューブリン(TUBB3)と微小管関連タンパク質2(MAP2)は、神経突起と軸索を視覚化するための神経細胞マーカーとして機能する可能性があります。神経突起ネットワークは、明視野または蛍光画像において神経突起の長さを決定することによってさらに評価することができる。 定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)による遺伝子発現解析培地を吸引し、1x DPBS(-/-)で細胞を1回すすぎます。注:cm2 あたり0.2mLの容量が推奨されます。 コールドRNA溶解バッファーを添加し、スクラッチによって細胞を回収します。 適切なカラムベースのキットを使用してRNAを単離し、UV光分光法によりRNA濃度を測定します。 250 ngの総RNAと逆転写に適したキットを使用してcDNAを生成します。 2.5 ngのcDNAを二重に含む分子ビーコンqPCR反応を準備します。適切なマスターミックスおよび対応するプライマーアッセイ20 を使用する( 材料の表を参照されたい)。 プライマーアニーリングを60°Cで20秒間45サイクル適用して、qPCRを実行します。 相対遺伝子発現レベルをハウスキーピング遺伝子GAPDH、HPRT1、およびGUSBの平均に正規化します。ΔΔCt法23を適用し、未分化ヒジプロニクスをキャリブレータとして使用します。