Kwantificering van globale histon posttranslationele modificaties met behulp van intranucleaire flowcytometrie in geïsoleerde microglia in de hersenen van muizen

Alle protocollen voor dierenverzorging zijn goedgekeurd door het Animal Care Committee van de University of British Columbia in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care. 1. Hersenvertering voor microglia-isolatie Figuur 1: Eenvoudig stroomschema van het protocol. De muizen worden eerst transcardieel geperfundeerd met HBSS en de hersenen worden ontleed. De hersenen worden vervolgens gedissocieerd door chemische vertering en mechanische verstoring om te resulteren in een homogenaat van één cel. De immuunverrijkte fractie wordt verzameld via discontinue dichtheidsgradiënt, waarna de cellen worden gekleurd voor P2RY12. Gekleurde cellen worden ofwel 1) gesorteerd via fluorescerende geactiveerde celsortering (FACS) om te leiden tot RNA-analyse of stroomafwaartse eiwitanalyse en/of 2) gefixeerd, gepermeabiliseerd en gekleurd voor intranucleaire eiwitten. Het eiwitniveau wordt gekwantificeerd door de mediane fluorescentie-intensiteit in het kanaal van belang, bepaald door flowcytometrie. Blauw gekleurde vakjes maken deel uit van protocolstap 1) Hersenvertering voor microglia-isolatie. Rood gekleurde vakjes maken deel uit van protocolstap 2) Intranucleaire stroomkleuring voor eiwitexpressieanalyse. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Bereiding van reagentiaOPMERKING: Als u een extractie plant om zowel RNA als cellen te verzamelen voor HPTM-analyse, raadpleeg dan rubriek 1.7.1 voor wijzigingen om transcriptie- en translatieremmers op te nemen. Dit is echter niet vereist als alleen het eiwitsignaal wordt beoordeeld, aangezien de cellen grotendeels in rust zijn wanneer ze op ijs worden bewaard.Fluorescentie-geactiveerde celsorteringsbuffer (FACS) (20 ml per monster): Los runderserumalbumine (BSA) op in 1x Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) om een 2% BSA-oplossing te creëren. Los EDTA op tot een eindconcentratie van 1 mM in de 2% BSA-oplossing. Filter steriliseer met een filter van 0,2 μm en bewaar bij 4 °C gedurende maximaal 1 week voor gebruik. Digestiebuffer (1 ml per monster): Reconstitueer een injectieflacon papaïne in HBSS tot een eindconcentratie van 20 E/ml in 1 mM L-cysteïne met 0,5 mM EDTA. Activeer bij 37 °C gedurende minimaal 10 minuten of totdat het weefsel klaar is om te verteren. Voeg vlak voor gebruik DNase I toe aan de geactiveerde papaïneoplossing tot een eindconcentratie van 200 E/ml. Bereid dit voor op de dag van het experiment en bewaar het niet. Isotone dichtheidsgradiëntoplossing (5,5 ml per monster): Voeg 10x HBSS toe aan koud dichtheidsgradiëntmedium tot een eindconcentratie van 1x HBSS, wat resulteert in een einddichtheid van 1,117 g/ml. Vortex minimaal 30 seconden mengen voor gebruik. Leg op ijs tot gebruik. 37% dichtheidsgradiëntoplossing (4 ml per monster): Voeg isotone dichtheidsgradiënt toe aan 1x HBSS om een eindconcentratie van 37% te maken met een einddichtheid van 1,043 g/ml. Voeg 20 μL fenolrood toe voor elke ml met een dichtheidsgradiënt van 37% om een roze oplossing te maken voor visualisatie tijdens het aanbrengen van lagen. Vortex minimaal 30 seconden voor gebruik. Leg op ijs tot gebruik. 70% dichtheidsgradiëntoplossing (2 ml per monster): Voeg isotone dichtheidsgradiënt toe aan 1x HBSS om een eindconcentratie van 70% te maken met een einddichtheid van 1,082 g/ml. Voeg 5 μL trypanblauw toe voor elke ml medium met een dichtheid van 70% om een blauwe oplossing te maken voor visualisatie tijdens het aanbrengen van lagen. Vortex minimaal 30 seconden voor gebruik. Leg op ijs tot gebruik. Perfusie en hersendissectieOPMERKING: Het perfusieprotocol is vergelijkbaar met Posel et al. met videoweergave van thoracotomie van muizen, transcardiale perfusie en hersenverwijdering21. Hier gebruiken we volwassen C57BL/6J mannelijke en vrouwelijke muizen (10-15 weken oud, 20-30 g), maar dit protocol kan worden gebruikt om een thoracotomie uit te voeren voor elke muis. Alle dierproeven moeten worden goedgekeurd door de ethische commissie van de instelling voordat experimenten worden uitgevoerd.Muisanesthesie: Verdoof muizen met 4% isofluraan in 100% zuurstof tot voorbij het vlak van chirurgische anesthesie, wat kan worden bevestigd met een teenknijp of een gebrek aan reflex bij het stevig knijpen in de voet van de muis. Plaats de muis op zijn rug en speld zijn vier poten stevig vast in het chirurgische dissectiebord dat gekanteld in een plastic bakje is geplaatst, zodat de neus vastzit in de isofluorane neuskegel. Zorg er na de overdracht voor dat het dier nog steeds voorbij het chirurgische anesthesievlak is voordat u verder gaat. Muis thoracotamie: Pak de buikhuid vast en til deze op met een pincet en maak een ondiepe incisie door de huid en buikwand om de xyphoid bloot te leggen zonder de dalende aorta of onderliggende organen te beschadigen. Pak de xyphoid vast met een tang en maak laterale incisies onder de ribbenkast om het middenrif en de lever bloot te leggen. Maak voorzichtige ondiepe sneden door het middenrif over de lengte van de ribbenkast met een fijne schaar en door de ribbenkast met een weefselschaar en speld het borstbeen vast aan het operatiestation in de buurt van de kop van de muis om het hart en de longen bloot te leggen voor transcardiale perfusie. Transcardiale perfusie: Bereid een peristaltische perfusiepomp voor en bevestig een naald van 26.5 G aan het ene uiteinde van de slang. Bereid de slang voor op de procedure door het ene uiteinde van de slang in een injectieflacon met koude 1x HBSS te steken en de pomp in te schakelen om de slang volledig te vullen met 1x HBSS. Terwijl u het hart met een stompe tang vasthoudt, steekt u de punt van een naald van 26.5 G met de bijgevoegde perfusieslang in de linker hartkamer van het hart en maakt u een kleine incisie in het rechter atrium. Zet de perfusiepomp aan om de muis voorzichtig te doordrenken met een snelheid van ~2-4 ml/min met minimaal 15-20 ml koude 1x HBSS.OPMERKING: Een volledige perfusie is vaak geïndiceerd wanneer de lever bloed begint te zuiveren en dezelfde kleur krijgt als het hart. Hersenverwijdering: Onthoofd de muis met een weefselontleedschaar en maak een incisie in de middellijn in de hoofdhuid van nek tot neus. Trek de huidflappen naar de zijkanten om de schedel bloot te leggen en verwijder overtollig weefsel en botten aan het staartuiteinde van de schedel met een ontleedschaar. Schuif voorzichtig een blad van de schaar onder de schedel in het foramen magnum met de scherpe kant naar het bot gericht en knip voorzichtig de middellijn naar de neus toe. Maak zijwaartse sneden aan zowel de basis van de schedel als bij de neus met behulp van een ontleedschaar. Gebruik een fijne pincet om de schedel van de middellijn naar de buitenkant te leven om de schedelstukken af te breken en de hersenen bloot te leggen. Til de hersenen voorzichtig op met een spatel en plaats ze op dissectiepapier. Hersendissectie: Plaats de hersenen op een stuk dissectiepapier bevochtigd met 1x HBSS bovenop een gesloten petrischaal gevuld met ijs. Verwijder het cerebellum en snijd de hersenhelften in tweeën met een schoon scheermesje. Verwijder de hersenstam, het striatum en de witte stof van elk halfrond, terwijl de hippocampus en de overlappende cortex intact blijven. Breng de hemisferen met geïsoleerde cortex en hippocampusweefsel over in een buis van 15 ml met 5 ml koude 1x HBSS en bewaar op ijs.OPMERKING: Het is belangrijk om de dissecties zo snel mogelijk uit te voeren, zodat het weefsel koud blijft met niet meer dan 2 minuten tussen de onthoofding en het uiteindelijk plaatsen van ontleed weefsel in 1x HBSS op ijs. Als microglia van meerdere dieren worden geïsoleerd, kunnen hersenen gedurende ~1 uur op ijs worden bewaard in 1x HBSS voordat wordt doorgegaan met het verwerken van het hele cohort dieren voor spijsvertering enz. Spijsvertering en homogenisatie van de hersenenMechanische en chemische dissociatie: Plaats het hersenweefsel van elke muis en 1 ml spijsverteringsbuffer in individuele petrischaaltjes op ijs. Snijd de hersenen met een schoon scalpelmesje grondig in kleine stukjes (<1 mm). Snijd de punt van een plastic transferpipet af en breng elk van de gehakte hersenen voorzichtig over in afzonderlijke putjes in een plaat met 24 putjes op ijs. Bedek de plaat