フローサイトメトリー による 造血幹細胞と前駆細胞の血縁関係、分裂数、表現型の同時評価

以下のプロトコルでは、匿名化された臍帯血をHSPCソースとして使用し、サンルイ病院臍帯血バイオバンク(承認AC-2016-2759)およびヘルシンキ宣言によって定義されたガイドラインに従って収集されました。 注意: 開始する前に、 材料の表 に記載され、プロトコルに記載されているように、このプロトコルに必要なすべての試薬と機器が利用可能であることを確認してください。関連する試薬を新鮮に準備し、明示的に言及されていない限り、保管しないでください。 1. 細胞色素染色 注:このセクションでは、CFSEとバイオレット染料(CTV)細胞分裂染料の4つの組み合わせによる染色について説明します。細胞色素溶液を添加しなくても、すべてのチューブを同時に処理します。全ての工程は、以下の細胞培養工程を可能にするために無菌条件下で行われる。所要時間:約100分 磁気選別プロトコル29に従って臍帯血ユニットを処理する。大きなCD34- 画分と小さいCD34+ 画分の2つの画分が利用可能であることを確認してください。両方のチューブを300 x gで5分間回転させます。ペレットを乱すことなく上清を吸引する。 CD34+ 画分については、ウシ胎児血清(FBS)を含まないダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)1 mLに再懸濁します。血球計算盤を使用して細胞をカウントします。細胞密度は、3 x 106 細胞/ mLを超えてはなりません。この場合は、それに応じて音量を調整してください。CD34- 画分については、FBSなしでDMEMに再懸濁し、容量を最大6 x 106 細胞/ mLに調整します。 250 μLのCD34+画分を4本の15 mLポリプロピレンチューブに分注します。チューブに次のようにラベルを付けます:CD34 + / CF(CFSE_only)、CD34 + / CV(CFSE_high CTV_low)、CD34 + / VC(CFSE_low CTV_high)、およびCD34 + / VI(CTV_high)。250 μLのCD34-画分を別の4本の15 mLポリプロピレンチューブに分注します。チューブに次のようにラベルを付けます:CD34-/ CF(CFSE_only)、CD34-/ CV(CFSE_high CTV_low)、CD34-/ VC(CFSE_low CTV_high)、およびCD34-/ VI(CTV_high)。CD34-画分由来の残りの細胞は廃棄することができる。 CFSE_high と CFSE_low という名前の 2 つの CFSE ソリューションを準備します。CFSE_high(10 μM)の場合、FBSなしのDMEM1.1 mLとCFSEストック(5 mM)溶液2.2 μLを混合します。CFSE_low (5 μM) の場合は、FBS なしの DMEM 550 μL と CFSE ストック (5 mM) 溶液 0.55 μL を混合します。 CFチューブとCVチューブに250 μLのCFSE_high溶液、VCチューブに250 μLのCFSE_low溶液、FBSなしのDMEM250 μLをVIチューブに加えます。細胞懸濁液と細胞色素を効率的に混合するには、チューブをほぼ90度傾け、CFSE溶液をチューブ壁に堆積させます。次に、チューブを垂直に保持して2つの溶液を混合し、ピペットを3〜4回使用して、CFSE溶液と再懸濁された細胞との迅速な混合を確保します。37°Cで正確に8分間インキュベートします。 インキュベーション後、5 mLのDMEM + 10Sを加えます。チューブを37°Cで5分間保ちます。 チューブを300 x gで5分間回転させます。ペレットを乱すことなく吸引 によって 上清を除去し、5 mLのリン酸緩衝生理食塩水1x /エチレンジアミン四酢酸(PBS 1x / EDTA)でペレットを洗浄します。300 x gで5分間再び回転します。ペレットを乱すことなく上清を廃棄し、細胞ペレットを250 μLの1x PBS / EDTAに再懸濁します。 CTV_high と CTV_low という名前の 2 つの CTV ソリューションを準備します。CTV_high(10 μM)の場合は、1.1 mLのPBS 1x/EDTAと2.2 μLのCTVストック(5 mM)を混合します。CTV_low (5 μM) の場合、550 μL の PBS 1x/EDTA を 0.55 μL の CTV ストック (5 mM) と混合します。 250 μLのCTV_high溶液をVCおよびVIチューブに、250 μLのCTV_low溶液をCVチューブに、250 μLの1x PBS / EDTAをCFチューブに追加します。手順 1.5 で説明したのと同じ手法を使用します。