Yaşa Bağlı Makula Dejenerasyonunun Fare Modellerinde Retinal Pigmentli Epitel Patolojilerini Değerlendirme ve Ölçme Protokolü

Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD), 55 yaşın üzerindeki popülasyonları etkileyen yaygın bir körleme hastalığıdır¹. Birçok araştırmacı, retinal pigmentli epitel (RPE) içindeki disfonksiyonun AMD^2’de erken ve önemli bir patobiyolojik olay olduğuna inanmaktadır. RPE, komşu fotoreseptörlerin ve koroidal kan damarlarının homeostazını korumakla görevli polarize hücrelerin tek katmanlıdır³. RPE içindeki hastalıkla ilişkili mekanizmaları araştırmak için, hücre kültürü modelleri ^4,5 ve fareler ^6,7,8 dahil olmak üzere çeşitli modeller mevcuttur. Yakın tarihli bir rapor, RPE hücre kültürü modelleri⁴ için standartlaştırılmış protokolleri ve kalite kontrol kriterlerini tanımlamıştır, ancak hiçbir rapor fare modellerinde RPE’nin fenotiplemesini standartlaştırmaya çalışmamıştır. Aslında, AMD’nin fare modelleri üzerine yapılan birçok yayın, RPE’nin tam bir tanımından veya içlerindeki RPE patolojilerinin nicelleştirilmesinden yoksundur. Bu protokolün genel amacı, AMD fare modellerini kullanan bilim adamları için standart RPE fenotipleme yöntemlerini tarafsız nicel değerlendirmelerle sunmaktır.

Önceki yayınlar, üç görüntüleme tekniği ile farelerde çeşitli RPE patolojilerinin varlığına dikkat çekmiştir. Örneğin, ışık mikroskobu, araştırmacıların murin retinasının brüt morfolojisini görmelerini (Şekil 1A) ve RPE incelmesi, vakuolizasyon ve göç gibi RPE patolojilerini tespit etmelerini sağlar. Bir AMD fare modelindeki RPE inceltmesi, RPE yüksekliğindeki ilgili kontrollerden sapma ile örneklendirilir (Şekil 1B). RPE vakuolizasyonu iki ayrı kategoriye ayrılabilir: mikrovakuolizasyon (Şekil 1C) ve makrovakuolizasyon (Şekil 1D). RPE mikrovakuolizasyonu, RPE’de toplam yüksekliğini etkilemeyen vakuollerin varlığı ile özetlenirken, makrovakuolizasyon, fotoreseptörlerin dış segmentlerine çıkıntı yapan vakuollerin varlığı ile gösterilir. RPE migrasyonu, retinal bir kesitte RPE tek katmanının üzerindeki pigmentin fokal agregası ile ayırt edilir (Şekil 1E). AMD donör gözlerindeki göçmen RPE hücrelerinin, farklılaşma kümesi 68 (CD68)9 gibi immünoreaktivite gösterdikleri ve RPE enkazını veya transdiferansiyasyon⁹ geçiren RPE’yi yutan bağışıklık hücrelerini temsil edebileceği unutulmamalıdır. İletim elektron mikroskobu adı verilen başka bir görüntüleme tekniği, araştırmacıların RPE’nin ve bazal zarının ultrayapısını görselleştirmelerine izin verebilir (Şekil 2A). Bu teknik, bazal laminer tortu (BLamD) olarak bilinen farelerde baskın sub-RPE birikintisini tanımlayabilir (Şekil 2B)¹⁰. Son olarak, konfokal mikroskopi, RPE düz montajlarını görüntüleyerek RPE hücrelerinin yapısını ortaya çıkarabilir (Şekil 3A). Bu yöntem, RPE dismorfisini, RPE’nin klasik petek şeklinden sapmasını ortaya çıkarabilir (Şekil 3B). Ayrıca RPE multinükleasyonunu, bir RPE hücresi içinde üç veya daha fazla çekirdeğin varlığını tespit edebilir (Şekil 3C). Mevcut AMD fare modellerinde bulunan RPE patolojilerinin bir özeti için, araştırmacıları literatürden bu incelemelere yönlendiriyoruz ^6,7.

