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免疫与感染

호중구의 미토콘드리아 생물에너지 프로파일의 실시간 측정

Published: June 02, 2023
doi:
10.3791/64971
, ,
1Department of Immunology, School of Medicine,UConn Health, 2Arthritis and Clinical Immunology Program,Oklahoma Medical Research Foundation, 3Department of Microbiology and Immunology,University of Oklahoma Health Science Center

Summary

대사 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스와 인간 호중구 및 HL60 세포의 미토콘드리아 호흡을 측정하는 단계적 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

호중구는 인간의 첫 번째 방어선이자 가장 풍부한 백혈구입니다. 이러한 이펙터 세포는 식균 작용 및 산화 버스트와 같은 기능을 수행하고 미생물 제거를 위한 호중구 세포외 트랩(NET)을 생성합니다. 호중구의 대사 활동에 대한 새로운 통찰력은 호중구가 주로 해당과정에 의존한다는 초기 개념에 도전합니다. 대사 활동의 정확한 측정은 트리카르복실산(TCA) 회로(크렙스 회로라고도 함), 산화적 인산화(OXPHOS), 오탄당 인산염 경로(PPP) 및 지방산 산화(FAO)를 포함하여 호중구의 다양한 대사 요구 사항을 밝힐 수 있습니다. 이 논문은 대사 세포외 플럭스 분석기에서 대사 플럭스 분석을 사용하여 마우스 골수 유래 호중구, 인간 혈액 유래 호중구 및 호중구 유사 HL60 세포주에서 미토콘드리아 호흡의 지표로 산소 소비율(OCR)을 측정하기 위한 단계별 프로토콜 및 사전 요구 사항을 설명합니다. 이 방법은 정상 및 질병 조건 하에서 호중구의 미토콘드리아 기능을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.

Introduction

미토콘드리아는 산화적 인산화(OXPHOS)에 의해 아데노신 삼인산(ATP)을 생성하는 세포 생물 에너지학에서 중요한 역할을 합니다. 이 외에도 미토콘드리아의 역할은 활성 산소 종의 생성 및 해독, 세포질 및 미토콘드리아 기질 칼슘 조절, 세포 합성, 이화 작용 및 세포 내 대사 산물의 수송으로 확장됩니다1. 미토콘드리아 호흡은 모든 세포에 필수적인데, 그 기능 장애는 심혈관 질환3과 연령 관련 황반변성4, 파킨슨병 및 알츠하이머병5, 샤르코-마리-투스병2 A(CMT2A)6와 같은 다양한 신경퇴행성 질환을 포함한 대사 문제2를 유발할 수 있기 때문이다.

호중구에 대한 전자 현미경 연구에 따르면 미토콘드리아는 상대적으로 적으며7 미토콘드리아는 미토콘드리아 호흡률이 매우 낮기 때문에 에너지 생산을 위해 해당과정에 크게 의존하고 있다8. 그러나 미토콘드리아는 화학주성9 및 세포자멸사10,11,12와 같은 호중구 기능에 중요합니다. 이전 연구에서는 높은 막 전위를 가진 인간 호중구에서 복잡한 미토콘드리아 네트워크를 밝혀냈습니다. 미토콘드리아 막의 전위 손실은 호중구 세포자멸사의 초기 지표이다10. 미토콘드리아 언커플러 카르보닐 시안화물 m-클로로페닐 히드라존(CCCP)을 사용한 치료는 미토콘드리아 형태의 변화와 함께 화학주성에서 상당한 억제를 보여주었습니다 9,10.

호중구의 주요 에너지원은 해당과정이지만, 미토콘드리아는 퓨린성 신호전달의 첫 번째 단계에 연료를 공급하여 호중구 활성화를 시작하는 ATP를 제공하며, 이는 Ca2+ 신호전달을 증가시키고, 미토콘드리아 ATP 생산을 증폭시키며, 호중구 기능적 반응을 개시한다13. 미토콘드리아 호흡 사슬의 기능 장애는 독성 활성 산소 종 (ROS)의 과도한 생산을 초래하고 병원성 손상을 초래합니다14,15,16. 호중구 세포외 트랩(NET)을 형성하는 과정인 NETosis는 호중구가 병원체에 대항하는 데 도움이 되는 중요한 특성이며17 암, 혈전증, 자가면역 질환18을 포함한 많은 병리학적 상태에 기여한다. 미토콘드리아 유래 ROS는 NETosis19에 기여하고, 미토콘드리아 DNA는 NETs18의 구성 요소가 될 수 있으며, 변경된 미토콘드리아 항상성은 NETosis 20,21,22,23,24를 손상시킵니다. 또한, 정상적인 분화 또는 성숙 동안, 호중구 대사 재 프로그래밍은 해당 작용 활성을 제한함으로써 역전되고, 미토콘드리아 호흡에 관여하고 세포 내 지질을 동원한다25,26.

