JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
神经科学

Translasyonel ağrı araştırması için açık kaynaklı gerçek zamanlı kapalı döngü elektrik eşiği izleme

Published: April 21, 2023
doi:
10.3791/64898
, , , , , , ,
1Anaesthesia, Pain, and Critical Care Sciences, School of Physiology, Pharmacology, & Neuroscience,University of Bristol, 2Eli Lilly and Company, 3Department of Computer Science,University of Bristol, 4Department of Aerospace Engineering,University of Bristol, 5Research Computing,University of Bristol

Summary

APTrack, gerçek zamanlı veri görselleştirme ve nöronal aksiyon potansiyellerinin kapalı döngü elektriksel eşik takibini sağlayan Open Ephys platformu için geliştirilmiş bir yazılım eklentisidir. Bunu mikronörografide insan C-fiber nosiseptörleri ve fare C-fiber ve Aδ-fiber nosiseptörleri için başarıyla kullandık.

Abstract

Nosiseptörler, potansiyel olarak zararlı zararlı uyaranları işaret eden birincil afferent nöronların bir sınıfıdır. Nosiseptör uyarılabilirliğinde bir artış, akut ve kronik ağrı koşullarında meydana gelir. Bu, anormal devam eden aktivite üretir veya zararlı uyaranlara aktivasyon eşiklerini azaltır. Bu artmış uyarılabilirliğin nedeninin belirlenmesi, mekanizma bazlı tedavilerin geliştirilmesi ve doğrulanması için gereklidir. Tek nöronlu elektriksel eşik izleme, nosiseptör uyarılabilirliğini ölçebilir. Bu nedenle, bu tür ölçümlere izin vermek ve insanlarda ve kemirgenlerde kullanımını göstermek için bir uygulama geliştirdik. APTrack, zamansal raster grafiği kullanarak gerçek zamanlı veri görselleştirme ve eylem potansiyeli tanımlama sağlar. Algoritmalar, eşik geçişi yoluyla aksiyon potansiyellerini tespit eder ve elektriksel stimülasyondan sonra gecikmelerini izler. Eklenti daha sonra nosiseptörlerin elektriksel eşiğini tahmin etmek için yukarı-aşağı bir yöntem kullanarak elektriksel stimülasyon genliğini modüle eder. Yazılım, Open Ephys sistemi (V0.54) üzerine inşa edilmiş ve JUCE çerçevesi kullanılarak C ++ ile kodlanmıştır. Windows, Linux ve Mac işletim sistemlerinde çalışır. Açık kaynak kodu mevcuttur (https://github.com/ Microneurography/APTrack). Elektrofizyolojik kayıtlar, hem safen sinirde alay edilen lif yöntemi kullanılarak bir fare derisi-sinir preparatında hem de yüzeysel peroneal sinirde mikronörografi kullanan sağlıklı insan gönüllülerde nosiseptörlerden alındı. Nosiseptörler, termal ve mekanik uyaranlara verdikleri tepkilere göre ve iletim hızının aktiviteye bağlı yavaşlamasını izleyerek sınıflandırıldı. Yazılım, zamansal raster grafiği aracılığıyla eylem potansiyeli tanımlamasını basitleştirerek deneyi kolaylaştırdı. İn vivo insan mikronörografisi sırasında ve C-liflerinin ve Aδ-liflerinin ex vivo fare elektrofizyolojik kayıtları sırasında tek nöron aksiyon potansiyellerinin gerçek zamanlı kapalı döngü elektriksel eşik takibini gösteriyoruz. İnsan ısısına duyarlı bir C-fiber nosiseptörün elektriksel eşiğinin, alıcı alanın ısıtılmasıyla azaltıldığını göstererek ilke kanıtı oluşturuyoruz. Bu eklenti, tek nöron aksiyon potansiyellerinin elektriksel eşik takibini sağlar ve nosiseptör uyarılabilirliğindeki değişikliklerin nicelleştirilmesine izin verir.

