该协议能够揭示噬菌体对其宿主的影响。细菌培养物使用最能支持溶原状态的条件进行同步,从而限制了自发诱导。RT-qPCR明确区分噬菌体限制性基因和与噬菌体对照未偶联的基因与裂解复制周期中表达的基因。
温带噬菌体被发现作为噬菌体整合在大多数细菌基因组中。一些噬菌体是隐秘的并固定在细菌染色体中,但其他噬菌体是活跃的,可以自发或通过暴露于诱导因子触发成复制形式。噬菌体通常与赋予宿主细胞毒素产生或其他毒力相关特征的能力有关。最近的研究表明,它们可以在改变宿主的生理机能方面发挥更大的作用。这里描述的技术使我们能够研究噬菌体如何影响机会性细菌铜 绿假单胞菌的基因表达。
在这项工作中,比较了野生型 铜绿假单胞菌菌 株PAO1的生长情况与携带利物浦流行株(LES)LESB58不同噬菌体组合的同基因溶原的生长情况。在溶菌原培养中,一部分细菌细胞将支持裂解噬菌体复制(自发诱导),每个细胞的晚期噬菌体基因(例如与噬菌体颗粒组装相关的基因)的高水平表达,从而掩盖了与溶原限制性基因表达相关的低水平基因表达。因此,自发诱导的影响可以掩盖溶菌原群体中的噬菌体基因表达。
生长谱实验用于识别自发诱导,在早期指数生长阶段,自发诱导是最小的。本研究报告了如何在早期指数生长阶段制备样品培养物,以及如何在细胞数量低的情况下设置足够的对照。这些方案确保了在各种条件下野生型和溶原细菌的可靠和可重复的比较,从而改善了噬菌体基因组的转录组学分析,并有助于鉴定以前未识别的噬菌体功能。
最近,用于解决抗菌素耐药性的噬菌体疗法1 和基于 CRISPR-Cas 的基因编辑2 重新引起了人们对噬菌体研究的兴趣。同样,生物技术的进步使人们能够更深入地研究细菌和噬菌体之间的相互作用3。然而,噬菌体的治疗用途(“噬菌体疗法”)受到阻碍,因为人们担心噬菌体充当具有水平转移毒力和抗性基因的能力的移动遗传元件4。“暗物质”5(功能未知的基因)的广阔既令人不安又诱人。暗物质被认为是我们对噬菌体生物学理解的一个空白,也是分子工具和潜在新疗法的未开发资源6。高通量测序技术的发展,以及改进的基因注释7、8、9 和新的肽折叠算法10,正在改善噬菌体基因的检测、描述和功能预测。然而,科学还远未验证大多数噬菌体在文化或现实世界中的基因功能。
RNA 测序 (RNA-Seq) 可以对噬菌体感染期间的基因表达进行全局定位,并显着提高了对参与裂解和溶原循环的噬菌体和细菌元件的理解11,12。在溶原过程中,温带噬菌体基因组被整合到细菌 DNA 中成为噬菌体13。全局基因表达谱实验可用于鉴定在温带噬菌体基因组上编码但仅在溶原状态下表达的噬菌体限制性基因11。这些基因不编码噬菌体结构蛋白,也不参与任何噬菌体感染过程。RNA-Seq可用于鉴定那些更有可能影响细菌宿主生物学的基因,无论是通过诱导功能增益还是调节现有的细菌基因,从而通常使细菌能够适应不断变化的环境。因此,可以研究噬菌体充当微生物傀儡大师的能力,控制一系列细菌功能。
有效分析噬菌体限制性基因表达存在两个主要障碍。首先,易受感染宿主的可用性是一个关键问题。根据定义,噬菌体已经被整合到其特定的宿主基因组中,因此很难找到一个易感的野生型宿主来比较噬菌体存在和不存在时的整体基因表达。这可以通过从头感染另一个易感宿主或从原始野生型分离株中删除噬菌体来实现,而不会破坏宿主基因组的其余部分。第二个障碍在于溶原种群的异质性。一些噬菌体通过突变或重组降解成为“隐秘”,这意味着它们被固定在细菌基因组的特定位置。然而,其他噬菌体是“活跃的”,可以自发地或在暴露于诱导因子后诱导进入复制的裂解循环。在许多溶原培养物中,自发诱导的速率意味着一部分细菌细胞总是在进行裂解噬菌体复制14,15,16。这些群体中晚期噬菌体基因的高水平表达掩盖了与溶原限制性基因表达相关的低水平基因表达11,17。接受自发噬菌体诱导的溶原比例可能随生长状态、生长条件或其他触发因素而变化。因此,为了研究噬菌体对溶原的影响,必须通过优化生长条件以有利于溶原状态来尽可能减少自发的噬菌体诱导事件。