대사 세포외 플럭스 분석기는 살아있는 세포 미토콘드리아 호흡 및 해당 과정을 지속적으로 모니터링하고 정량화할 수 있습니다. 분석기는 96웰 플레이트 형식 센서 카트리지와 2개의 형광단을 사용하여 산소(O2) 농도 및 pH 변화를 정량화합니다. 센서 카트리지는 분석 중에 세포 단층 위에 있으며 ~200nm 높이의 마이크로 챔버를 형성합니다. 분석기의 광섬유 다발은 형광단을 여기시키고 형광 강도 변화를 감지하는 데 사용됩니다. O2 농도 및 pH의 실시간 변화는 자동으로 계산되어 산소 소비율(OCR) 및 세포외 산성화율(ECAR)로 표시됩니다. 센서 카트리지에는 분석 측정 중에 각 웰에 최대 4개의 화합물을 로드할 수 있는 4개의 포트가 있습니다. 이 프로토콜은 대사 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스 및 인간 호중구와 호중구 유사 HL60 세포의 미토콘드리아 호흡을 정량화하는 데 중점을 둡니다.

Protocol

헤파린화된 전혈 샘플은 헬싱키 선언에 따라 UConn Health의 기관 검토 위원회(Institutional Review Board of UConn Health)의 승인을 받은 정보에 입각한 동의를 얻은 후 건강한 인간 기증자로부터 얻었습니다. 모든 동물 실험은 UConn Health Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC) 가이드라인을 따랐으며, 설치류 사용에 대한 승인은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals에 ?…

Representative Results

마우스 호중구(도 3A), 인간 호중구(도 3B) 및 미분화 및 분화된 HL60 세포(도 3C)의 혼합물의 올리고마이신, FCCP 및 로테논/안티마이신 A에 대한 반응으로 미토콘드리아 호흡 변화를 나타내는 대표적인 OCR 동역학이 도시된다. 모든 세포에서, 올리고마이신 처리는 ATP 합성효소의 양성자 채널을 억제함으로써 OCR 값을 감소시키고; FCCP 치…

Discussion

대사 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 호중구의 미토콘드리아 호흡을 측정하는 표준 절차는 세포 수, 세포 성장 및 생존력을 포함한 많은 요인에 의해 제한됩니다. 각 화합물 농도는 이 분석에서 세포의 유형과 공급원에 따라 다릅니다. 올리고마이신과 로테논/안티마이신 A는 대부분의 세포 유형에서 비슷한 농도로 주로 사용됩니다. 그러나, FCCP에 의해 유도된 최대 호흡수는 상이한 세포들 사?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

대사 세포외 플럭스 분석기 사용에 대한 교육을 제공한 UConn Health 면역학과의 Anthony T. Vella 박사와 Federica Aglianoin 박사, 기기를 지원해 주신 UConn Health 면역학과의 Lynn Puddington 박사에게 감사드립니다. 이 원고의 과학적 저술 및 편집에 도움을 준 UConn School of Medicine의 Geneva Hargis 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health), 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소 (National Heart, Lung, and Blood Institute, R01HL145454), 국립 일반 의학 연구소 (National Institute of General Medical Sciences, R35GM147713 and P20GM139763), UConn Health의 창업 기금 및 미국 면역 학자 협회 (American Association of Immunologists)의 경력 재진입 펠로우쉽.

Materials

37 °C non-CO2 incubator Precision Economy Model 2EG Instrument
Biorender Software Application
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
Corning Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive Corning 102416-100 Reagent
EasySep Magnet STEMCELL 18000 Magnet
EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit STEMCELL 19762A Reagents
Graphpad Prism 9 Software Application
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Ketamine (VetaKet) DAILYMED NDC 59399-114-10 Anesthetic
PBS Cytiva SH30256.01 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) polysaccharide solution
Purified mouse anti-human CD18 antibody Biolegend 302102 Clone TS1/18
RPMI 1640 Medium Gibco 11-875-093 Reagents
Seahorse metabolic extracellular flux analyzer Agilent XFe96 Instrument
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit Agilent 103015-100 mitochondrial stress test Kit
Swing-bucket rotor Eppendorf A-4-62 Rotor
Vactrap 2 Vacum Trap Fox Lifesciences 3052101-FLS Instrument
Wave Software Application
XF 1.0 M Glucose Solution Agilent 103577-100 Reagent
XF 100 mM Pyruvate Solution Agilent 103578-100 Reagent
XF 200 mM Glutamine Solution Agilent 103579-100 Reagent
XF DMEM medium Agilent 103575-100 Reagent
XFe96 FluxPak Agilent 102601-100 Material
Xylazine (AnaSed Injection) DAILYMED NDC 59399-110-20 Anesthetic
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Pulikkot, S., Zhao, M., Fan, Z. Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils. J. Vis. Exp. (196), e64971, doi:10.3791/64971 (2023).
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