37°Cで正確に8分間インキュベートします。 インキュベーション後、5 mLのDMEM + 10Sを加えます。37°Cで5分間保ちます。 チューブを300 x gで5分間回転させ、ペレットを乱すことなく上清を廃棄してから、5 mLの1x PBS / EDTAでペレットを洗浄します。300 x gで5分間再び回転します。 ペレットを乱すことなく上清を廃棄し、CD34- 画分を1x PBS / EDTAに再懸濁して、最終濃度1.5 x 106 細胞/mLにします。CD34+ 画分を40 μLの染色バッファーに再懸濁し、細胞を1.5 mLチューブに移します。 2. 抗体染色 注:抗体染色は、実験のニーズに応じてカスタマイズできます。CD34+ 画分のみが抗体染色を受けます。CD34- 画分は、細胞分裂色素の組み合わせ(CV、VC、CF、およびVI画分)の単一染色コントロールとして使用されます。以下のパネルは、造血幹細胞(HSC)、多能性前駆細胞(MPP)、リンパ質プライミング多能性前駆細胞(LMPP)、造血前駆細胞(HPC)の4種類のHSPCを検出するように調整されています12。ただし、HSCとMPPの識別が提示されています。所要時間:75分 補正ビーズを使用して、表面染色用の単一染色を準備します。陰性ビーズと免疫グロブリンG(IgG)ビーズを1:1の比率で混合し、総容量は20 μL×表面マーカーの数(例えば、染色パネルに6つの抗体が含まれている場合は120 μL)に相当する量にします。 マーカーごとに20 μLのビーズを個別の1.5 mLチューブに送ります。対応するチューブ内の各抗体の希釈倍率に対応する容量を追加します(たとえば、希釈倍率が1:20の場合は、1 μLを追加します)。 CD34+細胞を染色するために、表1に基づいて抗体12のマスターミックスを調製します。抗体を単一の0.5 mLチューブに混合します。抗体マスターミックスから7 μLを4つのCD34+条件のそれぞれに追加します。 補正ビーズとCD34+ サンプルを4°Cで少なくとも30分間インキュベートします。注:インキュベーション時間は、染色に使用される抗体の技術的な詳細に適合させる必要があります。 インキュベーション中に、マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルに100 μLの細胞培養培地を加え、ソーティングに使用する96ウェルの丸底プレートを準備します。注意: ウェルH8-H12は空のままにします。 表面染色コントロール(5、ビーズを使用)、細胞分裂色素コントロール(4、CD34- 画分を使用)、およびCD34+ サンプル(4)用の5 mLポリプロピレンチューブを標識します。 インキュベーションの最後に、細胞とビーズを1 mLの染色バッファーで洗浄します。全容量を5 mLポリプロピレンチューブに移します。チューブを300 x gで5分間遠心分離し、ペレットを乱すことなく上清を吸引します。 ビーズとCD34+ 細胞にそれぞれ約500 μL、CD34- チューブに1 mLを使用して、細胞を染色バッファーに再懸濁します。 表1:セルソーティング実験用の抗体マスターミックスを調製するためのテンプレート。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 3.セルソーティング 注 : 並べ替えられるセル番号は、使用可能なセルの合計数によって異なる場合があります。プロトコルでは、各コントロールの最小セル番号が提供されます。所要時間(1枚の場合):100分 テンプレート実験を開くか、新しい実験を設定します。1 つの試験片と複数のチューブを、各条件ごとに 1 つずつ作成します。 図1で詳述したゲーティング戦略を設定し、6つのドットプロット 図を作成します。まず、FSC-A/SSC-Aドットプロットでセルを視覚化し、 ポリゴンゲーティングツール をダブルクリックして、側方散乱の低い母集団を選択します(図1A)。次のドットプロット(FSC-A / FSC-H)で、 プロット を右クリックし、ドロップダウンメニューからゲート「セル」をクリックして選択します。同じ ゲーティングツールを使用して 、2つの軸間の対角線上のタイトな母集団を選択します(図1B)。 3番目のドットプロット(APC対FSH-H)で、母集団「単一細胞」を表示し、APC系統(Lin)の発現に対して陰性の細胞をゲートします(図1C)。4番目のプロット(CFSE対CTV)で、母集団「Lin-」を表示し、色素の組み合わせごとに1つずつ、4つの分離ゲートを作成します(図1D)。注:均質に染色された細胞のごく一部のみを選択するには、これらのゲートをしっかりとする必要があります。 5番目と6番目のプロット(APC-Cy7対BV650およびPE-Cy7対PE)を使用して、目的の前駆細胞を特定します。