التقييم المتزامن للقرابة ورقم القسمة والنمط الظاهري عن طريق قياس التدفق الخلوي للخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم
Summary
تظهر هنا تقنية قائمة على قياس التدفق الخلوي تسمح بقياس عدد انقسامات الخلايا والنمط الظاهري للخلية السطحية والقرابة الخلوية في وقت واحد. يمكن اختبار هذه الخصائص إحصائيا باستخدام إطار عمل قائم على التقليب.
Abstract
قليل من التقنيات يمكنها تقييم النمط الظاهري والمصير لنفس الخلية في وقت واحد. معظم البروتوكولات الحالية المستخدمة لتوصيف النمط الظاهري ، على الرغم من قدرتها على توليد مجموعات بيانات كبيرة ، تستلزم تدمير الخلية ذات الاهتمام ، مما يجعل من المستحيل تقييم مصيرها الوظيفي. لذلك يصعب وصف أنظمة التمايز البيولوجي غير المتجانسة مثل تكون الدم. بناء على أصباغ تتبع انقسام الخلايا ، قمنا بتطوير بروتوكول لتحديد القرابة ورقم القسمة وحالة التمايز في وقت واحد للعديد من أسلاف المكونة للدم المفردة. يسمح هذا البروتوكول بتقييم إمكانات التمايز خارج الجسم الحي للفئران والأسلاف المكونة للدم البشرية ، المعزولة من مصادر بيولوجية مختلفة. علاوة على ذلك ، نظرا لأنه يعتمد على قياس التدفق الخلوي وعدد محدود من الكواشف ، فإنه يمكن أن يولد بسرعة كمية كبيرة من البيانات ، على مستوى الخلية الواحدة ، بطريقة غير مكلفة نسبيا. كما نقدم خط الأنابيب التحليلي للتحليل أحادي الخلية ، جنبا إلى جنب مع إطار إحصائي قوي. نظرا لأن هذا البروتوكول يسمح بربط انقسام الخلايا والتمايز على مستوى الخلية الواحدة ، فيمكن استخدامه لإجراء تقييم كمي لالتزام المصير المتماثل وغير المتماثل ، والتوازن بين التجديد الذاتي والتمايز ، وعدد الانقسامات لمصير التزام معين. إجمالا ، يمكن استخدام هذا البروتوكول في التصاميم التجريبية التي تهدف إلى كشف الاختلافات البيولوجية بين أسلاف المكونة للدم ، من منظور خلية واحدة.
Introduction
تميز العقد الماضي بالانتشار العالمي لنهج الخلية الواحدة للبيولوجيا الخلوية والجزيئية. باتباع خطوات علم الجينوم أحادي الخلية 1,2 ، من الممكن في الوقت الحاضر دراسة العديد من مكونات الخلية الواحدة (على سبيل المثال ، الحمض النووي ، الحمض النووي الريبي ، البروتينات) ، مع تقنيات أوميكس أحادية الخلية الجديدة التي تزدهر كل عام. وقد ألقت هذه التقنيات الضوء على الأسئلة القديمة والجديدة لمجالات علم المناعة وعلم الأعصاب وعلم الأورام وغيرها، سواء باستخدام خلايا الكائنات الحية البشرية أو النموذجية3. من خلال تسليط الضوء على الاختلافات بين الخلايا الفردية ، دفعت الخلية المفردة -omics إلى تعريف نموذج جديد لتكوين الدم ، يركز على عدم تجانس الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم (HSPCs) والابتعاد عن النموذج الكلاسيكي للسكان المتجانسين المنفصلين 4,5.
واحدة من العيوب القليلة لجميع تقنيات -omics هي تدمير الخلية ذات الاهتمام ، مما يحول دون إمكانية تقييم وظائفها. على العكس من ذلك ، توفر طرق الخلية الواحدة الأخرى ، مثل فحص زراعة الخلية الواحدة وتقنيات تتبع النسب ، قراءة لوظائف الخلية السلف من خلال تقييم مصير الخلايا الفردية في الجسم الحي 6,7. تتضمن تقنيات تتبع النسب تسمية الخلية ذات الأهمية بعلامة وراثية7 وراثية أو تسمية فلورية 8,9 ، مما يسمح بتتبع مصير خلايا مفردة متعددة في نفس الوقت. ومع ذلك ، فإن توصيف الخلايا الأولية يقتصر عادة على عدد محدود من المعلمات ، مثل التعبير عن عدد قليل من البروتينات السطحية التي تم تقييمها بواسطة قياس التدفق الخلوي10. بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب تقنيات تتبع النسب أحادية الخلية اكتشافا شاقا للملصق الخلوي ، عادة عن طريق تسلسل أو تصوير الحمض النووي / الحمض النووي الريبي. هذه النقطة الأخيرة على وجه الخصوص تحد من عدد الحالات التي يمكن اختبارها في تجربة واحدة.