met transparante flexibele folie en incubeer 30 minuten op ijs.OPMERKING: Als het op de juiste manier wordt gehakt, lijkt het hersenweefsel op goed gehakte knoflook. Dounce homogenisatie: Breng verteerde hersenoplossing van elk putje over in individuele glazen dounce-homogenisatoren van 7 ml op ijs, elk gevuld met 5 ml koude FACS-buffer. Klop elk brein voorzichtig met de losse stamper (A), ongeveer 30-40 keer, totdat een eencellige suspensie is verkregen. Na het douncen met de A-stamper, voorzichtig 3-4 keer met de strakke stamper (B) deppen om een eencellige suspensie te garanderen.NOTITIE: Duw de stamper niet meer dan 3/4 van de weg naar beneden om te voorkomen dat het weefsel aan de onderkant van de homogenisator wordt verpletterd. De uiteindelijke oplossing moet ondoorzichtig en melkachtig zijn.OPMERKING: Als u meerdere hersenen in één experiment verteert, moet u de overdracht van de hersenvertering naar de FACS-buffer zo timen dat elk monster slechts 30 minuten in de digestiebuffer zit. Oververtering kan leiden tot splitsing van oppervlakte-eiwitten, waardoor stroomafwaartse antilichaambinding en -signaal worden verminderd. Het verkrijgen van een immuunverrijkt fragmentDichtheidsgradiënt vaststellen: Breng het homogenaat van elk brein over in afzonderlijke polypropyleenbuizen van 15 ml en voeg 2.125 ml isotone dichtheidsgradiënt toe en top tot 8.5 ml met FACS-buffer voor elk om een uiteindelijke concentratie van 25% dichtheidsgradiënt te verkrijgen. Keer de tubes van 15 ml voorzichtig 20x om om goed te mengen. Gebruik een transferpipet met smalle schaalverdeling en breng voorzichtig 4 ml met een dichtheidsgradiënt van 37% aan op elke buis, waarbij u zeer voorzichtig bent om schone lagen te vormen. Schakel de transferpipetten om en leg voorzichtig 2 ml met een dichtheidsgradiënt van 70% onder de laag (Figuur 2A). Breng over naar een centrifuge die is afgekoeld tot 4 °C en draai gedurende 20 minuten op 500 x g met de remhelling op nul. Immuunverrijkt fragment verzamelen: Gebruik schone transferpipetten om de myeline voorzichtig op te zuigen vanaf de bovenkant van het volume in de buis van 15 ml met behulp van een schone transferpipet en gooi deze weg. Verzamel voorzichtig het bovenste fragment van de dichtheidsgradiënt in een schone polypropyleen buis van 15 ml met behulp van een transferpipet. Verzamel voorzichtig het immuunverrijkte fragment (1,5 ml boven en 1,5 ml onder waar de 70% en 37% dichtheidsgradiëntlagen samenkomen) in een nieuwe polypropyleen buis van 15 ml (Figuur 2B). Voeg 10 ml FACS-buffer toe aan het immuunverrijkte monster om het dichtheidsgradiëntmedium te verdunnen en keer de buis voorzichtig 20x om om grondig te mengen.OPMERKING: Aangezien cellen de neiging hebben om aan de zijkanten van het buisje te blijven kleven, moet u ervoor zorgen dat u alle cellen in het monster verzamelt tijdens de verzamelstappen door de pipet langzaam langs de zijkanten van het buisje te cirkelen terwijl u de vloeistof opvangt. Pelleteer de cellen in het immuunverrijkte monster door de buisjes van 15 ml gedurende 10 minuten in een centrifuge van 4 °C bij 500 x g te centrifugeren met de aftraprem op nul. Verwijder onmiddellijk na het centrifugeren het supernatans voorzichtig en laat ongeveer 300 μL vloeistof achter in de buis van 15 ml, waarbij u ervoor zorgt dat u de pellet (die mogelijk niet zichtbaar is) niet verstoort. Verzamel het supernatans in een andere buis van 15 ml om ervoor te zorgen dat de cellen in de spin zijn gepelleteerd (gooi deze fractie weg zodra verificatie met het celgetal van de geresuspendeerde pellet is voltooid). Na het resuspenderen van de celpellet in het volume van 300 μL met behulp van een P1000-pipet, telt u de cellen met een hemacytometer om de totale celopbrengst te schatten. Figuur 2: Verkrijgen van het immuunverrijkte fragment door discontinue dichtheidsgradiënt. (A) Het hersenhomogenaat wordt gemaakt tot 25% dichtheidsmedium, onderlaag 4 ml van 37% dichtheidsmedium roze gekleurd via fenolrood en 2 ml van 70% dichtheid medium blauw gekleurd via trypanblauw. (B) Na het centrifugeren zijn de fracties gescheiden. Microglia bevindt zich op het grensvlak van mediafragmenten met een dichtheid van 37% en 70%. Het myelinefragment bevindt zich aan de bovenkant van de buis van 15 ml en wordt weggegooid. Het bovenste fragment wordt verzameld als back-up voor het geval de spin mislukt en er geen cellen worden hersteld. Als dat gebeurt, kan de gradiënt worden herhaald met behulp van deze breuk. De immuunverrijkte fractie wordt stroomafwaarts verzameld. De onderste fractie met rode bloedcellen blijft in het buisje en wordt weggegooid. (C) Voorbeeldfiguur met volledige lagen. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Extracellulaire antilichaamkleuringBlokkeren: Breng de cellen over naar een ronde bodem met 96 putjes op ijs en centrifugeer bij 500 x g met rem om de cellen te pelleteren. Verwijder het supernatans snel in de gootsteen door op de plaat te tikken om het supernatant weg te gooien, waarbij de celpellet intact blijft op de bodem van de put. Resuspendeer de cellen in 50 μL FACS-buffer met anti-muis CD16/32 FC-receptorblokkerend reagens met behulp van een P200-pipet (eindconcentratie 10 μg/ml, verdunningsfactor 1:50) om niet-specifieke binding van antilichamen aan monocyten of andere FcR-dragende cellen te voorkomen. Incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Antilichaamkleuring: Bereid het juiste volume van een 2x mastermix met P2RY12-allophycocyanine (APC; verdunningsfactor 1:50, concentratie 4 μg/ml voor een uiteindelijke putconcentratie van 1:100, concentratie 2 μg/ml) en violet 525 levende dode kleuring (verdunningsfactor 1:50 voor een uiteindelijke putconcentratie van 1:100). Voeg 50 μl van het kleuringsmengsel toe aan de celsuspensie (verkregen na blokkering in punt 1.5.1) en incubeer de plaat gedurende 30 minuten in het donker op ijs.OPMERKING: Voor dit protocol presenteren we het kleuren van de cellen met P2RY12. Ten eerste is P2RY12 een homeostatische marker voor microglia die in bepaalde ziektecontexten kan worden gedownreguleerd. 5XFAD Alzheimer-modelmuizen hebben bijvoorbeeld de P2RY12-niveaus verlaagd, waardoor ze moeilijk te identificerenzijn 22. Alternatieve beitsen die voor de isolatie kunnen worden gebruikt, zijn Tmem119, Cd11b en CD4523. Ten tweede kan het geconjugeerde fluorochroom APC worden aangepast aan het gewenste panel van antilichamen. Het kiezen van een helder fluorochroom, zoals APC of PE, zal er echter voor zorgen dat de positieve en negatieve populaties gemakkelijk te onderscheiden zijn24. Voeg na het kleuren 200 μL FACS-buffer rechtstreeks toe aan elk putje om de cellen te wassen. Centrifugeer op 500 x g bij 4 °C om het supernatans te verwijderen door te tikken. Resuspendeer cellen in 200 μL FACS-buffer met een P200-pipet, draai ze rond bij 500 x g bij 4 °C en tik op de plaat om de buffer uit de putjes te verwijderen. Voorbereiding van de stroomregelingen: Scheid voorafgaand aan de kleuring de benodigde hoeveelheden cellen van elk monster na het blokkeren in stap 1.5.1 voor de vereiste stroomregelingen.OPMERKING: Stroomregelaars zijn vereist voor elk experiment om de poorten tot stand te brengen. De stroomregelaars kunnen worden genomen van een extra dier of van een fractie van elk van de proefputten. Zorg er bij het splitsen van cellen voor dat u voldoende cellen per controle toewijst, aangezien 10.000-30.000 cellen per controle nodig zijn om poorten met hoge betrouwbaarheid tot stand te brengen.Er zijn drie relevante stroomregelingen: geen vlek, levend dood en P2RY12 isotypecontrole. Voeg voor de controle zonder vlekken geen antilichamen toe. Behandel cellen in de P2RY12-isotypecontrole met levensvatbaarheidskleurstof (1:100) en een isotypecontrole-antilichaam geconjugeerd aan APC (1:100). Om de levende dode controle voor te bereiden, aliquot cellen in een apart putje en de helft van het celvolume in een buis van 500 μL verplaatsen. Plaats de buis van 500 μl gedurende 5 minuten in de vriezer van -80 °C, gevolgd door plaatsing in de incubator van 37 °C gedurende 5 minuten om de cellen te doden. Breng de hoeveelheid dode cellen terug in de levende dode controleput en kleur met een aminebindende levensvatbaarheidskleurstof op violet 525 (verdunningsfactor 1:100) om dode cellen te markeren.OPMERKING: Het protocol is geschreven voor het kleuren van platen