Introduction

Nosiseptörler, periferik sinir sisteminde, açıkça veya potansiyel olarak dokuya zarar veren olaylarla aktive olan ve akut ağrıda kritik bir koruyucu rol oynayan birincil afferent nöronlardır1. Hayvan modellerinde, sağlıklı insan gönüllülerde ve hastalarda C-fiber ve Aδ-fiber nosiseptörlerinden elde edilen elektrofizyolojik kayıtlar, çeşitli ağrı koşullarında duyarlılık ve anormal spontan aktivite ortaya koymuştur 2,3,4,5,6,7. Hastalarda nosiseptör uyarılabilirliğindeki bu değişikliklerin altında yatan mekanizmaların anlaşılması, hedefe yönelik terapötik müdahaleleri mümkün kılabilir8. Bununla birlikte, özellikle hastalarda nosiseptör uyarılabilirliğini doğrudan değerlendirmek için çok az araç vardır9, ancak bu tür araçların yararlılığı için potansiyel iyi bilinmektedir10,11.

Tüm sinir elektriksel eşik izleme, insanlarda aksonal uyarılabilirliği incelemek için kullanılabilir12. Bununla birlikte, büyük, miyelinli, periferik nöronlar, duyusal bileşik aksiyon potansiyelinin genliğine orantısız bir şekilde katkıda bulunduğundan, tüm sinir elektriksel eşik izleme, C-lifi fonksiyonunun değerlendirilmesine izin vermez11,13. Gerçekten de, önceki bir çalışmada, diyabetik nöropati ve kemoterapiye bağlı polinöropatili kronik nöropatik ağrı kohortlarında tüm sinir elektriksel eşik takibi, aksonal uyarılabilirlikte hiçbir fark göstermemiştir11.

Önceki bir çalışmada, tek nöron seviyesinde elektriksel eşik izleme, bir ex vivo sıçan deri-sinir preparasyonunda alay edilen fiber kayıtları sırasında C-fiber nosiseptörlerinin uyarılabilirliğini incelemek için kullanılmıştır14. Yazarlar, artmış potasyum konsantrasyonunun, asidik koşulların ve bradikinin, aksiyon potansiyeli üretimi için azaltılmış bir elektrik eşiği ile yansıtıldığı gibi, C-lifi nosiseptör uyarılabilirliğini arttırdığını göstermiştir. Ayrıca, ısıya duyarlı nosiseptörlerin alıcı alanını ısıtmak elektriksel eşiklerini düşürürken, ısıya duyarlı olmayan nosiseptörler elektriksel eşiklerinde bir artış sergilemiştir14. Bu, tek nöronlu elektriksel eşik izlemenin mümkün olduğuna ve faydalı olabileceğine dair önemli kanıtlar sağlar, ancak şu anda özellikle insan çalışmaları için bu tür araştırmaları mümkün kılacak hiçbir yazılım ve / veya donanım çözümü bulunmamaktadır.

İnsanlarda, mikronörografi, C-liflerinin elektrofizyolojik özelliklerini doğrudan değerlendirmek için mevcut tek yöntemdir15. Bu yaklaşım, kronik ağrılı hastalarda nosiseptör disfonksiyonunu göstermek için kullanılmıştır 2,3,4,5,6,7. Mikronörografi, tek nöron aksiyon potansiyellerini tespit edebilir; Bununla birlikte, düşük sinyal-gürültü oranları nedeniyle, araştırmacılar C-fiber aktivitesini karakterize etmek için işaretleme tekniğini kullanırlar16. İşaretleme tekniğinde, derideki C-lifi alıcı alanlara eşik üstü elektriksel stimülasyon uygulanır. Bu elektriksel stimülasyon, C-fiberin iletim hızı tarafından belirlenen sabit bir gecikme süresinde meydana gelen bir aksiyon potansiyeli üretir. C-lifleri aktiviteye bağlı yavaşlama sergiler, bu sayede iletim hızları azalır ve bu nedenle etki potansiyeli deşarjı dönemlerinde iletim gecikmeleri artar17. Bazal koşullar altında, C-lifleri normalde zararlı uyaranların yokluğunda aksiyon potansiyelleri üretmezler ve bu nedenle, düşük frekanslı elektriksel stimülasyona yanıt olarak iletim gecikmeleri sabittir. Ateşlemeyi uyandıran mekanik, termal veya farmakolojik uyaranlar, aktiviteye bağlı yavaşlamaya neden olur, bu da eşzamanlı düşük frekanslı elektriksel stimülasyonun uyandırdığı aksiyon potansiyellerinin gecikmesini arttırır. Bu, düşük sinyal-gürültü oranı bağlamında uygulanan elektriksel olmayan uyaranlara verilen tepkilerin objektif olarak tanımlanmasını sağlar. Bu nedenle, aktiviteye bağlı yavaşlama, C-liflerini işlevsel olarak karakterize etmek için kullanılabilir16. Gerçekten de, C-liflerinin farklı fonksiyonel sınıfları, stimülasyon frekansını18,19 değiştirmeyi içeren elektriksel stimülasyon paradigmalarında aktiviteye bağlı yavaşlamanın ayırt edici modellerini sergiler. C-fiber aksiyon potansiyellerinin gecikmesindeki bu değişkenlik, onları izlemek için tasarlanmış algoritmalar için bir zorluk teşkil etmektedir.

