JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
免疫与感染

Real-time meting van het mitochondriale bio-energetische profiel van neutrofielen

Published: June 02, 2023
doi:
10.3791/64971
, ,
1Department of Immunology, School of Medicine,UConn Health, 2Arthritis and Clinical Immunology Program,Oklahoma Medical Research Foundation, 3Department of Microbiology and Immunology,University of Oklahoma Health Science Center

Summary

We beschrijven stapsgewijze protocollen die de mitochondriale ademhaling van muis en menselijke neutrofielen en HL60-cellen meten met behulp van de metabole extracellulaire fluxanalysator.

Abstract

Neutrofielen zijn de eerste verdedigingslinie en de meest voorkomende leukocyten bij de mens. Deze effectorcellen voeren functies uit zoals fagocytose en oxidatieve burst en creëren neutrofiele extracellulaire vallen (NET’s) voor microbiële klaring. Nieuwe inzichten in de metabole activiteiten van neutrofielen dagen het vroege concept uit dat ze voornamelijk afhankelijk zijn van glycolyse. Nauwkeurige meting van metabole activiteiten kan verschillende metabole behoeften van neutrofielen ontvouwen, waaronder de tricarbonzuur (TCA) cyclus (ook bekend als de Krebs-cyclus), oxidatieve fosforylering (OXPHOS), pentosefosfaatroute (PPP) en vetzuuroxidatie (FAO) onder fysiologische omstandigheden en in ziektetoestanden. Dit artikel beschrijft een stapsgewijs protocol en vereisten om de zuurstofverbruikssnelheid (OCR) te meten als een indicator van mitochondriale ademhaling op van het beenmerg afgeleide neutrofielen van muizen, van menselijk bloed afgeleide neutrofielen en de neutrofielachtige HL60-cellijn, met behulp van metabole fluxanalyse op een metabole extracellulaire fluxanalysator. Deze methode kan worden gebruikt voor het kwantificeren van de mitochondriale functies van neutrofielen onder normale en ziekteomstandigheden.

Introduction

Mitochondriën spelen een belangrijke rol in celbio-energetica, die adenosinetrifosfaat (ATP) genereert door oxidatieve fosforylering (OXPHOS). Daarnaast strekt de rol van mitochondriën zich uit tot de generatie en ontgifting van reactieve zuurstofsoorten, cytoplasmatische en mitochondriale matrixcalciumregulatie, cellulaire synthese, katabolisme en het transport van metabolieten in de cel1. Mitochondriale ademhaling is essentieel in alle cellen, omdat hun disfunctie kan leiden tot metabole problemen 2, waaronder hart- en vaatziekten3 en een breed scala aan neurodegeneratieve ziekten, zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie4, de ziekte van Parkinson en Alzheimer5 en de ziekte van Charcot-Marie-Tooth2 A (CMT2A)6.

Elektronenmicroscopische studies op neutrofielen onthulden dat er relatief weinig mitochondriën7 zijn en dat ze sterk afhankelijk zijn van glycolyse voor hun energieproductie, omdat mitochondriale ademhalingssnelheden erg laag zijn8. Mitochondriën zijn echter cruciaal voor neutrofiele functies, zoals chemotaxis9 en apoptose10,11,12. Een eerdere studie onthulde een complex mitochondriaal netwerk in menselijke neutrofielen met een hoog membraanpotentiaal. Het mitochondriale membraanpotentiaalverlies is een vroege indicator van neutrofiele apoptose10. Behandeling met mitochondriale uncoupler carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP) toonde significante remming in chemotaxis, samen met een verandering in mitochondriale morfologie 9,10.

