Medición en tiempo real del perfil bioenergético mitocondrial de neutrófilos

Las mitocondrias juegan un papel importante en la bioenergética celular, que genera trifosfato de adenosina (ATP) por fosforilación oxidativa (OXPHOS). Además de esto, el papel de las mitocondrias se extiende a la generación y desintoxicación de especies reactivas de oxígeno, la regulación del calcio de la matriz citoplasmática y mitocondrial, la síntesis celular, el catabolismo y el transporte de metabolitos dentro de la célula¹. La respiración mitocondrial es esencial en todas las células, ya que su disfunción puede dar lugar a problemas metabólicos 2, incluyendo enfermedades cardiovasculares³ y una amplia variedad de enfermedades neurodegenerativas, como la degeneración macular relacionada con la edad⁴, las enfermedades de Parkinson y Alzheimer⁵, y la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth² A (CMT2A)⁶.

Los estudios microscópicos electrónicos sobre neutrófilos revelaron que hay relativamente pocas mitocondrias⁷, y dependen en gran medida de la glucólisis para su producción de energía, ya que las tasas de respiración mitocondrial son muy bajas⁸. Sin embargo, las mitocondrias son cruciales para las funciones de los neutrófilos, como la quimiotaxis⁹ y la apoptosis^10,11,12. Un estudio previo reveló una compleja red mitocondrial en neutrófilos humanos con alto potencial de membrana. La pérdida de potencial de la membrana mitocondrial es un indicador temprano de apoptosis de neutrófilos¹⁰. El tratamiento con cianuro de carbonilo mitocondrial con cianuro de carbonilo m-clorofenil hidrazona (CCCP) mostró inhibición significativa en la quimiotaxis, junto con un cambio en la morfología mitocondrial ^9,10.

Aunque la principal fuente de energía para los neutrófilos es la glucólisis, las mitocondrias proporcionan el ATP que inicia la activación de los neutrófilos al alimentar la primera fase de la señalización purinérgica, lo que aumenta la señalización de Ca²⁺, amplifica la producción de ATP mitocondrial e inicia las respuestas funcionales de los neutrófilos¹³. La disfunción de la cadena respiratoria mitocondrial resulta en una producción excesiva de especies tóxicas reactivas de oxígeno (ROS) y conduce a daños patógenos^14,15,16. La NETosis, que es el proceso de formación de trampas extracelulares de neutrófilos (TNE), es una propiedad crítica de los neutrófilos que les ayuda a luchar contra los patógenos¹⁷ y contribuye a muchas condiciones patológicas, incluyendo cáncer, trombosis y trastornos autoinmunes¹⁸. Las ROS derivadas de mitocondrial contribuyen a NETosis¹⁹, el ADN mitocondrial puede ser un componente de NETs¹⁸, y la homeostasis mitocondrial alterada afecta NETosis 20,21,22,23,24. Además, durante la diferenciación o maduración normal, la reprogramación metabólica de los neutrófilos se invierte al limitar la actividad glucolítica, y participan en la respiración mitocondrial y movilizan los lípidos intracelulares^25,26.

El analizador de flujo extracelular metabólico puede monitorear y cuantificar continuamente la respiración mitocondrial de células vivas y la glucólisis. El analizador utiliza un cartucho sensor de formato placa de 96 pocillos y dos fluoróforos para cuantificar la concentración de oxígeno (_O2) y los cambios de pH. El cartucho sensor está por encima de la monocapa celular durante el ensayo y forma una microcámara de ~200 nm de altura. Los haces de fibra óptica en el analizador se utilizan para excitar los fluoróforos y detectar los cambios de intensidad fluorescente. Los cambios en tiempo real en la concentración de_O2 y el pH se calculan automáticamente y se muestran como tasa de consumo de oxígeno (OCR) y tasa de acidificación extracelular (ECAR). Hay cuatro puertos en el cartucho del sensor que permiten cargar hasta cuatro compuestos en cada pocillo durante las mediciones del ensayo. Este protocolo se centra en cuantificar la respiración mitocondrial de neutrófilos humanos y de ratón, así como las células HL60 similares a los neutrófilos, utilizando el analizador de flujo extracelular metabólico.