細胞培養のためのマウス胎児骨格筋からの3D脱細胞化マトリックスの調製

細胞外マトリックス(ECM)は、組織の主要な構成要素であり、それらの非細胞成分を表す。この3次元(3D)構造は、細胞を物理的にサポートするだけでなく、生物の発生に関与する生化学的プロセスにおいても重要な役割を果たします¹。組織特異的ECMの形成は、細胞とそれらのニッチとの間の複雑な相互作用の結果として、様々な細胞内および細胞外の刺激の影響を受ける発生中に起こる。ECMは、時間空間的に化学的および機械的再配列を起こし、細胞の運命に直接影響を与える非常に動的な構造です²。ECMの最も顕著な特徴の1つは、各組織ECMが、それに含まれる細胞に合わせた異なるトポロジーおよび特性を提供する分子の固有の組み合わせを示すため、その機能の多様性である¹。

ECMシグナル伝達とサポートは、発生と恒常性に不可欠であり、破壊されると複数の病理学的状態につながる可能性があります^3,4。一例は、先天性筋ジストロフィーの最も一般的な形態であるLAMA2欠損先天性ジストロフィー(LAMA2-CMD)です。LAMA2遺伝子は、ラミニン211およびラミニン221に存在するラミニンα2鎖をコードし、変異するとLAMA2-CMD5につながる可能性があります。ラミニン211は、骨格筋線維を取り囲む基底膜に見られる主要なアイソフォームです。ラミニン211が異常または不在の場合、基底膜と筋細胞との間のリンクが破壊され、疾患の発症につながる⁶。LAMA2-CMDの患者は、LAMA2遺伝子の突然変異の種類に応じて軽度から重度の表現型を示します。

ラミニンα2タンパク質の機能に影響を与えると、患者は出生時に重度の筋緊張低下を経験し、慢性炎症、線維症、筋萎縮を発症し、平均余命を縮める可能性があります。今日まで、標的療法は開発されておらず、治療アプローチは病気の症状を緩和することに限定されています⁷。したがって、この病気の発症に関与する根本的な分子メカニズムを理解することは、適切な治療戦略を開発するために重要です^6,8。LAMA2-CMDのモデルであるdy^Wマウス⁹を用いた以前の研究では、この病気の発症は子宮内、特に胎児の筋形成¹⁰の間に始まることが示唆されています。胎児の筋形成障害がどのように現れるかをよりよく理解することは、LAMA2-CMDの新しい治療アプローチを生み出す上でのゲームチェンジャーとなるでしょう。

in vitro システムは、細胞-細胞および細胞-ECM相互作用を研究するための制御された環境を提供しますが、2D培養モデルにはネイティブ組織の複雑さが欠けています。組織の脱細胞化により、2Dモデルや人工/合成足場と比較して、自然の細胞微小環境をより正確に模倣する組織および発生段階特異的な無細胞ECM足場が生成されます。脱細胞化マトリックス(dECM)は、宿主組織の分子的および機械的手がかりを保存する可能性があり、 in vivo プロセスを理解するためのより良い代替モデルになります¹¹。

脱細胞化に使用できる様々な技術、試薬、および条件がある^12、13。この研究では、Silvaら^14,15によって記述された胎児マウス心臓の脱細胞化プロトコルがマウス胎児骨格筋に適合し、テストされたすべてのECM成分(ラミニンα2、総ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンI、およびコラーゲンIV)を保持することが判明しました。このプロトコルには、浸透圧ショックによる細胞溶解(低張緩衝液)、原形質膜溶解およびタンパク質解離(0.05%ドデシル硫酸ナトリウム[SDS])、およびDNAの酵素的破壊(DNase処理)の3つのステップが含まれます。我々の知る限り、これはマウス胎児骨格筋を脱細胞化するための最初の確立されたプロトコルである。

この3DインビトロシステムをLAMA2-CMDの研究に使用するには、脱細胞化後のラミニンα2鎖を維持することが重要です。したがって、異なる洗剤(SDSおよびTriton X-100)および濃度(0.02%、0.05%、0.1%、0.2%、および0.5%)がテストされた最適化プロトコルが実装された(データは示されていない)。ラミニンα2タンパク質の細胞除去および保存のための最適な選択は、0.05%SDSであることがわかった。十分に確立された筋芽細胞株であるC2C12細胞^16,17を使用して、dECMを播種しました。これらの細胞はdECMに侵入し、増殖し、これらの足場内で分化し、新しいECMタンパク質を合成します。この3Din vitroモデルの作成の成功は、胎児の筋形成、LAMA2-CMDの発症に関与する分子および細胞プロセスを理解するための新しいアプローチを提供し、ECMと骨格筋細胞間のコミュニケーションが破壊される他の筋肉疾患に拡張することができます。