met een flick-methode voor het verwijderen van supernatans. Dit vereist echter dat het supernatans onmiddellijk na voltooiing van de spin wordt verwijderd en dat de flick met voldoende kracht wordt gedaan om het supernatans snel te verwijderen zonder de pellet te verstoren. Als alternatief kunnen 1,5 ml RNAse/DNase-vrije buisjes worden gebruikt voor de kleuring, met de volgende aanpassingen: Breng de cellen over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en pellet op 800 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig supernatans op met pipetten. Tip: Voor snelheid kan een overdrachtspipet van 5 ml met een P200-tip het supernatant snel en nauwkeurig opzuigen. Controleer bij het aanzuigen op de pellet. Als de pellet niet zichtbaar is, laat dan 50 μL supernatans over en pas de berekeningen dienovereenkomstig aan. Voeg bij het uitwassen van antilichamen extra FACS toe om de verdunning van antilichamen te verhogen (1000 μL in plaats van 200 μL) om rekening te houden met onvolledige verwijdering van supernatant. Afhankelijk van de cytometer gebruikt u de buisjes van 1,5 ml voor het sorteren, waardoor er minder benodigdheden nodig zijn. FACS-sortering voor microgliaBereiding: Resuspendeer elk putje in 200 μL FACS-buffer met een P200-pipet en breng het over in gelabelde flowsorteerbuizen en voeg FACS-buffer toe tot een totaal van 500 μL voor een concentratie van ongeveer 5 x 105 events per ml. Bewaar op ijs in het donker tot analyse. Bereid nasorteerbuisjes voor door 100 μL FACS-buffer toe te voegen als buffer voor cellen in 1,5 ml RNAse-vrije buisjes. Cytometerinstellingen: Sorteer cellen op een flowcytometriecelsorteerder die is opgesteld met het mondstuk van 100 μm. Sorteer cellen met 18-20 psi. Gating: Poort op de cytometer voor celgrootte met behulp van side-scatter (SSC)-gebied versus voorwaartse scatter (FSC)-hoogte met behulp van de no-stain-controle om puin te helpen onderscheiden, plaats SSC-A op een log-as om een celpopulatie te visualiseren en poort nauwkeurig om cellen te selecteren (poort S1; Figuur 3). Om eventuele doubletten te verwijderen, zet u FSC-H versus FSC-W uit en plaatst u een poort dicht rond de celpopulatie en verwijdert u al het puin en doubletten (poort S2). Gebruik de P2RY12-isotypecontrole om de cellen in het APC-kanaal te onderzoeken en de poort voor autofluorescentie in te stellen om P2RY12+-cellen te bepalen. Gebruik de controles zonder vlekken en levende dode cellen die niet fluorescerend zijn op violet 525 nm als levende cellen. Sorteren: Plot violet 525 nm vs APC en bepaal de populatie die P2RY12+ is en leeft volgens FMO’s (MG). Sorteer die cellen in de gelabelde postsorteerbuis (Figuur 3). Het uiteindelijke sorteerpercentage is ongeveer 50% van het totale aantal gebeurtenissen, waarbij het grootste deel van het totale verlies van de gebeurtenis bestaat uit puin dat wordt verwijderd in poort S1 (~70% van de gebeurtenissen zijn cellen; Tabel 1). RNA-isolatie en -analyseTranscriptie- en translatieremmers: Als u RNA-extractie plant, om het risico van isolatie-geassocieerde transcriptomische handtekeningen te elimineren, neem dan translatie- en transcriptieremmers op in de bufferstappen. Bereid de remmercocktail zoals beschreven door Marsh et al. inclusief actinomycine D, anisomycine en triptolide25.Bereiding van de remmer: Reconstitueer de remmervoorraden en bewaar als volgt: Reconstitueer actinomycine D in dimethylsulfoxide (DMSO) tot 5 mg/ml en bewaar bij -20 °C. Reconstitueer triptolide in DMSO tot 10 mM en bewaar bij -20 °C, beschermd tegen licht. Reconstitueer anisomycine in DMSO tot 10 mg/ml en bewaar bij 4 °C, beschermd tegen licht. Bewaar alle remmervoorraden niet langer dan 1 maand nadat ze zijn gereconstitueerd. Buffermodificaties: Voeg als volgt remmers toe in vier verschillende buffers in het protocol: Bereid bij het uitvoeren van de transcardiale perfusie HBSS met actinomycine D (5 μg/ml, 1:1000 uit voorraad) en triptolide (10 μM, 1:1000 uit voorraad). Na perfusie worden de hersenen naar het laboratorium vervoerd in HBSS met actinomycine D (5 μg/ml, 1:1000 uit voorraad), triptolide (10 μM, 1:1000 uit voorraad) en anisomycine (27,1 μg/ml, 1:368,5 uit voorraad). Bereid