Functionele karakterisering en visualisatie van slokdarmfibroblasten met behulp van organoïde coculturen

Dierproeven voor deze studie werden goedgekeurd door Stockholms Norra djurförsöksetiska nämnd (ethische vergunning nr. 14051-2019). Dieren werden gehuisvest in pathogeenvrije omstandigheden volgens de aanbevelingen van de Federation of European Laboratory Animal Science Association. 1. Voorbereiding Ontdooi de enzymatische stamoplossingen die worden gebruikt voor dissociatie (zie materiaaltabel) op ijs. Ontdooi een aliquot van groeifactor gereduceerde (GFR) keldermembraanmatrix (matrix) bij 4 °C. Bereid het kweekmedium voor. Gebruik het in tabel 1 beschreven medium voor organoïde culturen en coculturen en bereid het voor voordat u met het protocol begint. 2. Dissectie en scheiding van het slokdarmepitheel en stroma OPMERKING: Zorg ervoor dat alle instrumenten die worden gebruikt voor dissectie en weefselverwerking steriel zijn. Bereid 2 ml dissociatieoplossing (zie materiaaltabel) in Hanks’ gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) per drie slokdarms. Gebruik een muizenstam naar keuze, zoals C57BL/6J-muizen. De ontwikkeling van de slokdarm bij muizen eindigt na postnatale dag (p) 70, dus het wordt aanbevolen om muizen te gebruiken die ouder zijn dan p7013. Gebruik vier of vijf muizen omdat ze voldoende materiaal leveren om 8-10 organoïde coculturen tot stand te brengen.OPMERKING: De organoïdevormende efficiëntie neemt af met de leeftijd van de muizen. Als specifieke fibroblastsubpopulaties van belang zijn, is het mogelijk dat de lage fibroblastopbrengst het aantal organoïde coculturen beperkt dat kan worden vastgesteld. Gebruik genetisch gemodificeerde (bijv. PdgfrαH2BeGFP) of wild-type (WT) muizen voor de isolatie van fibroblastpopulaties. Wanneer u WT-muizen gebruikt, voert u antilichaamkleuring uit om specifieke fibroblastsubpopulaties via FACS uit het stroma te isoleren. Euthanaseer de muizen door CO 2-verstikking. Ontleed de slokdarm met een tang en een dissectieschaar. Om de hele slokdarm te verwijderen, snijdt u het distale uiteinde van de slokdarm direct boven de maag en het proximale uiteinde aan het begin van de luchtpijp. Dompel de slokdarm onder in PBS en leg hem op ijs. Verwijder de muscularis externa mechanisch met behulp van een dissectiemicroscoop (totaal vergrotingsbereik van 8x-40x) en een tang. Houd het distale uiteinde van de ontlede slokdarm vast met behulp van een tang en gebruik de andere tang om de spier van het distale naar het proximale uiteinde van de ontlede slokdarm te grijpen en te trekken. Verwijder en gooi de spierlaag weg. Open de slokdarm in de lengterichting. Dit werkt het beste met behulp van een microdissectie veerschaar met een balpunt om weefselschade te voorkomen. Houd het ene uiteinde van de slokdarm vast om de bal van de veerschaar in het lumen van de slokdarm te steken en knip de slokdarm open terwijl u het uiteinde vasthoudt. Plaats de slokdarm in een microcentrifugebuis van 1,5 ml of een plaat met 24 putten. Incubeer de geopende slokdarm in 0,5 mg/ml thermolysine in HBSS bij 37 °C op een rocker-shaker gedurende 15 minuten. Dompel de slokdarm volledig onder in thermolysine-oplossing.OPMERKING: Het volume van de gebruikte thermolysine-oplossing is afhankelijk van de put- of buisgrootte. Verschillende slokdarmen kunnen worden geplaatst en ondergedompeld in dezelfde put of buis. Haal de slokdarm uit de thermolysine-oplossing. Gebruik een dissectiemicroscoop om het