Mensuração em Tempo Real do Perfil Bioenergético Mitocondrial de Neutrófilos

As mitocôndrias desempenham um papel importante na bioenergética celular, que gera trifosfato de adenosina (ATP) por fosforilação oxidativa (OXPHOS). Além disso, o papel das mitocôndrias se estende à geração e desintoxicação de espécies reativas de oxigênio, regulação do cálcio da matriz citoplasmática e mitocondrial, síntese celular, catabolismo e transporte de metabólitos dentro da célula¹. A respiração mitocondrial é essencial em todas as células, pois sua disfunção pode resultar em problemas metabólicos 2, incluindo doenças cardiovasculares³ e uma grande variedade de doenças neurodegenerativas, como degeneração macular relacionada à idade⁴, Parkinson e Alzheimer⁵ e doença de Charcot-Marie-Tooth² A (CMT2A)⁶.

Estudos de microscopia eletrônica em neutrófilos revelaram que há relativamente poucas mitocôndrias⁷, e elas dependem fortemente da glicólise para sua produção de energia, uma vez que as taxas de respiração mitocondrial são muito baixas⁸. Entretanto, as mitocôndrias são cruciais para as funções dos neutrófilos, como quimiotaxia⁹ e apoptose^10,11,12. Um estudo anterior revelou uma complexa rede mitocondrial em neutrófilos humanos com alto potencial de membrana. A perda do potencial de membrana mitocondrial é um indicador precoce de apoptose neutrofílica¹⁰. O tratamento com o desacoplador mitocondrial carbonil cianeto m-clorofenil hidrazona (CCCP) mostrou inibição significativa da quimiotaxia, juntamente com alteração na morfologia mitocondrial ^9,10.

Embora a principal fonte de energia para os neutrófilos seja a glicólise, as mitocôndrias fornecem o ATP que inicia a ativação dos neutrófilos alimentando a primeira fase da sinalização purinérgica, que aumenta a sinalização de Ca²⁺, amplifica a produção de ATP mitocondrial e inicia as respostas funcionais dos neutrófilos¹³. A disfunção da cadeia respiratória mitocondrial resulta na produção excessiva de espécies reativas tóxicas de oxigênio (EROs) e leva a danos patogênicos^14,15,16. NETosis, que é o processo de formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs), é uma propriedade crítica dos neutrófilos que os ajuda a lutar contra patógenos¹⁷ e contribui para muitas condições patológicas, incluindo câncer, trombose e doenças autoimunes¹⁸. As ERO derivadas da mitocôndria contribuem para a NETosis¹⁹, o DNA mitocondrial pode ser um componente das NETs¹⁸ e a homeostase mitocondrial alterada prejudica a NETosis 20,21,22,23,24. Além disso, durante a diferenciação ou maturação normal, a reprogramação metabólica dos neutrófilos é revertida pela limitação da atividade glicolítica, que se engaja na respiração mitocondrial e mobiliza lipídios intracelulares^25,26.

O analisador de fluxo extracelular metabólico pode monitorar e quantificar continuamente a respiração mitocondrial de células vivas e a glicólise. O analisador utiliza um cartucho sensor em formato de placa de 96 poços e dois fluoróforos para quantificar a concentração de oxigênio (O₂) e as mudanças de pH. O cartucho do sensor está acima da monocamada da célula durante o ensaio e forma uma microcâmara de ~200 nm de altura. Os feixes de fibras ópticas no analisador são usados para excitar os fluoróforos e detectar as mudanças de intensidade fluorescente. Mudanças em tempo real na concentração de O₂ e pH são automaticamente calculadas e mostradas como taxa de consumo de oxigênio (OCR) e taxa de acidificação extracelular (ECAR). Há quatro portas no cartucho do sensor que permitem carregar até quatro compostos em cada poço durante as medições de ensaio. Este protocolo concentra-se em quantificar a respiração mitocondrial de neutrófilos humanos e camundongos, bem como as células HL60 semelhantes a neutrófilos, usando o analisador de fluxo extracelular metabólico.