Hoewel de primaire energiebron voor neutrofielen glycolyse is, leveren mitochondriën de ATP die neutrofiele activering initieert door de eerste fase van purinerge signalering te voeden, die Ca2 + -signalering verhoogt, mitochondriale ATP-productie versterkt en neutrofiele functionele responsen initieert13. Disfunctie van de mitochondriale ademhalingsketen resulteert in overmatige productie van toxische reactieve zuurstofsoorten (ROS) en leidt tot pathogene schade14,15,16. NETosis, het proces van het vormen van neutrofiele extracellulaire vallen (NET’s), is een kritieke eigenschap van neutrofielen die hen helpt te vechten tegen pathogenen17 en bijdraagt aan vele pathologische aandoeningen, waaronder kanker, trombose en auto-immuunziekten18. Mitochondriaal afgeleide ROS dragen bij aan NETosis19, mitochondriaal DNA kan een onderdeel zijn van NETs18, en veranderde mitochondriale homeostase schaadt NETosis 20,21,22,23,24. Bovendien wordt tijdens normale differentiatie of rijping de metabole herprogrammering van neutrofielen omgekeerd door de glycolytische activiteit te beperken, en ze houden zich bezig met mitochondriale ademhaling en mobiliseren intracellulaire lipiden25,26.

De metabole extracellulaire fluxanalysator kan continu de mitochondriale ademhaling en glycolyse van levende cellen controleren en kwantificeren. De analyzer maakt gebruik van een 96-well plaatformaat sensorpatroon en twee fluoroforen om zuurstof (O2) concentratie en pH-veranderingen te kwantificeren. De sensorcartridge bevindt zich tijdens de test boven de celmonolaag en vormt een ~200 nm hoge microkamer. De optische vezelbundels in de analyzer worden gebruikt om de fluoroforen te prikkelen en de fluorescerende intensiteitsveranderingen te detecteren. Real-time veranderingen in O2-concentratie en pH worden automatisch berekend en weergegeven als zuurstofverbruikssnelheid (OCR) en extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR). Er zijn vier poorten op de sensorcartridge waarmee tijdens de testmetingen maximaal vier verbindingen in elke put kunnen worden geladen. Dit protocol richt zich op het kwantificeren van de mitochondriale ademhaling van muis- en menselijke neutrofielen, evenals de neutrofielachtige HL60-cellen, met behulp van de metabole extracellulaire fluxanalysator.

Protocol

Gehepariniseerde volbloedmonsters werden verkregen van gezonde menselijke donoren na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming, zoals goedgekeurd door de Institutional Review Board van UConn Health in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. Alle dierproeven volgden de richtlijnen van de UConn Health Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en goedkeuring voor het gebruik van knaagdieren werd verkregen van de UConn Health IACUC volgens de criteria die zijn uiteengezet in de Guide for the Care and Us…

Representative Results

Representatieve OCR-dynamiek wordt getoond met de mitochondriale ademhalingsveranderingen in reactie op oligomycine, FCCP en rotenon / antimycine Een mengsel van muisneutrofielen (figuur 3A), menselijke neutrofielen (figuur 3B) en ongedifferentieerde en gedifferentieerde HL60-cellen (figuur 3C). In alle cellen verlaagt oligomycinebehandeling de OCR-waarde door het protonkanaal van ATP-synthase te remmen; FCCP-behandeling herstelt de…

Discussion

De standaardprocedure die de mitochondriale ademhaling van neutrofielen meet met behulp van de metabole extracellulaire fluxanalysator wordt beperkt door vele factoren, waaronder celaantal, celgroei en levensvatbaarheid. Elke concentratie van de verbinding varieert tussen het type en de bron van de cellen in deze test. Oligomycine en rotenon/antimycine A worden meestal gebruikt in een vergelijkbare concentratie bij de meeste celtypen. Omdat de door FCCP geïnduceerde maximale ademhalingsfrequentie echter varieert tussen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We erkennen Dr. Anthony T. Vella en Dr. Federica Aglianoin van de afdeling Immunologie van UConn Health voor hun training in het gebruik van de metabole extracellulaire fluxanalysator, en Dr. Lynn Puddington van de afdeling Immunologie van UConn Health voor haar ondersteuning van de instrumenten. We erkennen Dr. Geneva Hargis van UConn School of Medicine voor haar hulp bij het wetenschappelijk schrijven en redigeren van dit manuscript. Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (R35GM147713 and P20GM139763), een startup-fonds van UConn Health en een Career re-entry fellowship van de American Association of Immunologists.