فئة أخرى من الطرق المستخدمة لدراسة وظائف الخلايا المفردة هي أنظمة زراعة الخلايا خارج الجسم الحي ل HSPCs الفردية. سهلة الأداء ، تتضمن هذه المقايسات القياسية الذهبية فرز الخلايا الفردية إلى أوعية زراعة خلايا 96 بئرا ، وبعد المزرعة ، تميز النمط الظاهري لذرية الخلية ، عادة عن طريق قياس التدفق الخلوي أو التحليل المورفولوجي. تم استخدام هذه المقايسات في الغالب لتوصيف التمايز طويل المدى ل HSPCs إلى خلايا ناضجة ، عادة بعد 2-3 أسابيع من الثقافة11,12. بدلا من ذلك ، تم استخدامها لمحاولة الحفاظ على وتوسيع HSPCs خارج الجسم الحي 13،14،15،16،17،18 ، مع وعد بالفائدة الطبية لزراعة الخلايا الجذعية البشرية 19. أخيرا ، تم استخدامها لدراسة الالتزام المبكر ل HSPCs باستخدام الثقافةقصيرة المدى 20 ، مع انخفاض عدد الخلايا المتولدة في هذه الثقافة كونها العامل المحدد الرئيسي. أحد عيوب هذه الأنواع المختلفة من المقايسات خارج الجسم الحي هو أنها تعكس جزئيا فقط التعقيد في الجسم الحي. ومع ذلك ، فهي واحدة من الطرق النادرة لدراسة تمايز HSPC البشري.
إحدى المعلومات المفقودة من طرق الخلية الواحدة الحالية (أوميكس الخلية المفردة ، وتتبع النسب ، والثقافة خارج الجسم الحي) هي الكشف الدقيق عن انقسامات الخلايا ، وهي معلمة أساسية يجب مراعاتها عند دراسة ديناميكيات HSPC21. هناك طريقة بسيطة لتقييم عدد الانقسامات عبر قياس التدفق الخلوي وهي استخدام “أصباغ البروتين” القابلة للذوبان ، مثل 5- (و 6) – كربوكسي فلوريسئين ثنائي أسيتات سكسينيميديل إستر (CFSE) 22. تنتشر أصباغ الانقسام هذه داخل سيتوبلازم الخلايا الملطخة ، وتخفف بمقدار النصف وتنتقل إلى الخليتين البنيتين في كل انقسام خلوي ، مما يسمح بتعداد ما يصل إلى 10 أقسام. من خلال الجمع بين العديد من أصباغ التقسيم ، من الممكن زرع أسلاف فرديين متعددين في نفس البئر ، حيث تسمح كل صبغة فردية بفصل الأحفاد المختلفة. هذا هو المبدأ الكامن وراء استخدام أصباغ الخلايا لتتبع الإرسال النسيلي المتعدد والانقسام الذي تم تقديمه لأول مرة للخلايا الليمفاوية للفئران23,24.