slokdarmepitheel zorgvuldig van het stroma te scheiden. Pak met een fijne tang zowel de epitheelzijde als de stromazijde van het weefsel vast en trek ze langzaam uit elkaar om de twee lagen te scheiden.OPMERKING: Het stroma is te herkennen aan zijn witte en ondoorzichtige uiterlijk, in tegenstelling tot het transparante epitheel. Het stroma bevat de lamina propria en submucosale laag. Breng de epitheliale en stromale laag over in twee afzonderlijke microcentrifugebuizen van 1,5 ml met 200 μL dissociatieoplossing in HBSS. Op ijs gezet. 3. Isolatie van slokdarmvoorlopercellen OPMERKING: De isolatie van slokdarmvoorlopercellen (stap 2) en fibroblasten (stap 3) kan tegelijkertijd worden uitgevoerd. Bereid een tube van 50 ml van 1% FBS in HBSS (1% FBS). Breng het gescheiden slokdarmepitheel van de 1,5 ml microcentrifugebuis (stap 2.8) over in een schone petrischaal en gebruik een scherp scalpel om te hakken. Verzamel het gehakte weefsel uit de petrischaal met 200 μL dissociatieoplossing en breng het terug naar de 1,5 ml microcentrifugebuis.OPMERKING: Het epitheel wordt goed gehakt wanneer de stukjes terug in de 1,5 ml microcentrifugebuis kunnen worden geplaatst met behulp van een pipetpunt van 200 μL. Voeg 800 μL verse dissociatieoplossing toe aan de microcentrifugebuis van 1,5 ml tot een totaal volume van 1 ml.OPMERKING: Het is belangrijk om een voldoende volume dissociatie-oplossing toe te voegen. Per één tot drie slokdarmen wordt 1 ml oplossing aanbevolen. Schaal op wanneer er meer slokdarm tegelijk wordt verwerkt. Plaats de buis met de gehakte epitheellaag gedurende 60 minuten op een rocker-shaker bij 37 °C. Pipetteer de oplossing ongeveer 20 keer op en neer met een pipetpunt van 200 μL om de 15 minuten om de spijsvertering te verbeteren. Na 60 minuten pipet u nog eens 20 keer op en neer met een pipetpunt van 200 μL. Laat de oplossing door een celzeef van 40 μm in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml lopen. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.OPMERKING: Maak de celzeef nat met 1% FBS voordat u de cellen zeeft om de hechting van de cellen aan het filter te minimaliseren. Het epitheel zal niet volledig worden verteerd en stukjes weefsel zullen nog steeds zichtbaar zijn. Langere incubatie zal echter de celoverleving verminderen en niet resulteren in een hogere opbrengst van levensvatbare cellen. Gooi het supernatant weg door overtollige vloeistof te verwijderen met een pipet van 1 ml en resuspensie van de pellet in 1 ml 1% FBS. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.Bereid tijdens het centrifugeren het geconjugeerde antilichaammengsel voor op FACS van slokdarmvoorlopercellen. Meng 1 μL CD324-PE-Cy7 (ECADHERIN) en CD104-A647 (INTEGRIN-β4) in 200 μL van 1% FBS per miljoen cellen.OPMERKING: 1 μL antilichaam (200 μL eindvolume) is voldoende voor één of twee slokdarmen. Wanneer u meer slokdarm tegelijk verwerkt, verhoogt u het volume van de antilichaamkleuringsoplossing. Resuspendie van de pellet in 200 μL antilichaammengsel en overbrenging naar een flowcytometriebuis. Na het toevoegen van fluorescerende antilichamen, houdt u de celsuspensies in het donker om bleken van het signaal te voorkomen. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 4 °C. Voeg 3 ml 1% FBS toe en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 300 x g en resuspensie de cellen vervolgens in minimaal 200 μl of 1% FBS.OPMERKING: 500 μL 1% FBS wordt gebruikt voor maximaal vier of vijf slokdarms. Verhoog het volume wanneer meer slokdarm tegelijk wordt verwerkt, zodat een FACS-stroomsnelheid van 100-300 gebeurtenissen (s) kan worden bereikt. Meer gebeurtenissen zullen de sorteerefficiëntie verminderen en een toename van de stroomsnelheid zal de celoverleving verminderen. Voeg dode cel kleurmarker toe tot een uiteindelijke concentratie van 1:10.000, 5 minuten voorafgaand aan FACS-sortering om levende cellen te isoleren. Sorteer de voorlopercellen met behulp van een FACS-machine (zie figuur 1 voor gatingstrategie). Verzamel de cellen in microcentrifugebuizen van 1,5 ml gevuld met 200 μl basisch organoïde medium (tabel 1). 4. Isolatie van fibroblasten uit de stromale laag Knip de stomale laag in fijne stukjes in een buis van 1,5 ml met 200 μL dissociatieoplossing (stap 2.8) met behulp van een dissectieschaar. Het weefsel wordt goed gehakt zodra de oplossing op en neer kan worden gepipetteerd met behulp van een pipetpunt van 200 μL. Voeg 800 μL verse dissociatieoplossing toe aan de microcentrifugebuis van 1,5 ml tot een totaal volume van 1 ml.OPMERKING: Het is belangrijk om een voldoende volume dissociatie-oplossing toe te voegen. Per één tot drie slokdarmen wordt 1 ml oplossing aanbevolen. Schaal op wanneer er meer slokdarm tegelijk wordt verwerkt. Plaats de buis gedurende 30 minuten op een rocker-shaker bij 37 °C. Na 15 minuten pipet u de oplossing ongeveer 20 keer op en neer met behulp van een pipetpunt van 200 μL om de spijsvertering te verbeteren. Na 30 minuten enzymatische vertering, pipet u nog eens 20 keer op en neer met behulp van een pipetpunt van 200 μL. Zeef de oplossing door een 70 μm celzeef in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.OPMERKING: Maak de celzeef nat met 1% FBS voordat u de cellen zeeft om de hechting van cellen aan het filter te minimaliseren. Gooi het supernatant weg door overtollige vloeistof te verwijderen met een pipet van 1 ml en resuspensie van de pellet in 1 ml 1% FBS. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.OPMERKING: Bij gebruik van een genetisch gemodificeerde muizenstam die flourescent-gelabelde fibroblasten bevat, zijn antilichaamkleuringen optioneel. Als antilichaamkleuringen niet nodig zijn, ga dan verder met stap 3.7 en breng het monster over naar een flowcytometriebuis.Bereid tijdens het centrifugeren het geconjugeerde antilichaammengsel voor op de FACS-isolatie van fibroblasten. Meng 1 μL CD26-APC (DPP4) in 200 μL van 1% FBS per miljoen cellen.OPMERKING: 1 μL antilichaam is voldoende voor een of twee slokdarms. Wanneer u meer slokdarm tegelijk verwerkt, verhoogt u het volume van de antilichaamkleuringsoplossing. Resuspendeer de pellet in 200 μL geconjugeerd antilichaammengsel in 1% FBS en breng het over naar een flowcytometriebuis. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 4 °C. Voeg 3 ml 1% FBS toe en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 °C op 300 x g . Resuspendeer de cellen in minimaal 200 μL of 1% FBS.OPMERKING: 500 μL 1% FBS wordt gebruikt voor maximaal vier of vijf slokdarms. Verhoog het volume wanneer meer slokdarm tegelijk wordt verwerkt, zodat een stroomsnelheid van 100-300 gebeurtenissen / s kan worden bereikt. Meer gebeurtenissen zullen de sorteerefficiëntie verminderen en het verhogen van de stroomsnelheid zal de celoverleving verminderen. Na het toevoegen van fluorescerende antilichamen moeten celsuspensies donker worden gehouden om bleken van het signaal te voorkomen. Voeg dode cel kleurmarker toe tot een uiteindelijke concentratie van 1:10.000, 5 minuten voorafgaand aan FACS-sortering om levende cellen te isoleren. Sorteer de cellen met behulp van een FACS-machine (zie figuur 1 voor gating-strategie). Verzamel de cellen in microcentrifugebuizen van 1,5 ml gevuld met 200 μl basisch organoïde medium (tabel 1). 