Materials

37 °C non-CO2 incubator Precision Economy Model 2EG Instrument
Biorender Software Application
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
Corning Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive Corning 102416-100 Reagent
EasySep Magnet STEMCELL 18000 Magnet
EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit STEMCELL 19762A Reagents
Graphpad Prism 9 Software Application
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Ketamine (VetaKet) DAILYMED NDC 59399-114-10 Anesthetic
PBS Cytiva SH30256.01 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) polysaccharide solution
Purified mouse anti-human CD18 antibody Biolegend 302102 Clone TS1/18
RPMI 1640 Medium Gibco 11-875-093 Reagents
Seahorse metabolic extracellular flux analyzer Agilent XFe96 Instrument
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit Agilent 103015-100 mitochondrial stress test Kit
Swing-bucket rotor Eppendorf A-4-62 Rotor
Vactrap 2 Vacum Trap Fox Lifesciences 3052101-FLS Instrument
Wave Software Application
XF 1.0 M Glucose Solution Agilent 103577-100 Reagent
XF 100 mM Pyruvate Solution Agilent 103578-100 Reagent
XF 200 mM Glutamine Solution Agilent 103579-100 Reagent
XF DMEM medium Agilent 103575-100 Reagent
XFe96 FluxPak Agilent 102601-100 Material
Xylazine (AnaSed Injection) DAILYMED NDC 59399-110-20 Anesthetic
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  2. Noguchi, M., Kasahara, A. Mitochondrial dynamics coordinate cell differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 59-64 (2018).
  3. Zhu, L., et al. Correlation between mitochondrial dysfunction, cardiovascular diseases, and traditional Chinese medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2020, e2902136 (2020).
  4. Kaarniranta, K., et al. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and their impact on age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 79, 100858 (2020).
  5. Onyango, I. G., Khan, S. M., Bennett, J. P. Mitochondria in the pathophysiology of Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. Frontiers in Bioscience. 22 (5), 854-872 (2017).
  6. Loiseau, D., et al. Mitochondrial coupling defect in Charcot-Marie-Tooth type 2A disease. Annals of Neurology. 61 (4), 315-323 (2007).
  7. Zucker-Franklin, D. Electron microscopic studies of human granulocytes: structural variations related to function. Seminars in Hematology. 5 (2), 109-133 (1968).
  8. Karnovsky, M. L. The metabolism of leukocytes. Seminars in Hematology. 5 (2), 156-165 (1968).
  9. Bao, Y., et al. mTOR and differential activation of mitochondria orchestrate neutrophil chemotaxis. The Journal of Cell Biology. 210 (7), 1153-1164 (2015).
  10. Fossati, G., et al. The mitochondrial network of human neutrophils: role in chemotaxis, phagocytosis, respiratory burst activation, and commitment to apoptosis. Journal of Immunology. 170 (4), 1964-1972 (2003).
  11. Pryde, J. G., Walker, A., Rossi, A. G., Hannah, S., Haslett, C. Temperature-dependent arrest of neutrophil apoptosis. Failure of Bax insertion into mitochondria at 15 degrees C prevents the release of cytochrome c. The Journal of Biological Chemistry. 275 (43), 33574-33584 (2000).
  12. Maianski, N. A., Mul, F. P. J., van Buul, J. D., Roos, D., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor inhibits the mitochondria-dependent activation of caspase-3 in neutrophils. Blood. 99 (2), 672-679 (2002).
  13. Bao, Y., et al. Mitochondria regulate neutrophil activation by generating ATP for autocrine purinergic signaling. The Journal of Biological Chemistry. 289 (39), 26794-26803 (2014).
  14. Chouchani, E. T., et al. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 515 (7527), 431-435 (2014).
  15. Hayashi, G., Cortopassi, G. Oxidative stress in inherited mitochondrial diseases. Free Radical Biology and Medicine. 88, 10-17 (2015).