هنا ، نقدم تطوير مقايسة MultiGen للاستخدام مع الفئران و HSPCs البشرية. يسمح باختبار العديد من الخلايا المفردة في وقت واحد لخصائصها في التمايز والانقسام والقرابة خارج الجسم الحي. يسمح هذا الفحص عالي الإنتاجية وسهل الأداء وغير المكلف بقياس النمط الظاهري الخلوي وعدد الانقسامات التي يتم إجراؤها وقرابة الخلية والعلاقة النسيلية مع الخلايا الأخرى في البئر ، كل ذلك في نفس الوقت. يمكن استخدامه لإجراء تقييم كمي لالتزام المصير المتماثل وغير المتماثل ، والتوازن بين التجديد الذاتي والتمايز ، وعدد التقسيمات اللازمة لمصير التزام معين. يتطلب البروتوكول فارز الخلايا المنشط بالتألق (FACS) ومقياس التدفق الخلوي مع قارئ لوحة ، بالإضافة إلى المعدات اللازمة لأداء زراعة الخلايا. بالإضافة إلى البروتوكول الفني لتنفيذ الفحص على HSPCs البشرية ، نقدم أيضا إطار التحليل التفصيلي ، بما في ذلك الاختبار الإحصائي اللازم لتقييم الخصائص الخلوية المتعلقة بمفهوم عائلة الخلية25. تم بالفعل استخدام هذا البروتوكول بنجاح لوصف حجرة الفئران HSPC26,27.
يستخدم البروتوكول التالي خلايا CD34 + المخصبة مغناطيسيا كمادة أولية28. بهذه الطريقة ، من الممكن تلطيخ وعزل HSPCs البشرية بكفاءة من مصادر الدم المختلفة (على سبيل المثال ، دم الحبل السري ونخاع العظام والدم المحيطي). من المهم عدم تجاهل جزء CD34 ، حيث سيتم استخدامه كجزء من البروتوكول لتعيين أنواع مختلفة من عناصر التحكم التجريبية. يمكن زيادة أو تقليل كميات وأحجام الخلايا المذكورة ، وفقا لسير العمل التجريبي والضروريات. وبالمثل ، يمكن تكييف البروتوكول لدراسة أنواع مختلفة من الأسلاف ، ببساطة عن طريق تعديل الأجسام المضادة المستخدمة في فرز الخلايا وخطوات قياس التدفق الخلوي.
Protocol
Representative Results
Discussion
مقايسة MultiGen هي مقايسة عالية الإنتاجية وسهلة الأداء وغير مكلفة ، وقد كان لها دور فعال في دراسة الخلايا الليمفاوية23،24،35 وخلايا المكونة للدم في الفئران26،27. هنا ، نقدم تطورا جديدا للنهج الذي يسمح بفك تشفير المرحلة المبكرة من التزام HSPC البشري خارج الجسم الحي ، على مستوى الخلية الواحدة باستخدام ثقافة قصيرة المدى (الشكل 6). عادة ما تستخدم أنظمة الاستزراع خارج الجسم الحي أحادية الخلية لتقييم مصير HSPCs على المدى الطويل في الخلايا الناضجة ، ولكن بعض المصائر تحدث في وقت أبكر من غيرها36 ، مما قد يؤدي إلى تحيز التحليل نحو مصائر أقل. بالإضافة إلى ذلك ، عادة ما تفتقد أنظمة الثقافة هذه معلومات حول الانقسامات أثناء الالتزام بالمصير. لقد ثبت أن خطوات الالتزام الأولى تحدث في وقت مبكر من بداية الثقافة ، وأحيانا بدون تقسيم26،37 ، مما يجعل الثقافة قصيرة المدى وتتبع التقسيم ضروريا لدراسة الالتزام المبكر بالمصير. من خلال اتباع المصير والانقسام والقرابة في وقت واحد ، يسمح هذا الفحص بفهم دور التقسيم الأول وقرار المصير في HSPCs البشرية. باستخدام الفحص ، من الممكن استنتاج عدد الانقسامات التي تحدث فيها عملية الالتزام ، والتوازن بين التجديد الذاتي والتمايز لأولئك الأسلاف الأوائل ، وكيف يتم توريث هذه الخصائص عبر الأجيال. على حد علمنا ، هذا هو الفحص الوحيد الذي يسمح بهذه الأنواع من القياسات ل HSPCs البشرية ، بدقة خلية واحدة. بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام مجموعات مختلفة من أصباغ انقسام الخلايا ، قمنا بزيادة إنتاجية التحليل ، مما يجعل هذا الفحص أداة قيمة لإنشاء مجموعات بيانات كبيرة بسرعة. تسمح مجموعات الصبغة بمتابعة العديد من العائلات في نفس الآبار ، مما يزيد من عدد الخلايا المتاحة للتحليل في الثقافة قصيرة الأجل. يمكن زيادة عدد التركيبات بشكل أكبر ، عن طريق إضافة أصباغ أخرى (على سبيل المثال ، صبغة صفراء) أو تعديل نسبة CFSE و CTV. ومع ذلك ، فإن هذا يقلل من عدد المعلمات الأخرى التي يمكن تحليلها.