FACS-buffer met actinomycine D (5 μg/ml, 1:1000 uit voorraad), triptolide (10 μM, 1:1000 uit voorraad) en anisomycine (27,1 μg/ml, 1:368,5 uit voorraad). Bereid de digestiebuffer met actinomycine D (5 μg/ml, 1:1000 uit voorraad), triptolide (10 μM, 1:1000 uit voorraad) en anisomycine (27,1 μg/ml, 1:368,5 uit voorraad). Bereid na het sorteren wasbuffer met HBSS met actinomycine D (5 μg/ml, 1:1000 uit voorraad), triptolide (10 μM, 1:1000 uit voorraad) en anisomycine (27,1 μg/ml, 1:368,5 uit voorraad).NOTITIE: Wanneer u de remmers toevoegt, zorg er dan voor dat u ze onmiddellijk voor gebruik toevoegt en bescherm alle voorbereide buffers tegen licht tijdens gebruik. Vermijd bevriezing-dooi van voorraadoplossingen. Wassen na het sorteren: Omdat de cellen zijn gesorteerd in 1,5 ml RNasevrije buisjes in FACS-buffer, die de RNA-isolatie verstoren, is het noodzakelijk om de cellen te wassen. Draai de cellen gedurende 5 minuten op 1000 x g bij 4 °C en verwijder het supernatant, zodat er ongeveer 50 μL vloeistof overblijft. Voeg 200 μL 1x HBSS bevattend actinomycine D (5 μg/ml, 1:1000 uit voorraad), triptolide (10 μM, 1:1000 uit voorraad) en anisomycine (27,1 μg/ml, 1:368,5 uit voorraad) toe en meng goed. Herhaal het centrifugeren en verwijder het supernatant, waardoor er 50 μL vloeistof overblijft (was 1). Voeg 200 μL wasbuffer na het sorteren toe, meng grondig en herhaal het centrifugeren en verwijder het supernatans, waardoor er 25 μL vloeistof overblijft (was 2). RNA-extractie: Gebruik voor RNA-isolatie uit microgliacellen een RNA-isolatiekit met lage input voor hoge en consistente RNA-opbrengsten en RIN-scores boven de 9 (zie hieronder en Materiaaltabel voor productaanbevelingen). Voeg aan de celkorrel 350 μL lysisbuffer uit de aanbevolen kit + β-mercaptoethanol (1:100) toe en meng goed.OPMERKING: Indien nodig kan het protocol op dit punt worden opgeschort. Monsters kunnen worden opgeslagen in de lysisbuffer bij -80 °C tot RNA-extractie. Als RNA na opslag wordt geëxtraheerd, ontdooi het lysaat dan op ijs en ga verder met de kitspecifieke instructies voor de isolatie. Breng lysaat over in een kolomvormige celvernietiger (zie de materiaaltabel voor productaanbevelingen) en centrifugeer gedurende 2 minuten op maximale snelheid bij 4 °C. Elute in minimaal 14 μL RNasevrij water en bepaal de concentratie indien van toepassing. RNA kan na dit punt worden gebruikt voor elke stroomafwaartse toepassing. Figuur 3: Poortstrategie voor stroomsortering. Gebeurtenissen worden gated voor celgrootte op SSC-A versus FSC-H (S1). Vervolgens worden cellen afgeschermd als singlets op FSC-H versus FSC-W (S2). Singletcellen worden gesorteerd als levend indien negatief op Comp-FL8-A::405-526-52 (violette 525 levende dode vlek) en als P2RY12+ indien positief op Comp-FL32-A::640-671_30 (P2RY12-APC) met behulp van de P2RY12-isotypecontrole. Cellen worden gelabeld als MG en gesorteerd als ze zowel levend als P2RY12+ zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. OMHEINDE BEVOLKING Frequentie van ouder Frequentie van de totale Tellen S1 68.10% 68.10% 162186 S2>S1 93.59% 63.70% 151707 P2Ry12+ (670+) > S2 > S1 83.05% 52.90% 125986 Live (525-) > S2 > S1 92.78% 59.10% 140752 MG (P2RY12+ Live) >S2>S1 78.96% 50.30% 119794 Tabel 1: Voorbeeld van een voorbeeldtabel met afstammingspercentages en verwachte gebeurtenisnummers. 2. Intranucleaire stroomkleuring voor analyse van eiwitexpressie OPMERKING: Andere celtypen kunnen op dit punt worden gestart, dit protocol wordt getest met gekweekte cellen, waaronder HEK293-cellen, BV2-microglia-achtige cellen en menselijke IPSC-afgeleide microglia. Fixatie en kleuring van cellenOPMERKING: Gebruik voor het volgende protocol een intracellulaire kleuringskit die is geoptimaliseerd voor nucleaire kleuring. Zien Tabel met materialen voor productaanbevelingen.Aliquot extracellulair gekleurde cellen uit sectie 1.5.2 in een plaat met 96 putjes (5 x 104- 1 x 106 cellen). Draai de cellen 5 minuten op 500 x g bij 4 °C en veeg om de FACS-buffer te verwijderen.OPMERKING: Om gegevens met een hoge betrouwbaarheid van de mediane niveaus te verkrijgen, moeten minimaal 10.000 cellen per put worden gebruikt. Hoewel er geen aanbevolen