5番目のプロットのCD34 + CD38-集団とCD34 + CD38+を寛大にゲートします(図1E)。次に、6番目のプロットでCD34+CD38-集団を選択し、図1Fに従って3つのゲートを描画します。 補正ビーズを含む単一の染色チューブを実行し、[ 取得 ]ボタンをクリックします。 [パラメーター ]ドロップダウンメニューから、特に細胞分裂色素(2指数スケールで104 から105 の間)の光電子増倍管(PMT)電圧を調整します。 [ 補正 ] タブを使用して、並べ替えに使用するパネルに応じて補正マトリックスを調整します。ビーズゲートに少なくとも5,000のイベントを記録し、[ 記録 ]ボタンをクリックします。 CD34- 分数を実行し、補正行列を再度確認します。単一セル ゲートで少なくとも 10,000 イベントを 記録 します。 CD34+ フラクションを実行し、シングルセルゲートで少なくとも5,000のイベントを記録します。色素の組み合わせごとにゲートを調整し、タイトなゲートを設定して均質な集団を選択します(図1D)。同様に、HSC と MPP を選択するためのゲーティングを調整します。 分析が完了し、すべてのチューブが記録されたら、96ウェルプレートでソーティングするための標準Ariaキャリブレーションを実行した後、プレートを適切なホルダーに挿入します。プレートを冷却することをお勧めします。 実験ソートレイアウトを使用して、表2に示すスキームに従ってプレートソーティングテンプレートを準備します。「CD34-」と名付けられたウェルには、CF/CV/VC/VIゲートでソートされた5,000〜10,000個の細胞が含まれています。「バルク」ウェルには、ゲートCD34 + CD38-でソートされた少なくとも500個の細胞が含まれています。最後に、単一細胞ウェルには、ウェルごとの細胞分裂色素の組み合わせごとに1つのイベントしか含まれていないため、ウェルあたり合計4つのイベントが含まれます。注:「バルク」集団は、特定の祖先のサブセットに適合させることができます。500 個未満のセルを並べ替えないでください。 選別は順番に進み、すべての細胞分裂色素の組み合わせを完了してから次のものに移ります。例えば、CD34- CFを 収率 純度モードで選別することから始めます。取得ボタンをクリックしてから、並べ替えボタンをクリックします。 CD34- ソーティングの最後に、CF CD34+ チューブを挿入します。取得し、並べ替えボタンをクリックして、純度グレードとして0/ 16/0 にチェックマークを付けていることを確認します。最後に、目的のセルをウェルごとに1セルずつ単一 セル の純度でソートし、[ インデックスソート ]オプションにチェックマークを付けます。 以下の細胞分裂色素の組み合わせに移り、同じ順序を繰り返す。参考として、 表2 は選別されたプレートの例を提供する。注: インデックスソート機能は、ソートされた条件ごとに個別のファイルを生成します。 並べ替えの最後に、ファイルを .fcs 3.0 ファイルとしてエクスポートします。細胞を37°C、5%CO2 インキュベーターに入れる。細胞は、実験計画に従って、少なくとも24時間26日間培養される。 表2:連続フローサイトメトリー分析のための特定の要件に基づく、セルソーティング96ウェルプレートのテンプレート。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 4. セルソーティングデータ解析 注:セルソーティングの品質を検証するには、先に進む前にFACSデータ分析が必要です。この手順の主な出力は、並べ替えられた個々のセルのマーカー強度を含むスプレッドシートの生成です。 解析ソフトウェアで .fcs 3.0 ファイルをアップロードします。 実際のソーティングの前に記録された単一の染色ファイルを使用して、セルソーティング中に使用された補正設定を確認します。 異なるバルクに対応するファイルを使用して、改訂されたゲーティング戦略を設定します。これらのゲートをコピーして、インデックスソートファイルに貼り付けます。 インデックスソートされたセルが設定されたゲートに落ちたことを確認します。誤ってゲートされたソートされたセルがある場合は、インデックスソート中に記録されたプレート座標をエクスポートすることで識別し、分析の後半で削除できます。 インデックスソートファイルからイベントを補正パラメータとしてエクスポートします。それらを.csvファイルとしてエクスポートし、「スケール値」と「補正されたパラメータ」のオプションにチェックマークを付けます。これらのファイルは、「エクスポートされたファイル」という名前のフォルダーにエクスポートする必要があります。 補足ファイル 1 のスクリプトを使用して、すべてのファイルを 1 つの .csv ファイルに結合します。関数 “setwd”で正しいパスを設定します。