5. Oprichting en cultuur van slokdarmorganoïden OPMERKING: Prewarm ERlow (organoïde co-cultuur), ENR (organoïde) medium (zie tabel 1 voor beschrijving) en een 48-well plaat bij 37 °C. Leg de ontdooide matrix (bereid in stap 1) aliquot op ijs. Het wordt aanbevolen om de matrix hier te gebruiken (zie tabel met materialen) voor de slokdarm organoïdecultuur van muizen, omdat andere merken matrix de efficiëntie van organoïdevorming negatief beïnvloeden. Voor de organoïde co-cultuur, meng de gesorteerde epitheelcellen en fibroblasten in een verhouding van 1: 2 in een buis. Gebruik voor elke matrixkoepel 5.000 epitheelcellen en 10.000 fibroblasten. Voeg bij de voorbereiding op meer koepels een veelvoud van 5.000 epitheelcellen en 10.000 fibroblasten toe aan één buis. Gebruik voor organoïde culturen zonder fibroblasten 5.000 epitheelcellen per matrixkoepel. Centrifugeer de gemengde celpopulatie op 300 x g gedurende 5 minuten. Gooi het supernatant weg door het voorzichtig te verwijderen met een pipet van 200 μL. Was de cellen eenmaal door de pellet opnieuw te suspenderen in koud basisch organoïde medium en centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 x g . Plaats de cellen op ijs. Bereid een mix bestaande uit 80% matrix en 20% koud basisch organoïde medium. Plaats alles op ijs terwijl de matrix stolt bij kamertemperatuur (RT). Gooi het supernatant na centrifugeren weg door het voorzichtig te verwijderen met een pipet van 200 μL. Resuspendeer de cellen in 10 μL matrixmix/koepel en zet ze terug op ijs. Neem de voorverwarmde 48-putplaat uit de 37 °C incubator en maak één matrixkoepel per put met behulp van een pipet van 20 μL. Elke koepel bevat 10 μL van 80% matrix, 5.000 epitheelcellen en 10.000 fibroblasten. Breng de plaat ondersteboven over naar een incubator en laat de koepels nog 20-30 minuten stollen bij 37 °C.OPMERKING: Een afname van het matrixkoepelvolume en/of een toename van het celaantal heeft invloed op de efficiëntie van de organoïdevorming. Voeg 200 μl voorverwarmd ERlaag medium (tabel 1) toe aan de matrixkoepels met organoïde coculturen en ENR-medium (tabel 1) aan de respectieve matrixkoepels die alleen epitheelorganoïden bevatten en plaats de plaat in de incubator. Kweek de organoïden bij 37 °C en 5% CO2. Vul het medium de eerste 2 dagen aan met 10 μM Rock-remmer (Y-27623). Rotsremmer voorkomt stress-geïnduceerde celdood en verhoogt de kans op een succesvolle vestiging van organoïde culturen. Ververs het medium elke 2-3 dagen. Zorg ervoor dat het medium warm is om de dissociatie van de temperatuurgevoelige matrix te voorkomen. Voer analyses van het experiment uit 6 tot 8 dagen na het plateren. De organoïden kunnen tot 14 dagen in cultuur worden gehouden. Rond dag 14 wordt verlies van koepelintegriteit waargenomen. 