maximum is, is het het beste om het aantal cellen gedurende het hele experiment consistent te houden om ervoor te zorgen dat er geen significant effect is van verschillende variatiecoëfficiënten (CV). Fixatie en permeabilisatie: Voeg 200 μL 1x fix-concentraat toe en meng voorzichtig met de P200-pipet om de cellen te resuspenderen. Incubeer 45-60 minuten in het donker. Centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten bij 500 x g bij kamertemperatuur (RT) en veeg om supernatant weg te gooien.OPMERKING: Indien nodig kan het protocol op dit punt worden opgeschort. Na het weggooien van supernatant, suspendeert u de cellen opnieuw in een langdurige opslagbuffer voor immuuncellen (zie de materiaaltabel voor productaanbevelingen). Monsters kunnen 12-18 uur bij 4 °C worden bewaard, beschermd tegen licht en bedekt met transparante folie om bufferverdamping te beschermen. Voeg 200 μL 1x permeabilisatiebuffer toe aan elk putje en pipetteer met een P200 om te mengen. Centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten bij 500 x g bij RT en veeg om supernatant weg te gooien. Herhaal de permeabilisatiebuffer in totaal 3x. Voorbereiding van de stroomregelingen: Splits het volume van de cellen van elk monster voor de vereiste stroomregelingen (10.000-30.000 cellen per controleput is voldoende).Om de vlekvrije controle voor te bereiden, fixeert u de niet-vlekkencellen van de soort of aliquot ongekleurde cellen in een apart putje dat geen antilichaam zal ontvangen. Om de fluorescentie minus één (FMO)-controle voor te bereiden, aliquot cellen voor elk van de antilichamen op het paneel, behalve die in dat kanaal. Neem voor de relevante kanalen het isotypecontrole-antilichaam op in de FMO voor gating. Bijvoorbeeld, in een paneel dat P2RY12-APC en H3K27Ac-AlexaFluor568 bevat, moeten er twee FMOS zijn: (1) de APC-FMO die alleen H3K27Ac-AlexaFluor568 en het P2RY12 isotype controle-antilichaam bevat en (2) de 568-FMO die alleen P2RY12-APC en de isotypecontrole primair en 568 secundair bevat.OPMERKING: Dit protocol wordt gepresenteerd om een enkele HPTM te testen, maar er kunnen panels worden opgesteld die veel HPTM’s bevatten die zijn geconjugeerd aan verschillende fluoroforen. Primaire antilichaamkleuring: Voeg 50 μL 1x permeabilisatiebuffer met de juiste concentratie primair antilichaam toe aan elk putje. Incubeer 30 minuten bij RT in het donker. Was 2x met 200 μL 1x permeabilisatiebuffer.OPMERKING: De concentratie van antilichamen die voor elke HPTM worden gebruikt, is opgenomen in de materiaaltabel. De concentratie wordt bepaald door verschillende concentraties van de antilichamen te testen op gekweekte cellen die zijn behandeld met een stimulerend middel dat een dramatische toename zou veroorzaken, bijvoorbeeld een HDAC-remmer voor acetyleringsmarkeringen, en ervoor te zorgen dat zowel onbehandelde als behandelde cellen ruim binnen het detectiebereik lagen (boven de isotypecontrole en onder het maximale detectiebereik van de cytometer). De optimale antilichaamconcentratie voor HPTM’s moet een gemiddelde mediane fluorescentie-intensiteit in het fluorofoorkanaal hebben tussen 5 x 104 en 1 x 105. Secundaire antilichaamkleuring: Blokkeer met 200 μL 1x permeabilisatiebuffer met 2% normaal ezelserum (NDS) gedurende 10 minuten bij RT. Draai gedurende 5 minuten op 500 x g bij RT en veeg om supernatant te verwijderen. Voeg 50 μL 1x permeabilisatiebuffer met 2% NDS en de juiste concentratie secundair antilichaam toe en incubeer gedurende 30 minuten bij RT in het donker. Voeg 200 μL 1x permeabilisatiebuffer toe aan putjes om te verdunnen, centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten bij 500 x g bij RT en veeg om supernatant weg te gooien. Was de cellen 2x met 200 μL 1x permeabilisatiebuffer.OPMERKING: Onderbreek indien nodig het protocol op dit punt. Resuspendeer cellen in 200 μL langdurige opslagbuffer voor immuuncellen met P200-pipet (zie Materiaaltabel voor aanbevelingen) en bewaar bij 4 °C gedurende 12-24 uur beschermd tegen licht. Voorbereiding op flowcytometrie: Centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten bij 500 x g bij RT en veeg om supernatant weg te gooien. Resuspendeer cellen in 200 μL