  16. Mailloux, R. J. An update on mitochondrial reactive oxygen species production. Antioxidants. 9 (6), 472 (2020).
  17. Abuaita, B. H., et al. The IRE1α stress signaling axis is a key regulator of neutrophil antimicrobial effector function. Journal of Immunology. 207 (1), 210-220 (2021).
  18. Lood, C., et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature Medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  19. Douda, D. N., Khan, M. A., Grasemann, H., Palaniyar, N. SK3 channel and mitochondrial ROS mediate NADPH oxidase-independent NETosis induced by calcium influx. Proceedings of the National Academy of Sciencesa. 112 (9), 2817-2822 (2015).
  20. Monteith, A. J., et al. Altered mitochondrial homeostasis during systemic lupus erythematosus impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 208 (2), 454-463 (2022).
  21. Monteith, A. J., Miller, J. M., Beavers, W. N., Juttukonda, L. J., Skaar, E. P. Increased dietary manganese impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 90 (3), 0068521 (2022).
  22. Monteith, A. J., et al. Mitochondrial calcium uniporter affects neutrophil bactericidal activity during Staphylococcus aureus infection. Infection and Immunity. 90 (2), 0055121 (2022).
  23. Cao, Z., et al. Roles of mitochondria in neutrophils. Frontiers in Immunology. 13, 934444 (2022).
  24. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. The Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  25. Fan, Z., Ley, K. Developing neutrophils must eat…themselves. Immunity. 47 (3), 393-395 (2017).
  26. Riffelmacher, T., et al. Autophagy-dependent generation of free fatty acids is critical for normal neutrophil differentiation. Immunity. 47 (3), 466-480 (2017).
  27. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
  28. Swamydas, M., Isolation Lionakis, M. S. purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).
  29. Gerner, M. C., et al. Packed red blood cells inhibit T-cell activation via ROS-dependent signaling pathways. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100487 (2021).
  30. Zhang, Z. -. W., et al. Red blood cell extrudes nucleus and mitochondria against oxidative stress. IUBMB Life. 63 (7), 560-565 (2011).
  31. Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111, 1-16 (2015).
  32. Hearne, A., Chen, H., Monarchino, A., Wiseman, J. S. Oligomycin-induced proton uncoupling. Toxicology In Vitro. 67, 104907 (2020).
  33. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio-Protocol. 8 (10), e2850 (2018).
  34. Nath, S. The molecular mechanism of ATP synthesis by F1F0-ATP synthase: a scrutiny of the major possibilities. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 74, 65-98 (2002).
  35. Heinz, S., et al. Mechanistic investigations of the mitochondrial complex I inhibitor rotenone in the context of pharmacological and safety evaluation. Scientific Reports. 7 (1), 45465 (2017).
  36. Hytti, M., et al. Antimycin A-induced mitochondrial damage causes human RPE cell death despite activation of autophagy. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 1583656 (2019).
  37. Malecki, M., Kamrad, S., Ralser, M., Bähler, J. Mitochondrial respiration is required to provide amino acids during fermentative proliferation of fission yeast. EMBO Reports. 21 (11), e50845 (2020).
  38. Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
  39. Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells. The FASEB Journal. 34 (10), 13106-13124 (2020).
  40. Nicholas, D., et al. Advances in the quantification of mitochondrial function in primary human immune cells through extracellular flux analysis. PLoS One. 12 (2), e0170975 (2017).
  41. Tur, J., et al. Mitofusin 2 in macrophages links mitochondrial ROS production, cytokine release, phagocytosis, autophagy, and bactericidal activity. Cell Reports. 32 (8), 108079 (2020).