AMD’yi inceleyen araştırmacılar, fenotipleme protokolünden önce RPE patolojilerini araştırmak için fare kullanmanın avantaj ve dezavantajlarının farkında olmalıdır. Fareler, nispeten kısa ömürleri ve maliyet etkinliklerinin yanı sıra genetik ve farmakolojik manipüle edilebilirlikleri nedeniyle avantajlıdır. Fareler ayrıca AMD donör gözlerinde^gözlenen RPE göçü, dismorfi ve çoklu çekirdeklenme dahil olmak üzere RPE dejeneratif değişiklikler sergiler 11,12,13,14,15,16,17; bu, benzer mekanizmaların farelerde ve insanlarda bu RPE patolojilerinin gelişiminin altında yatabileceğini düşündürmektedir. Bununla birlikte, fare çalışmalarının insan AMD’sine çevrilebilirliğini sınırlayan önemli farklılıklar vardır. İlk olarak, farelerde AMD’de tercihen etkilenen görme keskinliği için gerekli olan insan retinasının anatomik olarak farklı bir bölgesi olan bir makula yoktur. İkincisi, farelerde RPE incelmesi ve vakuolizasyon gibi bazı RPE patolojileri tipik olarak AMD donör gözlerinde görülmez¹⁸. Üçüncüsü, fareler AMD patolojisinin ayırt edici bir özelliği olan drusen geliştirmezler¹⁹. Drusen, RPE bazal lamina ile Bruch zarının (BrM) iç kollajenöz tabakası arasında oluşan çok az bazal membran proteinine sahip lipit ve protein içeren birikintilerdir19. Drusen, farelerde ortak alt RPE birikintisi olan BLamD’den hem bileşimlerinde hem de anatomik konumlarında farklılık gösterir. BLamD’ler, BrM’nin RPE bazal laminası ile RPE^20’nin bazal kıvrımları arasında oluşan yaşa ve strese bağlı hücre dışı matriks ile zenginleştirilmiş anormalliklerdir. İlginç bir şekilde, BLamD’ler hem farelerde hem de insanlarda benzer bir protein bileşimine ve görünümüne sahiptir ^6,10,21. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, BLamD’lerin AMD’nin sonraki aşamalarına ilerlemesini etkileyerek AMD’nin patobiyolojisinde hareket edebileceğini düşündürmektedir^18,22; Bu nedenle, bu birikintiler fare retinasında hastalıklı RPE’yi temsil edebilir. Bu faydalar ve sınırlamalar hakkında bilgi sahibi olmak, fare çalışmalarından elde edilen sonuçları AMD’ye çevirmek isteyen araştırmacılar için kritik öneme sahiptir.

Bu protokolde, RPE patolojilerini görselleştirmek için gözleri ışığa, iletim elektronuna ve konfokal mikroskopiye hazırlama yöntemlerini tartışıyoruz. Ayrıca, istatistiksel testler için RPE patolojilerinin tarafsız bir şekilde nasıl ölçüleceğini de açıklıyoruz. Kavramın kanıtı olarak, transmembran protein 135- (Tmem135) aşırı eksprese eden farelerde ve yaşlı vahşi tip (WT) C57BL / 6J farelerde gözlenen yapısal RPE patolojilerini araştırmak için RPE fenotipleme protokolünü kullanıyoruz. Özetle, AMD fare modellerinde RPE’yi karakterize etmek için fenotipleme metodolojisini tanımlamayı amaçlıyoruz, çünkü şu anda standart protokoller mevcut değildir. AMD fare modellerinde de etkilenen fotoreseptörlerin veya koroidin patolojilerini incelemek ve ölçmek isteyen araştırmacılar, bu protokolü çalışmaları için yararlı bulamayabilirler.