本研究报告了为调查铜绿假单胞菌利物浦流行菌株 (LES) 的一组同居噬菌体的影响而进行的准备工作。从LES中诱导并分离活性噬菌体,用于感染模型铜绿假单胞菌宿主菌株PAO116,18,19。对野生型铜绿假单胞菌菌株PAO1及其溶菌原PAO1Φ2的全基因组进行测序(覆盖深度为30倍),以确保野生型菌株的鉴定,并确认溶菌原是同源的。LES 与囊性纤维化患者的发病率和死亡率增加有关,并且 LES 噬菌体 19 被认为有助于适应囊性纤维化肺环境16,19,20。尽管有强有力的证据表明这些噬菌体会影响其宿主的生物学20,21,但它们的大部分基因功能尚未表征,并且对相互作用的具体机制知之甚少。转录组学方法可以根据经验揭示噬菌体基因在受控宿主背景下的功能。由于自发诱导会影响表达谱,本文介绍了如何优化生长条件以有利于溶原状态。这种培养物的同步可以通过实时PCR进行验证,以量化与PAO1中LES噬菌体复制的关键阶段相关的关键遗传标记的表达水平。以前曾使用相同的方法鉴定志贺产毒噬菌体的噬菌体限制性功能,这些功能会影响大肠杆菌 11、17、21、22 的运动性、耐酸性和抗菌素耐药性。
此处描述了铜绿假单胞菌噬菌体 LESΦ2 的可选择指示剂宿主的创建,该宿主以前用于斑块测定,以更准确地量化来自大肠杆菌 MC1061 37,38,39 的 Stx 噬菌体的自发诱导。这种干预的额外好处是减少了样品处理步骤和时间,从而能够同时评估多种培养条件下的自发诱导率。在利福平耐药变体的产生过程中存在产生其他突变的风险40;然而,在这项工作中,进化的菌株仅用作从感兴趣的培养物中计数斑块的指示宿主,不包括在转录组学分析中。只要可选择的指示菌株仍然同样容易受到目标噬菌体的感染,就不必担心其他获得性突变。然而,通过PAO1WT和PAO1RIF的脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析,未检测到限制性片段长度多态性谱的差异(数据未显示)。
在选择宿主细胞时,很少能找到尚未含有噬菌体的指示菌株。例如,PAO1 含有丝状原噬菌体 Pf4。本研究的实验对照旨在能够直接检查特定噬菌体(在本例中为 LES 噬菌体 2)的基因表达以及该噬菌体对细菌基因表达的影响。在比较携带 LES 噬菌体 2 和缺乏 LES 噬菌体 2(溶菌原和非溶菌原都携带内源性 Pf4)的 PAO1 转录本时,它们作为内部对照以排除 Pf4 对宿主的影响。此外,已经证明 Pf4 通常不会引起其宿主细胞41 的裂解,因此不能混淆这些实验的结果。
众所周知,仔细的质量控制在样品制备中至关重要,以产生有意义的组学数据42。然而,如前所述11,在为此类研究制备溶菌原培养物时,很少对噬菌体活性进行仔细表征。在这里,我们详细介绍了我们的系统方案,用于制备一组控制良好且优化的用于转录组学研究的培养物,以更好地探索细菌和温带噬菌体之间的相互作用。在用诱导抗生素诺氟沙星处理之前,通过使培养物至少加倍四次来控制群体的同步性。通过确定研究中菌株的诺氟沙星的MIC,我们可以确保诱导剂的浓度刚好高于“诱导”治疗的MIC。然后将处理过的细胞按1:10稀释,以在处理1小时后将诺氟沙星浓度降低到MIC以下,以使细胞恢复并完成噬菌体复制过程,最终裂解细胞并释放感染性噬菌体后代。只有在恢复期间诺氟沙星的浓度低于 MIC 时,细胞才会在诱导刺激后进入裂解复制周期。在这种情况下,诺氟沙星高于1 μg·mL-1意味着药物不能有效地稀释到MIC以下,因为诺氟沙星对PAO1的MIC为0.19 μg·mL-1。诱导剂稀释水平必须与溶原回收的需要和收获RNA的培养密度的保留相平衡。这里讨论的数据表明,可以同步培养物以创建溶原性占主导地位的样品,从而减少自发诱导的噪音,并能够检测真正的溶原性驱动的基因表达变化。由于溶原状态在细菌细胞密度低的生长早期指数阶段占主导地位,我们建议扩大培养规模以收获足够的RNA用于后续的基因表达研究,如RNA-Seq。
使用诺氟沙星作为诱导剂迫使培养物进入裂解循环已有充分报道43,44;然而,这也会影响其他细菌基因的表达45,46。为了缓解这种情况,在RNA-Seq实验中应包括在相同诱导和非诱导条件下生长的对照野生型培养物的RNA文库。使用内部对照和关键标记基因通过qRT-PCR验证噬菌体复制阶段对于准确比较也至关重要。定量RT-PCR谱分析不能通过比较每个基因在不同时间点的转录本的绝对数量来解释;重要的是轮廓的形状。首先,对任何基因的转录本中只有一个小区域进行了采样,因此它是短寿命还是长寿命的元素是未知的27。当然,转录本的RNA-Seq定位表明,定位数据的密度在基因长度上显着变化。其次,基因表达谱的形状应该被解释为与裂解周期或溶原生活方式相关的标记基因,甚至与噬菌体调节回路脱钩11。自发诱导是溶菌原培养中的一个真正问题,并且总是会导致裂解周期相关基因的表达。然而,分析确实表明,与裂解复制周期相关的基因在诱导前(至少两个对数折叠)的表达中受到抑制,并在诱导后上调。