Bir nosiseptörde devam eden aktivite, düşük frekanslı elektriksel stimülasyon sırasında gecikmesinde artan değişkenliğe yol açar ve bu yine aktiviteye bağlı yavaşlamadan kaynaklanmaktadır. Bu artan değişkenlik veya titreme, uyarılabilirlik2’nin ölçülebilir bir proxy ölçüsüdür. Aksiyon potansiyel gecikmesindeki değişkenliğin diğer nedenleri, tek bir nöronun alternatif terminal dallarının uyarıldığı flip-flop’u içerir, bu da uyandırılan aksiyon potansiyelinin birbirini dışlayan iki (veya daha fazla) temel gecikmeye sahip olmasına neden olur20. Son olarak, bir periferik nöronun terminal dallarının sıcaklığındaki değişiklikler, termodinamik bir şekilde aksiyon potansiyeli gecikme değişikliklerine de neden olur; ısınma iletim hızını arttırır ve soğutma iletim hızını yavaşlatır19. Bu nedenle, nosiseptif C-liflerinin kapalı döngü elektriksel eşik izlemesini gerçekleştirmek isteyen herhangi bir yazılım, elektriksel olarak uyarılmış aksiyon potansiyellerinde gecikme süresinde değişikliklere izin vermelidir.

C-fiber nosiseptörlerin türler arası elektriksel eşik izleme hedefimize ulaşmak için, gerçek zamanlı, kapalı döngü, elektriksel eşik izleme ve gecikme takibini etkinleştirmek için Open Ephys platform21 için açık kaynaklı bir yazılım eklentisi olan APTrack’i geliştirdik. İnsan mikronörografisi sırasında C-fiber nosiseptör elektriksel eşik izlemenin mümkün olduğunu gösteren kavram kanıtı verileri sağlıyoruz. Ayrıca, bu aracın kemirgen ex vivo alaylı lif elektrofizyolojisinde kullanılabileceğini ve böylece insanlar ve kemirgenler arasında translasyonel çalışmalara olanak tanıdığını gösteriyoruz. Burada, araştırmacıların nosiseptör fonksiyonu ve uyarılabilirlik çalışmalarına yardımcı olmak için bu aracı nasıl uygulayabileceklerini ve kullanabileceklerini ayrıntılı olarak açıklayacağız.