このスクリプトの出力は、すべての異なるゲート イベントとすべてのパラメーターの相対強度を含むスプレッドシートです。 5. 培養後抗体染色 注意: プロトコルのこの部分は無菌状態で実行してください。いくつかの試薬は前のステップと共有されており、無菌状態を維持する必要があります。フローサイトメトリー分析には、プレートリーダー付きのフローサイトメーターを使用します。これにより、組織培養プレート内で直接染色を行うことができ、ピペッティングおよびスピニングの量を制限することにより細胞損失を最小限に抑えることができる。CF/CV/VC/VI カラーの単一染色を表し、96ウェルプレートにすでに存在するウェルA1〜A4を除き、補正ビーズを使用して表面マーカー単色染色を準備します。細胞色素に従ってソートされたバルク集団は、分裂数と一般的なゲーティングのゲーティング戦略を設定するのに役立ちます。所要時間:120分 プロトコルを開始する前に、倒立顕微鏡でプレートをチェックして、少なくとも1つのセルを含むウェルに印を付けます。このステップにより、染色に使用される抗体の量を最適化し、手順をスピードアップできます。 抗体マスターミックスを調製し、 表3に従って。かなりの量のピペッティングがあるため、この表では、追加の5%容量を含む、ピペッティングによる技術的エラーを考慮しています。表に記載される抗体は、ヒト臍帯血試料12からのHSPCの範囲を特徴付けることを可能にする。 プレートを300 x gで5分間遠心分離します。フードの下とペーパータオルの上にプレートをすばやく反転させて、上清を取り除きます。 8 μLの染色バッファーをウェルA1-A4に加えます。8 μLの混合物を他のウェルに加えます。 ネガティブビーズとIgG補正ビーズを1:1の比率で混合し、総容量120 μLに相当する量にします。 各マーカーごとに1.5 mLチューブに20 μLを送ります。希釈倍率に対応する抗体量を追加します(例:希釈倍率が1:20の場合は、1 μLを追加します)。注:総容量を染色に使用するマーカーの数に合わせて調整します(例:染色パネルに5つの抗体が含まれている場合は100 μL)。 プレートと単一染色補正コントロールを+4°Cで少なくとも30分間インキュベートします。注:インキュベーション時間は、染色に使用される抗体の技術的な詳細に合わせて調整する必要があります。 ビーズを1 mLの染色バッファーで洗浄します。前述した5 mLのポリプロピレンチューブに全容量を移します。チューブを300 x gで5分間遠心分離し、吸引 によって 上清を除去します。 マルチチャンネルピペットを使用して、ウェルあたり100 μLの染色バッファーを加えてプレート内の細胞を洗浄します。プレートを300 x g で5分間遠心分離し、フードの下とペーパータオルの上でプレートをすばやく反転させて、上清を除去します。 マルチチャンネルピペットを使用して、85 μLの染色バッファーに細胞を再懸濁します。 フローサイトメーター(取得モード)で、専用のテンプレートを使用して カスタムをクリックして分析を開始します。このカスタマイズされたテンプレートは、96ウェル丸底プレートの技術的特徴、特に各ウェルの寸法(直径、深さ、厚さ)を考慮に入れています。プローブは井戸の底に到達する必要があるため、井戸A1とH12の正確な中心に置きます。 ソフトウェアによって提案されたリストから目的の 蛍光色素 を選択した後、表2のプレートテンプレートに従って プレートセットアップ を設定し、少なくとも1つのセルを含むウェルの数を補正します。 取得容量の上限として100 μLを選択します。攪拌オプションにチェックマークを付けます。取得速度を最大1 μL/sに設定し、低速化するとウェルあたりの総分析量が向上します。 適切な洗浄および洗浄液をウェルH8-H12に追加します。 表2 のテンプレートは、フローサイトメーターが分析の最後にさまざまな洗浄条件を実行する必要があるため、ウェルH8-H12を空のままにします。注:このステップは、使用するフローサイトメーターの詳細に適合しています。 プロットとゲートのセクションで、最初にFSC-A/SSC-A散布図を使用して単一セルゲートを設定し、次にFSC-H/FSC-A散布図を使用します。対象のマーカーごとに ヒストグラム を作成します。 設定を確認したら、[ 分析 ]セクションに進みます。最初に単一染色を分析し、補正ビーズとCD34染色画分の両方について、5,000イベント以上(最適範囲:5,000〜15,000イベント) を記録 します。必要に応じて電圧を調整します。 単一の染色がすべて記録されたら、取得機能をクリックして実際の 取得 を開始できます。 表3:フローサイトメトリー実験、特にヒト臍帯血からのHSPCの同定のための抗体マスターミックス。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 6. 