الشكل 6: تمثيل تخطيطي للبروتوكول. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
لإجراء التحليل بنجاح ، نظرا للعدد الكبير من الآبار وانخفاض عدد الخلايا المراد تحليلها ، من الضروري إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي على محلل مزود بقارئ ألواح. يتم تكييف الجيل الجديد من أجهزة تحليل مقاعد البدلاء بشكل خاص مع هذا الفحص ، حيث أن معظمها يحتوي على حجم ميت أصغر لتقليل النسبة المئوية لفقدان الخلايا. وهذا بدوره يضمن كفاءة أعلى في استعادة كل بئر بالكامل ، مما يؤدي إلى كفاءة تقدر في نطاق 70٪26. يعد تقدير فقدان الخلية أثناء اكتساب قياس التدفق الخلوي أمرا بالغ الأهمية لتحليل كل عائلة على حدة. على سبيل المثال ، بافتراض عدم موت الخلايا وحساب عدد الأقسام ، من الممكن تقدير عدد الخلايا لكل عائلة. ومع ذلك ، من المستحسن إجراء بعض التجارب التأكيدية ، لا سيما في تقدير موت الخلايا في ظروف المزرعة المختبرة وقياس معدل الاسترداد تجريبيا باستخدام عدد محدد من الخلايا.
واحدة من الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول هي تعيين الذروة. كما ذكرنا سابقا ، يعتمد توزيع الذروة الجيد بشدة على عزل القمم الضيقة جدا عند فرز الخلايا. ومع ذلك ، لا يزال من الصعب تعيين العدد الصحيح من الأقسام بناء على التوزيع بشكل فريد. نظرا لإجراء فرز الخلايا وتحليل قياس التدفق الخلوي على جهازين مختلفين ، لا يمكن مقارنة شدة كل إشارة مباشرة ، لذلك قد يكون من الصعب معرفة ما إذا كانت القمة الأولى التي لوحظت في الطرف الأيمن من الرسم البياني هي الذروة 0 أو الذروة 1. في هذا الصدد ، هناك القليل من الحلول الممكنة. تتمثل إحدى الطرق في إجراء تجربة متعامدة لقياس عدد الانقسامات التي تقوم بها هذه الخلايا بدقة (على سبيل المثال ، تصوير الخلايا الحية). الاحتمال الآخر هو ببساطة حساب عدد الخلايا في البئر تحت مجهر برايت فيلد المقلوب ، قبل إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي. سيؤدي هذا إلى استنتاج متوسط عدد الانقسامات (بافتراض عدم موت الخلايا). أخيرا ، يتمثل الحل اللاحق لمهمة الذروة في اكتشاف عدد غير عادي من “العائلات المستحيلة” ؛ تتكون هذه العائلات من عدد أكبر من الممكن من الخلايا لكل جيل (على سبيل المثال ، خمس خلايا في الجيل 2 ، أو خليتين في الجيل 1 وخلية واحدة في الجيل 2). يتم ترميز إمكانية استبعاد العائلات المستحيلة في خطوة التحليل الإحصائي ، وتضع علامة على العائلة المستحيلة. إذا كان حدوث هذه الأخطاء مرتفعا جدا ، فمن المعقول افتراض أن تعيين الذروة يحتاج إلى مراجعة.