6. Doorgeven van organoïden OPMERKING: Het passeren van organoïden gekweekt in co-cultuur resulteert in het verlies van fibroblasten. Daarom wordt aanbevolen om ENR-medium te gebruiken voor alle organoïden wanneer ze worden gepasseerd. Voorwarme ENR, PBS en een plaat met 48 putten bij 37 °C. Verwijder het medium en was de put met de matrixkoepel met voorverwarmde PBS. Voeg 200 μL koude 0,25% trypsine-oplossing toe en pipetteer op en neer om de matrixkoepel te breken.OPMERKING: Het gebruik van koude 0,25% trypsine wordt aanbevolen, omdat de matrix temperatuurgevoelig is en dit helpt bij het afbreken van de matrixkoepels. Incubeer de organoïden met trypsine bij 37 °C gedurende ~20 min. Pipetteer op en neer na 10 minuten om de dissociatie van de organoïden te vergroten. Controleer het dissociatieproces elke 5-10 minuten met een microscoop. Aangezien trypsine de levensvatbaarheid van cellen vermindert, kan dit helpen om de ideale dissociatietijd te identificeren. Na 20 minuten pipet u de organoïden op en neer met een pipet van 200 μL om de organoïden te dissociëren. Verzamel de cellen in een microcentrifugebuis van 1,5 ml, voeg 1 ml basisch organoïde medium toe en centrifugeer gedurende 5 minuten bij RT op 300 x g . Optioneel: Om de beste organoïde groeiomstandigheden te garanderen en dat nieuwe organoïden zijn afgeleid van afzonderlijke cellen, zeeft u de cellen door een vooraf bevochtigde celzeef van 40 μm. Het filteren van de celsuspensie resulteert in het verwijderen van organoïde kernen en celklonten die moeilijk te dissociëren zijn. Maak een matrixmix bestaande uit 80% matrix en 20% koud basisch organoïde medium. Zet alles op ijs, want de matrix stolt bij RT. Gooi het supernatant weg door het voorzichtig te verwijderen met een pipet van 200 μL, resuspensie van de cellen in 10 μL matrixmix/koepel en leg het mengsel terug op ijs.OPMERKING: Organoïden kunnen worden gesplitst in een verhouding van 1:5 tot 1:10, afhankelijk van de koepeldichtheid. Epitheelcellen kunnen ook worden geteld en opnieuw worden geplateerd op 5.000 cellen / koepel. Neem de voorverwarmde 48-well plaat uit de 37 °C incubator en maak één koepel per put. Breng de plaat ondersteboven over naar een incubator en laat de koepels nog 20-30 minuten stollen bij 37 °C. Voeg 200 μL voorverwarmd ENR-medium toe aan de respectievelijke organoïde koepels. Vul het medium de eerste 2 dagen aan met 10 μM Rock-remmer (Y-27623). Ververs het medium elke 2-3 dagen. Zorg ervoor dat het medium warm is om dissociatie van de temperatuurgevoelige matrix te voorkomen. 7. Organoïde verwerking voor hele mount kleuring OPMERKING: Bedek de uiteinden en buizen voor gebruik met 10% FBS in PBS om te voorkomen dat organoïden zich aan kunststoffen hechten. Voor pipetpunten volstaat het om een of twee keer op en neer te pipetten in een 10% FBS/PBS-oplossing voordat u de punt gebruikt. Voor buizen, vul de buis met 10% FBS / PBS en verwijder vervolgens de oplossing. Verwijder het organoïde medium en voeg 200 μL ijskoud PBS toe aan de matrixkoepels. Leg de plaat 5-10 minuten op ijs. Pipetteer op en neer en breng de oplossing over in 0,6 ml microcentrifuge niet-hechtende buizen. Centrifugeer kort gedurende 30-60 s op 100 x g om de organoïden in de bodem te laten bezinken.OPMERKING: Overtollig pipetteren en lange centrifugatie breekt de organoïden en verstoort de fibroblast-organoïde interactie. Verwijder overtollige vloeistof en voeg ijskoude PBS toe. Centrifugeer kort gedurende 30-60 s op 100 x g om de organoïden in de bodem te laten bezinken. Verwijder overtollige vloeistof en fixeer de organoïde met 200 μL koude 4% formaldehyde in PBS-oplossing gedurende 30 minuten op ijs.LET OP: Formaldehyde is giftig en moet altijd worden gebruikt in een chemische zuurkast. Nitrilhandschoenen, veiligheidsbrillen en laboratoriumjassen moeten altijd worden gedragen. Fixatie van de organoïde