Протокол оценки и количественной оценки патологий пигментного эпителия сетчатки на мышиных моделях возрастной макулярной дегенерации

Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) является распространенным заболеванием, приводящим к слепоте, которое поражает население старше 55 лет¹. Многие исследователи считают, что дисфункция пигментного эпителия сетчатки (RPE) является ранним и важным патобиологическим событием при ВМД². RPE представляет собой монослой поляризованных клеток, которым поручено поддерживать гомеостаз соседних фоторецепторов и хориоидальных кровеносных сосудов³. Существует множество моделей для исследования связанных с заболеванием механизмов в RPE, включая модели^{клеточных культур 4,5} и мышей 6,7,8. В недавнем отчете были описаны стандартизированные протоколы и критерии контроля качества для моделей клеточных культур RPE⁴, но ни в одном отчете не было предпринято попыток стандартизировать фенотипирование RPE на моделях мышей. На самом деле, во многих публикациях, посвященных мышиным моделям ВМД, отсутствует полное описание РПЭ или количественная оценка патологий РПЭ в них. Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы представить стандартные методы фенотипирования RPE с непредвзятыми количественными оценками для ученых, использующих модели мышей AMD.

В предыдущих публикациях отмечалось наличие нескольких патологий RPE у мышей с помощью трех методов визуализации. Например, световая микроскопия позволяет исследователям просматривать общую морфологию сетчатки мышей (рис. 1A) и выявлять патологии RPE, такие как истончение RPE, вакуолизация и миграция. Истончение RPE в модели мыши AMD иллюстрируется отклонением высоты RPE от соответствующих элементов управления (рис. 1B). Вакуолизацию РПЭ можно разделить на две отдельные категории: микровакуолизация (рис. 1C) и макровакуолизация (рис. 1D). Микровакуолизация РПЭ суммируется наличием вакуолей в РПЭ, которые не влияют на его общую высоту, тогда как макровакуолизация обозначается наличием вакуолей, выступающих во внешние сегменты фоторецепторов. Миграция РПЭ отличается фокальным агрегатом пигмента над монослоем РПЭ в поперечном сечении сетчатки (рис. 1Е). Следует отметить, что мигрирующие клетки RPE в донорских глазах ВМД проявляют иммунореактивность к маркерам иммунных клеток, таким как кластер дифференцировки 68 (CD68)9, и могут представлять собой иммунные клетки, поглощающие обломки RPE, или RPE, подвергающиеся трансдифференцировке ⁹. Другой метод визуализации, называемый просвечивающей электронной микроскопией, может позволить исследователям визуализировать ультраструктуру RPE и его базальной мембраны (рис. 2A). Этот метод может идентифицировать преобладающее отложение суб-RPE у мышей, известное как базальное ламинарное отложение (BLamD) (рис. 2B)¹⁰. Наконец, конфокальная микроскопия может выявить структуру клеток RPE с помощью визуализации плоских креплений RPE (рис. 3A). Этот метод позволяет выявить дисморфию СИЗД, отклонение РПЭ от его классической сотовой формы (рис. 3Б). Он также может обнаруживать многоядерность RPE, наличие трех или более ядер в ячейке RPE (рис. 3C). Для краткого изложения типов патологий RPE, присутствующих в современных моделях мышей AMD, мы отсылаем исследователей к этим обзорам из литературы ^6,7.

Исследователи, изучающие ВМД, должны знать о преимуществах и недостатках использования мышей для исследования патологий РПЭ до протокола фенотипирования. Мыши выгодны из-за их относительно короткой продолжительности жизни и экономической эффективности, а также их генетической и фармакологической манипулятивности. У мышей также наблюдаются дегенеративные изменения RPE, включая миграцию RPE, дисморфию и многоядерность, которые наблюдаются в донорских глазах^AMD 11,12,13,14,15,16,17; это говорит о том, что подобные механизмы могут лежать в основе развития этих патологий RPE у мышей и людей. Тем не менее, есть ключевые различия, которые ограничивают переводимость исследований на мышах на ВМД человека. Во-первых, у мышей нет макулы, анатомически обособленной области сетчатки человека, необходимой для остроты зрения, которая преимущественно поражается при ВМД. Во-вторых, некоторые патологии RPE у мышей, такие как истончение RPE и вакуолизация, обычно не наблюдаются в донорских глазах^{AMD 18}. В-третьих, у мышей не развиваются друзы, что является отличительной чертой патологии ВМД¹⁹. Друзы представляют собой липид- и белковые отложения с очень небольшим количеством белков базальной мембраны, которые образуются между базальной пластинкой RPE и внутренним коллагеновым слоем мембраны Бруха (BrM)¹⁹. Друзы отличаются от BLamD, распространенного суб-РПЭ у мышей, как по составу, так и по анатомическому расположению. BLamD представляют собой зависимые от возраста и стресса аномалии, обогащенные внеклеточным матриксом, которые образуются между базальной пластинкой RPE BrM и базальными складками RPE²⁰. Интересно, что BLamD имеют схожий белковый состав и внешний вид как у мышей, так и у людей ^6,10,21. Недавняя работа предполагает, что BLamD могут влиять на патобиологию ВМД, влияя на прогрессирование ВМД до более поздних стадий^18,22; таким образом, эти отложения могут представлять собой пораженный RPE в сетчатке мыши. Знание этих преимуществ и ограничений имеет решающее значение для исследователей, заинтересованных в переводе результатов исследований на мышах в AMD.

В этом протоколе мы обсуждаем методы подготовки глаз к световой, просвечивающей электронной и конфокальной микроскопии для визуализации патологий RPE. Мы также описываем, как непредвзято количественно оценивать патологии RPE для статистического тестирования. В качестве доказательства концепции мы используем протокол фенотипирования RPE для исследования структурных патологий RPE, наблюдаемых у мышей с избыточной экспрессией трансмембранного белка 135- (Tmem135) и старых мышей дикого типа (WT) C57BL / 6J. Таким образом, мы стремимся описать методологию фенотипирования, чтобы охарактеризовать RPE в моделях мышей AMD, поскольку в настоящее время нет доступных стандартных протоколов. Исследователи, заинтересованные в изучении и количественной оценке патологий фоторецепторов или сосудистой оболочки, которые также поражаются на моделях мышей с ВМД, могут не счесть этот протокол полезным для своих исследований.