في هذا البروتوكول ، قمنا بتضمين بعض الأمثلة على تمثيل البيانات وتحليلها للفحص ، حيث أصبح هذا خطوة أساسية في توليد وتفسير مجموعات البيانات الكبيرة38. المثال الأول هو خريطة التمثيل اللوني التي توضح إجمالي جميع الخلايا التي تم تحليلها ، منظمة لكل عائلة. هذه أداة فعالة لاستكشاف الخصائص العامة للبيانات والاستنتاجات المحتملة: هل تتكون العائلات من أنواع متعددة من الخلايا أم أنها تميل إلى أن تكون متجانسة في التكوين؟ هل تنتشر العائلات على مدى أجيال متعددة ، أم أنها في الغالب تنقسم إلى نفس العدد من المرات؟ ويحتاج هذا التحليل الاستكشافي بعد ذلك إلى استكماله بمخططات واختبارات إحصائية أكثر تحديدا. يمكن استخدامه لتقييم الالتزام بالمصير المتماثل وغير المتماثل كميا ، والتمايز بدون تقسيم ، والتوازن بين التجديد الذاتي والتمايز ، وعدد الانقسامات لمصير التزام معين. من الأساسي ، أثناء التخطيط التجريبي ، ضبط طول مزرعة الخلية وفقا لنوع السؤال المطروح ؛ على سبيل المثال ، بالنسبة للسؤالين الأولين (التوازن المتماثل / غير المتماثل والتمايز بدون تقسيم) ، يسمح التخطيط لخطوات الثقافات القصيرة جدا بعزل عدد كبير من العائلات التي قامت بتقسيم واحد فقط أو لم تقم بأي تقسيم على الإطلاق26. على العكس من ذلك ، تسمح التجارب الأطول باستكشاف عدد الانقسامات المطلوبة لالتزام خلية معينة ، حيث إنها تأخذ عينات من العائلات في مراحل مختلفة من التمايز. ومع ذلك ، لم يتم تصميم هذه الطريقة للثقافات طويلة الأجل (2-3 أسابيع) ، حيث أن تخفيف صبغة الخلية غير قادر على تتبع أكثر من سبعة أو ثمانية أقسام بدقة22. نتيجة لذلك ، يتم تكييف هذه الأداة في الغالب لدراسة الالتزام المبكر للأسلاف المكونة للدم ، وهي ليست مصممة لتقديم استنتاجات قوية حول خصائص التمايز طويلة المدى لهذه الخلايا.
تم تطوير الإطار الإحصائي خصيصا لتحليل هذا النوع من البيانات واستنادا إلى مفهوم التباديل26. كان هذا ضروريا بسبب ملاحظة الاعتماد العائلي على توزيع نوع الخلية وعلى عدد الانقسامات التي تم إجراؤها. بعبارة أخرى، من المرجح أيضا أن تعرض الخلايا التي تنتمي إلى العائلة نفسها أنماطا ظاهرية متشابهة وتقسم العدد نفسه من المرات. في حين أن التحليل المتعمق خارج نطاق هذا العمل ، يجب أن تكون مجموعة الاختبارات الإحصائية المقدمة كافية عند تقييم الظروف المختلفة.
في الختام ، يشكل هذا البروتوكول أداة قيمة لتقييم الديناميات الخلوية للخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم خارج الجسم الحي ، بطريقة سريعة وغير مكلفة. نظرا لمرونته وتعدد استخداماته فيما يتعلق بالنقطة الزمنية وظروف الثقافة ونوع HSPCs التي تم تحليلها ، فإنه يسمح باختبار مجموعة متنوعة من الظروف التجريبية. كاختبار قائم على قياس التدفق الخلوي ، يمكن تنفيذه في معظم المختبرات ، ولا يتطلب معرفة مسبقة واسعة النطاق ، مما يجعله مرشحا جيدا للفحوصات والتجارب التجريبية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر أعضاء مرفق تدفق كوري التابع لمعهد كوري على مساعدتهم في إعداد تجارب قياس التدفق الخلوي. ونود أيضا أن نعرب عن تقديرنا لمساهمات الأعضاء الآخرين في فريق بيرييه، خلال مناقشات متعددة. نشكر الدكتورة جوليا مارشينغو والبروفيسور هودجكين (معهد والتر إند إليزا هول للبحوث الطبية) على مشاركة بروتوكولهما الخاص بتعدد إرسال أصباغ انقسام الخلايا على الخلايا الليمفاوية. نشكر البنك الحيوي لدم الحبل السري في مستشفى سانت لويس على توفير الموارد البيولوجية اللازمة لتطوير هذا البروتوكول. تم دعم الدراسة بمنحة ATIP-Avenir من CNRS ومؤسسة Bettencourt-Schueller (إلى L.P.) ، ومنح من Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) (إلى L.P. و A.D.) ، وبرنامج Idex Paris-Science-Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL) (إلى L.P.) ، وظهور Canceropole INCA (2021-1-EMERG-54b-ICR-1 ، إلى L.P.) ، ومنحة ITMO MIIC (21CM044 ، إلى L.P.). بالإضافة إلى التمويل من مجلس البحوث الأوروبي (ERC) في إطار برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي ERC StG 758170-Microbar (إلى LP) ، تم دعم AD بزمالة من Fondation de France.