培養後のフローサイトメトリーデータ解析 メモ: 説明されているデータ分析は、 材料表に記載されているソフトウェアに固有のものです。主な出力は、分析された各セルごとの表面マーカー強度、分割数、および親族関係の情報を含むスプレッドシートの生成です。プロトコルのこの部分には、最終的な分析スプレッドシートを生成するためにこのワークフローに必要な、Rで記述されたスクリプトが含まれています。 フローサイトメーターからファイルを.fcsファイルとしてエクスポートします。それらを解析ソフトウェアにアップロードし、「単一染色」、「バルク」、「シングルセル」としてグループ化します。 単一の染色ファイルを使用して補正マトリックスを準備し、 ドラッグアンドドロップで他の2つのグループに適用します。注意: 自動補正ツールを使用する場合は、先に進む前に手で品質を確認してください。 代表的なゲーティングを作成するには、異なるバルクウェルを1つのファイルに連結します。この手順では、2 つの色が重なっているかどうか (通常は CV と VC)、またはその他の異常が強調表示されるため、除外する必要があります。 母集団の連結 オプションをクリックした後、「パラメータ」メニューからすべての 補正されていないパラメータ を選択し、 連結をクリックします。 連結されたファイルをワークスペースにアップロードし、ドラッグアンドドロップで補正マトリックスを適用します。 連結されたファイルを使用して、 図 2 で定義したゲーティング戦略を準備します。単一セル ゲートで、CFSE と CTV を使用して散布図にイベントを表示します。Labeledという最初のゲートを作成し、4色すべてを含み、可能な自己蛍光を除外します(図2C)。次に、各色を個別にゲートします。 CVおよびVCで標識されたセルは、色がCFSEおよびCTV信号の結果であることを考慮して、変換された値を必要とする。したがって、2つの調整された信号は対数スケールで45°回転し、分割希釈をx軸と平行に進めることができます。この変換された値は、[ツール]、[ パラメーターの作成] の順にクリックして手動で取得されます。次の数式を 数式 ボックスに貼り付けます。メモ: 式26 では、CFSE と CTV がパラメータ 03 と 17 であることを前提としています。 [派生パラメーター] という名前のこの新しいパラメーターを正しく視覚化するには、~3-7 の範囲の直線軸を設定し、[軸] パラメーター オプションをクリックして [ 軸のカスタマイズ] を選択します。 ヒストグラムプロットとして各色に個別にゲーティングを適用します:CFとVIの場合、それぞれx軸に CFSE-A と CTV-A を設定します。CV および VC の場合は、新しく 派生したパラメータ を X 軸に設定します。 図3に示すように、各ピークに対応するゲートを設定します。 個々の単一セルウェルにゲーティングを適用します。分析されたすべてのウェルに派生パラメータを追加してください。各ウェルの各カラーゲートを手動で検証して、特定のピークに誤って割り当てられているイベントを検出します。ゲーティングの例を 図 4 に示します。 解析が完了し、すべてのウェルが検証されたら、少なくとも1つのセルを含むすべてのCF/CV/VC/VIゲートを選択します。それらを.csvファイルとして エクスポート し、「スケール値」と「補正されたパラメータ」のオプションにチェックマークを付けます。これらのファイルは、「エクスポートされたファイル」という名前のフォルダーにエクスポートされます。 補足ファイル 1 の R スクリプトを使用して、すべてのファイルを 1 つの.csvに結合します。関数 “setwd”で正しいパスを設定することを忘れないでください。このスクリプトの出力は、すべての異なるゲート イベントとすべてのパラメーターの相対強度を含むスプレッドシートです。 スプレッドシートを開き、CFSE、CTV、CD90、CD123、CD45RA、CD34、CD38 などの名前を使用して、各パラメーターの列の名前を変更します。これらの名前は、各セルに ID を正しく割り当てるためのゲーティングしきい値を識別するために使用されます。 “Well”、”Condition”、”Color”、”Generation”、”Original_cell”、および “Culture_time” という名前の 6 つの列を追加します。これらの変数は実験的に定義された変数であり、各行から推論されます。export_A10 CD34 + PBS_CV_Peak 1.csv.1 = A10 (ウェル)、CD34+( Original_cell)、PBS(状態)、CV(色)、Peak_1(生成)。 