先前对 Stx 噬菌体与大肠杆菌相互作用进行的转录组学分析支持对参与维持溶原和触发裂解循环的噬菌体基因的透彻理解11,17。目前,铜绿假单胞菌的LES噬菌体已被注释,但其关键基因功能尚不清楚。转录组学研究将能够重新注释LES噬菌体,并提高我们对溶原和裂解周期中涉及的基因的理解。将基因序列与功能联系起来是新型噬菌体研究中的一个主要挑战,这进一步凸显了需要更多的研究来确认噬菌体基因功能,以产生更好的注释工具47。本视频文章中详述的方案和额外质量控制措施的更广泛应用和调整可能有助于揭示各种噬菌体功能,从而改进注释流程并改变我们对噬菌体和细菌生物学的理解。
PAO1 | 6 | ||
LESB58 | 6 | ||
LES phages | Induced and purified from LESB58 using Norfloxacin. | This study | |
Lysogeny Broth (LB) | Merck | 1.10285.500 | |
LB Agar | Merck | 1.10283.500 | |
Agar Agar | Fisher | A/1080/53 | |
Top Agar | 0.4 g Agar Agar+2.5 g LB Broth in 100 mL water; autoclave and use. | – | |
Rifampicin | Sigma (Stock: 50 mg/mL in Methanol- Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use) | R3501 | |
Glacial Acetic Acid | Fisher 1% (v/v) in water | 10060000 | |
Norfloxacin | Sigma (Stock: 25 mg/mL of 1% Glacial Acetic Acid-Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use;To avoid freeze thaw cycles, store as small aliquotes) | N9890 | |
Phenol saturated with citrate buffer pH 4.3 | Sigma | P-4682 | |
Molecular Biology grade Ethanol | Fisher | 16695992 | |
TRIzol | Invitrogen | 12044977 | |
Chloroform | Fisher | 11398187 | |
Isopropanol | Fisher | 17150576 | |
Nuclease-free H2O | Invitrogen | 10526945 | |
10X TURBO DNase | Ambion | AM1907 | |
Qubit RNA HS, BR Kit | Invitrogen | Q10210 | |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | |
SuperScriptIII first strand synthesis kit | Invitrogen | 18080051 | |
PCR Reagents | Bioline Mytaq Red 2X | BIO-25043 | |
qPCR Reagents | Sensifast SYBR Hi Rox | BIO-92020 | |
PCR purification kit | Isolate II PCR and Gel Kit | BIO-52060 | |
TA cloning kit | TA Cloning Kit, with pCR 2.1 Vector, without competent cells | K202040 | |
StepOne Real Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4376600 |