  42. Benz, R., McLaughlin, S. The molecular mechanism of action of the proton ionophore FCCP (carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Biophysical Journal. 41 (3), 381-398 (1983).
  43. Wettmarshausen, J., Perocchi, F. Assessing calcium-stimulated mitochondrial bioenergetics using the seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1925, 197-222 (2019).
  44. Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
  45. . Methods for Reducing Cell Growth Edge Effects in Agilent Seahorse XF Cell Culture Microplates Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/user-manual-methods-for-reducing-cell-growth-edge-effect-cell-analysis-5994-0240en-agilent.pdf (2019)
  46. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  47. Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (54), e2899 (2011).
  48. Normalisation of Seahorse XFe96 metabolic assaysto cell number with Hoechst stain using well-scan mode on the CLARIOstar Plus. BMG Labtech Available from: https://www.bmglabtech.com/cn/normalisation-of-seahorse-xfe96-metabolic-assays-to-cell-number-with-hoechst-stain/ (2020)
  49. Yetkin-Arik, B., et al. The role of glycolysis and mitochondrial respiration in the formation and functioning of endothelial tip cells during angiogenesis. Scientific Reports. 9 (1), 12608 (2019).
  50. Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in Biochemistry. 47, 53-67 (2010).
  51. Jandl, R. C., et al. Termination of the respiratory burst in human neutrophils. The Journal of Clinical Investigation. 61 (5), 1176-1185 (1978).
  52. Azevedo, E. P., et al. A metabolic shift toward pentose phosphate pathway is necessary for amyloid fibril- and phorbol 12-myristate 13-acetate-induced neutrophil extracellular trap (NET) formation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (36), 22174-22183 (2015).
  53. Six, E., et al. AK2 deficiency compromises the mitochondrial energy metabolism required for differentiation of human neutrophil and lymphoid lineages. Cell Death & Disease. 6 (8), e1856 (2015).
  54. Kumar, S., Dikshit, M. Metabolic insight of neutrophils in health and disease. Frontiers in Immunology. 10, 2099 (2019).
  55. Rodríguez-Espinosa, O., Rojas-Espinosa, O., Moreno-Altamirano, M. M. B., López-Villegas, E. O., Sánchez-García, F. J. Metabolic requirements for neutrophil extracellular traps formation. Immunology. 145 (2), 213-224 (2015).
  56. Invernizzi, F., et al. Microscale oxygraphy reveals OXPHOS impairment in MRC mutant cells. Mitochondrion. 12 (2), 328-335 (2012).
  57. Zenaro, E., et al. Neutrophils promote Alzheimer’s disease-like pathology and cognitive decline via LFA-1 integrin. Nature Medicine. 21 (8), 880-886 (2015).
  58. Maianski, N. A., et al. Functional characterization of mitochondria in neutrophils: a role restricted to apoptosis. Cell Death and Differentiation. 11 (2), 143-153 (2004).
  59. Bergman, O., Ben-Shachar, D. Mitochondrial oxidative phosphorylation system (OXPHOS) deficits in schizophrenia. Canadian Journal of Psychiatry. 61 (8), 457-469 (2016).
  60. Zhou, W., Qu, J., Xie, S., Sun, Y., Yao, H. Mitochondrial dysfunction in chronic respiratory diseases: implications for the pathogenesis and potential therapeutics. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 5188306 (2021).
  61. Hirano, M., Emmanuele, V., Quinzii, C. M. Emerging therapies for mitochondrial diseases. Essays in Biochemistry. 62 (3), 467-481 (2018).

Tags

Mitochondrial RespirationNeutrophilsHL60 CellsMetabolic Extracellular Flux AnalyzerMitochondrial FunctionCell Seeding DensityAssay MediumMouse NeutrophilsHuman NeutrophilsDifferentiated HL60 CellsUndifferentiated HL60 CellsBackground Correction

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pulikkot, S., Zhao, M., Fan, Z. Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils. J. Vis. Exp. (196), e64971, doi:10.3791/64971 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image