Herstellung von 3D-dezellularisierten Matrizen aus fetalen Mausskelettmuskeln für die Zellkultur

Die extrazelluläre Matrix (EZM) ist ein Hauptbestandteil von Geweben und stellt deren nicht-zelluläre Komponente dar. Diese dreidimensionale (3D) Struktur bietet nicht nur physikalischen Halt für Zellen, sondern spielt auch eine entscheidende Rolle bei den biochemischen Prozessen, die an der Entwicklung von Organismen beteiligt sind¹. Die Bildung einer gewebespezifischen EZM erfolgt während der Entwicklung durch die komplexen Wechselwirkungen zwischen Zellen und ihren Nischen, die durch verschiedene intra- und extrazelluläre Reize beeinflusst werden. Die EZM ist eine hochdynamische Struktur, die chemisch und mechanisch zeitlich-räumlich umgelagert wird und sich direkt auf das Zellschicksal^{auswirkt 2}. Eines der bemerkenswertesten Merkmale der EZM ist ihre funktionelle Vielfalt, da jede Gewebe-EZM eine einzigartige Kombination von Molekülen aufweist, die unterschiedliche Topologien und Eigenschaften bieten, die auf die darin enthaltenen Zellen zugeschnitten sind¹.

Die Signalübertragung und Unterstützung der EZM ist entscheidend für die Entwicklung und Homöostase und kann, wenn sie gestört ist, zu multiplen pathologischen Zuständen führen ^3,4. Ein Beispiel ist die LAMA2-defiziente kongenitale Dystrophie (LAMA2-CMD), die häufigste Form der angeborenen Muskeldystrophie. Das LAMA2-Gen kodiert für die Laminin-α2-Kette, die in Laminin 211 und Laminin 221 vorkommt und bei Mutation zu LAMA2-CMD ⁵ führen kann. Laminin 211 ist die Hauptisoform, die in der Basalmembran vorkommt, die die Skelettmuskelfasern umgibt. Wenn Laminin 211 abnormal ist oder fehlt, ist die Verbindung zwischen der Basalmembran und den Muskelzellen gestört, was zum Ausbruch der Krankheit führt⁶. Patienten mit LAMA2-CMD zeigen einen leichten bis schweren Phänotyp, abhängig von der Art der Mutation im LAMA2-Gen.

Wenn die Funktion des Laminin-α2-Proteins beeinträchtigt ist, kann es bei der Geburt zu einer schweren Muskelhypotonie kommen und chronische Entzündungen, Fibrose und Muskelatrophie entwickeln, was zu einer verkürzten Lebenserwartung führt. Bisher wurden keine zielgerichteten Therapien entwickelt und die therapeutischen Ansätze beschränken sich auf die Linderung der Krankheitssymptome⁷. Daher ist das Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen, die an der Entstehung dieser Krankheit beteiligt sind, von entscheidender Bedeutung, um geeignete therapeutische Strategien zu entwickeln ^6,8. Frühere Arbeiten mit der dy-W-Maus⁹, einem Modell für LAMA2-CMD, deuten darauf hin, dass der Ausbruch der Krankheit in utero beginnt, insbesondere während der fetalen Myogenese¹⁰. Ein besseres Verständnis der Entstehung des fetalen Myogenesedefekts wäre ein entscheidender Faktor bei der Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze für LAMA2-CMD.

In-vitro-Systeme bieten eine kontrollierte Umgebung für die Untersuchung von Zell-Zell- und Zell-EZM-Interaktionen, aber 2D-Kulturmodellen fehlt die Komplexität nativer Gewebe. Die Dezellularisierung von Geweben erzeugt gewebe- und entwicklungsstadienspezifische azelluläre ECM-Gerüste, die im Vergleich zu 2D-Modellen und technischen/synthetischen Gerüsten die natürliche Mikroumgebung der Zellen genauer nachahmen. Dezellularisierte Matrices (dEZMs) haben das Potenzial, die molekularen und mechanischen Signale des Wirtsgewebes zu erhalten, was sie zu besseren alternativen Modellen für das Verständnis von In-vivo-Prozessen macht¹¹.

Es gibt verschiedene Techniken, Reagenzien und Bedingungen, die für die Dezellularisierung verwendet werden können^12,13. In dieser Studie wurde ein Dezellularisierungsprotokoll für das fetale Mausherz, das von Silva et al.14,15 beschrieben wurde, an die fetale Mausskelettmuskulatur angepasst und es wurde festgestellt, dass alle getesteten EZM-Komponenten (Laminin α2, Gesamtlaminine, Fibronektin^, Kollagen I und Kollagen IV) erhalten bleiben. Das Protokoll umfasst drei Schritte: Zelllyse durch osmotischen Schock (hypotoner Puffer), Auflösung der Plasmamembran und Proteindissoziation (0,05 % Natriumdodecylsulfat [SDS]) und enzymatische Zerstörung der DNA (DNase-Behandlung). Unseres Wissens ist dies das erste etablierte Protokoll zur Dezellularisierung des fetalen Skelettmuskels der Maus.

Um dieses 3D-In-vitro-System für die Untersuchung von LAMA2-CMD zu verwenden, ist es entscheidend, die Laminin-α2-Kette nach der Dezellularisierung beizubehalten. Daher wurde ein Optimierungsprotokoll implementiert, bei dem verschiedene Detergenzien (SDS und Triton X-100) und Konzentrationen (0,02 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,2 % und 0,5 %) getestet wurden (Daten nicht gezeigt). Die optimale Wahl für die Zellentfernung und Konservierung des Laminin-α2-Proteins war 0,05 % SDS. C2C12-Zellen, eine gut etablierte Myoblasten-Zelllinie^16,17, wurden verwendet, um die dEZMs zu besiedeln. Diese Zellen dringen in das dEZM ein, vermehren sich und differenzieren sich innerhalb dieser Gerüste, wobei sie neue EZM-Proteine synthetisieren. Die erfolgreiche Herstellung dieses 3D-In-vitro-Modells bietet einen neuen Ansatz zum Verständnis der molekularen und zellulären Prozesse, die an der fetalen Myogenese und dem Auftreten von LAMA2-CMD beteiligt sind, und kann auf andere Muskelerkrankungen ausgeweitet werden, bei denen die Kommunikation zwischen der EZM und den Skelettmuskelzellen gestört ist.