zorgt ervoor dat ze zinken en centrifugeren is niet meer nodig. Laat de organoïden zinken door de buis rechtop te plaatsen en wacht 2-3 minuten, verwijder de formaldehyde en voeg 500 μL koude PBS toe om de formaldehyde weg te spoelen. Laat de organoïden zinken, verwijder de overtollige PBS en voeg 500 μL verse koude PBS toe. Laat de organoïden zinken, verwijder de overtollige PBS en voeg 500 μL blokkeringsbuffer toe (5% normaal ezelserum, 1% BSA en 0,5% Triton X-100 in PBS). Zet de buis op een rocker-shaker gedurende 60 minuten bij RT.OPMERKING: Blokkeren kan ook ‘s nachts (O/N) bij 4 °C. Laat de organoïden zinken, verwijder de blokkerende buffer en resuspensie van de organoïden in 200 μL blokkeringsbuffer met primaire antilichamen (zie tabel met materialen). Bewaar de organoïden op een rocker-shaker O/N bij 4 °C.OPMERKING: Om de kleuring van nucleaire eiwitten, laag tot expressie gebrachte eiwitten of antilichamen die niet-specifieke kleuring vertonen te verbeteren, kan de incubatietijd gedurende 1 of 2 dagen bij 4 °C worden verlengd. Het plaatsen van de organoïden op een rocker-shaker is essentieel omdat het voorkomt dat organoïden samenklonteren en de kleuringsefficiëntie verhoogt. Laat de organoïden zinken, verwijder de primaire antilichaammix en was de organoïden met 500 μL van 0,02% Triton X-100 in PBS (0,02% Tx) gedurende 60 minuten bij RT. Herhaal drie keer.OPMERKING: Wanneer langere primaire antilichaamincubatie nodig is, voeg dan een wasstap toe met 0,02% Tx in PBS O/N bij 4 °C. Laat de organoïden zinken, verwijder de wasbuffer en voeg 200 μL fluorescentie-geconjugeerd secundair antilichaam toe in blokkerende buffer O/N bij 4 °C. Na het toevoegen van fluorescerende secundaire antilichamen, houdt u de organoïden in het donker om bleken van het signaal te voorkomen. Laat de organoïden zinken, verwijder de secundaire antilichaammix en was de organoïden met 500 μL van 0,02% Tx gedurende 60 minuten bij RT. Herhaal dit drie keer. Contrakleuring van de organoïden met 200 μL DAPI (0,25 μg/ml) oplossing voor nucleaire kleuring indien nodig. Incubeer de monsters gedurende 60 minuten bij RT op een rocker-shaker. Laat de organoïden zinken, verwijder de DAPI-oplossing en was de organoïden in 500 μL PBS gedurende 15 minuten bij RT. Herhaal dit drie keer. Laat de organoïden zinken en verwijder alle overtollige vloeistof. Voeg 10 μL klaringsoplossing toe aan de organoïden en incubeer gedurende 15 minuten bij RT.OPMERKING: De opruimoplossing is viskeus, dus snijd het buitenste deel van een pipetpunt van 20 μL af voordat u de opruimoplossing pipetteert. Er kan meer opruimoplossing worden toegevoegd als een grotere afstandhouder wordt gebruikt voor beeldvorming. Montage-oplossing kan worden gebruikt in plaats van de opruimoplossing wanneer de organoïden niet worden verwijderd. De clearing-oplossing vermindert de achtergrond bij het maken van afbeeldingen en vergroot de beelddiepte. Plaats een 0,05 mm dubbelzijdige kleverige 4-well afstandhouder op een microscoopglaasje. Voeg de 10 μL opruimoplossing met de organoïden in één put toe en plaats een afdekstrook bovenop de afstandhouder.OPMERKING: Organoïden kunnen ook worden gemonteerd zonder het gebruik van een afstandhouder. De afstandhouder houdt de organoïde vorm intact en voorkomt dat de organoïden worden afgeplat. Houd de dia op RT O/N om de organoïden te verwijderen. Voor langdurige opslag houdt u de dia’s op 4 °C. Verkrijg beelden met behulp van een confocaal microscopiesysteem.