FACS-buffer met behulp van een P200-pipet voor flowcytometrie. Verzegelen met transparante folie voor transport naar de cytometer. FlowcytometrieOm het voorgestelde antilichaampaneel te analyseren, moet u ervoor zorgen dat de cytometer is uitgerust met ten minste vier lasers, waaronder violet (405 nm), blauw (488 nm), geel (561 nm) en rood (633 nm). De cytometer heeft filters nodig om FITC (blauw-525 nm), KRO (violet-525 nm), PE (geel-585 nm) en APC (rood-660 nm) te detecteren. Voeg extra antilichamen toe, afhankelijk van de gekozen cytometer. Kalibratie en standaardisatie: Voer aan het begin van elk experiment regenboogfluorescerende kralen uit en pas de spanning van de fotomultiplicatorbuis (PMT) aan totdat de kraalpieken vergelijkbaar zijn met de streefwaarden die voor eerdere experimenten zijn uitgevoerd. Deze standaardisatiemethode maakt het mogelijk om de drift van apparatuur in de loop van de tijd op te vangen. Compensatie: Nadat de PMT-spanning en versterking voor het experiment zijn ingesteld, gebruikt u antilichaamgevangen compensatieparels om de compensatiematrix voor het panel van antilichamen vast te stellen. Deze berekening zorgt ervoor dat de fluoroforen niet bijdragen aan de signaalveranderingen in andere kanalen. Dit is in toenemende mate nodig bij het multiplexen van meerdere antilichamen. Size gating: In een dot plot, plot SSC-A op log vs FSC-H op lineair. Poort vuil uit en selecteer de celgrootte met behulp van de S1-poort. Selecteer voor singlet-cellen in een puntplot van FSC-W versus FSC-H en poort als S2. (Figuur 4). Fluorofoorpoorten vaststellen: Bepaal met behulp van de relevante FMO voor elk fluorofoorkanaal de poorten om te bepalen wat een positief signaal is in elk kanaal met behulp van histogrammen met één parameter (Figuur 4). Meten van de monsters: Noteer de monsters zorgvuldig met behulp van de vastgestelde poortstrategie. Identificeer de microglia met behulp van het P2RY12+-signaal, bepaal de expressie van het eiwit in de respectieve kanalen alleen voor de microglia. Analyse van flowcytometriegegevensAnalysepoorten tot stand brengen: Gebruik de bovenstaande stappen voor de cytometer op de gebruikersinterface van de analysesoftware en gebruik dezelfde poorten die worden gebruikt voor registratie voor analyse. Verkrijg MFI-waarden met behulp van flowcytometrie-analysesoftware (zie Materiaaltabel voor aanbevelingen): Vat de cytometerpoortstrategie voor flowanalyse samen. Selecteer met behulp van de functie statistieken toevoegen de mediaan voor de populatie van belang (bijv. 568+) op de gecompenseerde kanaalhoogte. Exporteer met behulp van de tabeleditor de mediane fluorescentie-intensiteit (MFI)-waarden voor de respectieve kanalen naar een spreadsheet om door te gaan met statistische analyse (Tabel 2).OPMERKING: Aanvullend bestand S1 bevat voorbeeldgegevens van met lipopolysaccharide (LPS) en fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) geïnjecteerde muizen en een voorbeeldanalysebestand met de poortstrategie en MFI-waarden. Analyse van MFI-waarden naar eiwitvouwverandering: Bereken na het verkrijgen van de MFI-waarden de vouwverandering van de MFI ten opzichte van de controle- of onbehandelde populatie (vergelijking 1). De MFI-vouwverandering weerspiegelt de vouwverandering in eiwitniveaus. Beoordeel met behulp van de vouwveranderingswaarden de verandering in expressie en bereken de statistische significantie met behulp van een t-toets of ANOVA.Vergelijking 1 Figuur 4: Poortstrategie voor de beoordeling van de MFI-waarde van eiwitten. Gebeurtenissen worden eerst afgeschermd voor celgrootte op SSC-A versus FSC-H (S1). De cellen worden vervolgens afgesloten voor singlets op FSC-H versus FSC-W (S2). Singletcellen worden vervolgens geïdentificeerd als microglia door middel van een P2RY12-APC-signaal (APC+), waarbij de poort wordt vastgesteld op basis van fluorescentie in een APC-FMO-controle die een isotypecontrole-antilichaam bevat. Cellen worden vervolgens afgeschermd voor het H3K27Ac-AlexaFluor568-signaal op Comp-FL5-A::Y610-mCherry. De fluorescerende intensiteit van de 610+ cellen wordt bepaald als een proxy voor eiwitexpressie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.