Materials
| 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes | vWR | 87003-294 | |
| 15-mL polypropylene tubes | vWR | 734-0451 | |
| 50-mL polypropylene tubes | vWR | 734-0448 | |
| 96-well U-bottom culture plate | Falcon | 353077 | |
| Anti-human Lin APC | Thermo Fisher | 22-7776-72 | Dilution 1/40 |
| ARIA III | BD | Can be replaced with any FACS sorter able to sort individual cells in 96-wells plate | |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Life Technologies | C34570 | |
| Cell Trace Violet (CTV) | Life Technologies | C34571 | |
| Compensation beads | BD | 552843 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Life Technologies | 11320033 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Thermo Scientific | J62948-36 | Prepare a solution 0.5 M, in sterilised water |
| FC block Fc1.3216 | BD | 564220 | Dilution 1/50 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Dutscher | S1900-500C | Batch S00CH |
| FlowJo v10.8.1 | BD | ||
| Mouse anti-human CD10 PerCP-5.5, clone HI10a | Biolegend | 312216 | Dilution 1/20 |
| Mouse anti-human CD123 BUV395, clone 7G3 | BD | 564195 | Dilution 1/15 |
| Mouse anti-human CD34 APC-Cy7, clone 581 | Biolegend | 343513 | Dilution 1/40 |
| Mouse anti-human CD38 BV650, clone HB7 | Biolegend | 356620 | Dilution 1/40 |
| Mouse anti-human CD45RA AF700, clone HI100 | BD | 560673 | Dilution 1/20 |
| Mouse anti-human CD45RA PE-Cy7, clone HI100 | BD | 560675 | Dilution 1/20 |
| Mouse anti-human CD90 PE, clone 5E10 | Biolegend | 328110 | Dilution 1/20 |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X | Life Technologies | 10010001 | |
| Python | |||
| R | |||
| Sterile 12×75 mm conical polypropylene tubes | Falcon | ||
| ZE5 | Biorad | Can be replaced with any flow cytometry analyzer equipped with a plate reader | |
| Laboratory prepared | |||
| Cell culture media | Depends from the specific experiment. Prepare fresh daily and store at +4 °C until use | ||
| DMEM + 10% FBS | Can be stored in sterile conditions, at +4 °C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 50 mL of FBS to 450 mL DMEM | ||
| PBS 1X + EDTA 0.1% | Can be stored in sterile conditions, at room temperature, up to 1 year. To prepare 500 mL, add 3.42 mL of EDTA 0.5 M to 500 mL PBS 1X | ||
| Staining buffer | Can be stored in sterile conditions, at +4 °C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 2 mL of EDTA 0.5 M and 1 mL FBS to 500 mL PBS 1X |
References
- Ginhoux, F., Yalin, A., Dutertre, C. A., Amit, I. Single-cell immunology: Past, present, and future. Immunity. 55 (3), 393-404 (2022).
- Ke, M., Elshenawy, B., Sheldon, H., Arora, A., Buffa, F. M. Single cell RNA-sequencing: A powerful yet still challenging technology to study cellular heterogeneity. Bioessays. 44 (11), 2200084 (2022).
- Regev, A., et al. The human cell atlas. Elife. 6, 27041 (2017).
- Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity. Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).
- Loughran, S. J., Haas, S., Wilkinson, A. C., Klein, A. M., Brand, M. Lineage commitment of hematopoietic stem cells and progenitors: insights from recent single cell and lineage tracing technologies. Experimental Hematology. 88, 1-6 (2020).
- Perié, L., Duffy, K. R. Retracing the in vivo haematopoietic tree using single-cell methods. FEBS Letters. 590 (22), 4068-4083 (2016).
- Yu, V. W. C., et al. Epigenetic memory underlies cell-autonomous heterogeneous behavior of hematopoietic stem cells. Cell. 167 (5), 1310-1322 (2016).