バルクウェルをエクスポートしてゲーティングのしきい値を特定します:補償された対象母集団(CD34 + CD38-など)を.csvファイルとしてエクスポートし、「スケール値」と「補正されたパラメータ」オプションにチェックマークを付けます。これらのファイルを「エクスポートされたファイル」という名前のフォルダーにエクスポートします。 CD38 のしきい値を見つけるには、このパラメーターの最大数値を特定します。逆に、CD34のしきい値を見つけるには、このパラメーターの最小数値を特定します。目的のすべてのパラメータに対してこのプロセスを繰り返します。注:プロトコルに示されている分析では、マーカーCD45RAを使用して、CD34 + CD38-ゲートのLMPPとCD34 + CD38 +ゲートのCMP / GMPを識別します。これは、このマーカーに対して 2 つの異なるしきい値を抽出する必要があることを意味します。 しきい値をコピーして「gating_matrix」というExcelファイルに貼り付けます。このファイルは 表4に従って編成されており、複数の独立した実験の分析を可能にします。XXYYMMDD_xxh、XXは演算子の2つのイニシャル、YYは年の最後の2つの数字、MMは月、DDは日、xxは分析時点を表します。 表4:統計解析前の細胞運命割り当てのゲーティングマトリックス。 CD45hはHPCサブセットゲーティングのCD45RAの強度を指し、CD45lはCD34+CD38- サブセットのCD45RAの強度を指します。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 7.統計分析 注: 生成されたデータの統計テストには、プログラミング言語 Python (補足ファイル 2、補足ファイル 3、および補足ファイル 4) を使用してコーディングされたカスタムメイドの分析パイプラインが含まれます。スクリプトは、スプレッドシートを処理するための最初のブロック、データ視覚化用のヒートマップを生成するための2番目のブロック、および差別化と分割のプロパティを分析およびテストするための複数のヒストグラムを生成する最後のブロックの3つのブロックで構成されています。 ブロック「0_process_data」(補足ファイル2)から開始して、gating_matrixとデータスプレッドシートのパスがスクリプトで正しく定義されていることを確認します。 「cell_cols」辞書を定義して、関連するセルの運命を各セルに割り当てます。特定のケースでは、運命はHSC、MPP、LMPP、一般的な骨髄系前駆細胞(CMP)、顆粒単球性前駆細胞(GMP)、巨核球性赤血球前駆細胞(MEP)、およびCD34-です。 バルクウェルから定義された閾値(ステップ6.16)を使用して、「cell_class_exp_time」関数を定義します。手順 6.12 で各列を定義するのに使用したのと同じ名前を使用して、これらのしきい値を正しく定義するには、列の名前付けに一貫性を持たせることが不可欠です。 細胞表現型は、フローサイトメトリー分析中に検出された閾値に基づいて、一連の「if-else」ステートメントを使用してスクリプトで定義されます。注:他のマーカーの組み合わせに対応するようにこれらのステートメントを変更することにより、さまざまな表現型を表示できます。 関数「cond_rule」を使用して、実験固有の条件を指定します(たとえば、異なる実験的処理)。指定されたデータセットの場合、条件には “GT” と “Diff” という名前が付けられます。細胞の培養に使用される2つの異なる細胞培養培地について説明します。この情報は、ヒートマップをプロットするためにブロック「1_dot_plot」(補足ファイル3)によって使用されます。 ブロック「2_bar_plot」(補足ファイル4)で、関心のある離散セルの運命を含む辞書「class_dct」を定義します。提供されたデータセットの場合、関心のあるセルの運命は、「cell_cols」辞書で説明されているものと同じです。 “conds” (条件)、”or_cells” (元のセル)、”sym_labs” (対称ラベル)、および “時間” (実験時点) を定義します。これらは、プロットに必要なフィルターを繰り返しています。「conds」は「cond_rule」で定義された条件を再度取り、「or_cells」はHSCとMPPであり、「sym_labs」は分割の種類を表します。 ブロック「2_bar_plot」では、分裂6まで進行した細胞をプロットすることが可能です。注:提供されるデータセットにはディビジョン4までのセルしか含まれていないため、エラーメッセージが表示されますが、スクリプトの動作を妨げることはありません。 スクリプトによって生成された図は、「figures」という名前のフォルダにpdfファイルとして取得できます。「Test」という名前のファイルは、対応するヒストグラムに対して実行されるさまざまな統計的検定を表します。