- Ganuza, M., et al. Lifelong haematopoiesis is established by hundreds of precursors throughout mammalian ontogeny. Nature Cell Biology. 19 (10), 1153-1163 (2017).
- Naik, S. H., Schumacher, T. N., Perié, L. Cellular barcoding: A technical appraisal. Experimental Hematology. 42 (8), 598-608 (2014).
- Quek, L., et al. Genetically distinct leukemic stem cells in human CD34 − acute myeloid leukemia are arrested at a hemopoietic precursor-like stage. The Journal of Experimental Medicine. 213 (8), 1513-1535 (2016).
- Karamitros, D., et al. Single-cell analysis reveals the continuum of human lympho-myeloid progenitor cells. Nature Immunology. 19 (1), 85-97 (2018).
- Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
- Delaney, C., et al. Notch-mediated expansion of human cord blood progenitor cells capable of rapid myeloid reconstitution. Nature Medicine. 16 (2), 232-236 (2010).
- Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
- Guo, B., Huang, X., Lee, M. R., Lee, S. A., Broxmeyer, H. E. Antagonism of PPAR-γ 3 signaling expands human hematopoietic stem and progenitor cells by enhancing glycolysis. Nature Medicine. 24 (3), 360-367 (2018).
- Vannini, N., et al. The NAD-booster nicotinamide riboside potently stimulates hematopoiesis through increased mitochondrial clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).
- Gupta, R., et al. Nov/CCN3 enhances cord blood engraftment by rapidly recruiting latent human stem cell activity. Cell Stem Cell. 26 (4), 527-541 (2020).
- Horwitz, M. E., et al. Omidubicel vs standard myeloablative umbilical cord blood transplantation: results of a phase 3 randomized study. Blood. 138 (16), 1429-1440 (2021).
- Weinreb, C., Rodriguez-Fraticelli, A., Camargo, F. D., Klein, A. M. Lineage tracing on transcriptional landscapes links state to fate during differentiation. Science. 367 (6479), 3381 (2020).
- Loeffler, D., Schroeder, T. Understanding cell fate control by continuous single-cell quantification. Blood. 133 (13), 1406-1414 (2019).
- Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. Journal of Visualized Experiments. (70), e4287 (2012).
- Marchingo, J. M., et al. T-cell stimuli independently sum to regulate an inherited clonal division fate. Nature Communications. 7, 13540 (2016).
- Horton, M. B., et al. Multiplexed division tracking dyes for proliferation-based clonal lineage tracing. Journal of Immunology. 201 (3), 1097-1103 (2018).
- Lehmann, E. L., Romano, J. P., Casella, G. . Testing statistical hypotheses. , 784 (2005).
- Tak, T., et al. HSPCs display within-family homogeneity in differentiation and proliferation despite population heterogeneity. Elife. 10, 360624 (2021).
- Sommerkamp, P., et al. Mouse multipotent progenitor 5 cells are located at the interphase between hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 137 (23), 3218-3224 (2021).
- Kato, K., Radbruch, A. Isolation and characterization of CD34+ hematopoietic stem cells from human peripheral blood by high-gradient magnetic cell sorting. Cytometry. 14 (4), 384-392 (1993).
- Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11 (2), 231-238 (1990).
- Doulatov, S., et al. Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development. Nature Immunology. 11 (7), 585-593 (2010).
- Goardon, N., et al. Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).
- Laurenti, E., et al. CDK6 levels regulate quiescence exit in human hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 16 (3), 302-313 (2015).
- Aiuti, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
- Davison, A. C., Hinkley, D. V. . Bootstrap Methods and their Application. , (1997).
- Horton, M. B., et al. Lineage tracing reveals B cell antibody class switching is stochastic, cell-autonomous, and tuneable. Immunity. 55 (10), 1843-1855 (2022).
- Notta, F., et al. Distinct routes of lineage development reshape the human blood hierarchy across ontogeny. Science. 351 (6269), 2116 (2016).
- Grinenko, T., et al. Hematopoietic stem cells can differentiate into restricted myeloid progenitors before cell division in mice. Nature Communications. 9 (1), 1898 (2018).
- Saeys, Y., Van Gassen, S., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: Helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nature Reviews Immunology. 16 (7), 449-462 (2016).