Protocol

İnsan mikronörografisi deneyleri, Bristol Üniversitesi Yaşam Bilimleri Fakültesi Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (referans numarası: 51882). Tüm çalışma katılımcıları yazılı bilgilendirilmiş onam vermiştir. Hayvan deneyleri, Bristol Üniversitesi Hayvan Refahı ve etik inceleme kurulu tarafından onaylandıktan sonra 1986 tarihli İngiltere Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) Yasası uyarınca Bristol Üniversitesi’nde gerçekleştirildi ve bir Proje Lisansı kapsamına alındı. 1. Open Ephys GUI ve APTrack’i Kurma Open Ephys grafik kullanıcı arabiriminin (GUI) desteklenen en son sürümünü (https://github.com/Microneurography/APTrack#readme) bulmak için yazılım belgelerine bakın ve ardından GUI’yi indirip yükleyin. Aşağıdaki URL’den GUI’nin uyumlu bir sürümünü yükleyin: https://github.com/open-ephys/plugin-GUI/releases. GitHub’dan en son sürümü indirin: https://github.com/Microneurography/APTrack/releases. Bir Windows bilgisayar için, .dll dosyasını genellikle C:\Program Files\Open Ephys\plugins konumunda bulunan plugins klasörüne kopyalayın. MacOS bilgisayar için, .bundle dosyasını paketin İçindekiler/Eklentiler klasörüne kopyalayın. 2. Kayıt ve uyarıcı aparatın montajı Üretici tarafından sağlanan kabloyu kullanarak edinme kartını bilgisayara bağlayın ve açın.NOT: İnsan mikronörografisi için, katılımcıyı bilgisayardan elektriksel olarak izole etmek için bir USB 3.0 izolatör kullanıldı ve edinme kartı, kemirgen çalışmaları için kullanılan şebeke voltajı güç kaynağının aksine taşınabilir bir batarya ile güçlendirildi. Step motor kontrol kartı hariç tüm USB bağlantıları, insan çalışmaları sırasında USB izolatörden geçirildi. G/Ç kartını, edinme kartındaki analog giriş bağlantı noktasına bağlayın. Bir Intan RHD kayıt başlığını seri çevre birimi arabirimi (SPI) kablosu kullanarak edinme kartına bağlayın.NOT: Intan 16 kanallı bipolar headstage burada kullanılmıştır, ancak diğer monopolar RHD2000 serisi headstage kullanılabilir. PulsePal’ı bilgisayara bağlayın22. PulsePal kullanan analog voltaj kontrollü bir stimülatörle (örneğin, bir DS4) montaj için, fareyle alay edilen fiber kayıtlarında olduğu gibi, 2.5.1-2.5.3 adımlarını izleyin; İnsan mikronörografi kayıtlarında olduğu gibi, bir step motor kullanan döner kodlayıcı tabanlı bir stimülatör (örneğin, bir DS7) ile montaj için, 2.6.1-2.6.8 adımlarını izleyin (Şekil 1). Sinyal zincirini aşağıda açıklandığı gibi GUI’de oluşturun.Rhythm FPGA eklentisini sol tıklayıp sinyal zincirine sürükleyerek sinyal zincirine yerleştirin; bu, GUI’yi satın alma panosuna bağlar. ADC kanallarının kaydını G/Ç kartından başlatmak için ADC düğmesine tıklandığından emin olun. ADC düğmesi açıkken turuncu renkte yanar.NOT: Önceden kaydedilmiş deneysel verileri oynatmak istiyorsanız, başlangıçta Rhythm FPGA yerine Dosya Okuyucu eklentisi kullanılabilir. Bunu APTrack ile birlikte kullanmak, önceki denemelerdeki eylem potansiyellerinin görselleştirilmesine ve gecikme süresinin izlenmesine olanak tanır. Sinyal zincirine bir bandpass filtresi takın; varsayılan 300-6.000 Hz ayarları hem insan hem de fare kayıtları için uygundur. Ayrıca, arkasına bir ayırıcı yerleştirin. APTrack eklentisini ayırıcının bir tarafındaki sinyal zincirine ve diğer tarafındaki LFP Viewer’a takın. LFP Viewer, deneyler sırasında yararlı olan geleneksel osiloskop benzeri voltaj izleme görünümü sağlar. Eklentiden sonra bir kayıt düğümü ekleyin. Açılır menüde, veri kaydetme biçimini ikiliden Open Ephys’e değiştirin. Bu, iyi çalışan basit bir sinyal zincirini tamamlar (Şekil 2); Bununla birlikte, deneysel gereksinimler tarafından belirlenen ek bileşenler eklenebilir.NOT: Kayıt düğümü sinyal zincirindeki eklentiden önce yerleştirilirse, eylem potansiyeli izleme bilgileri kaydedilmez. GUI’nin sağ üst köşesinde, edinme panosundan veri aktarmaya ve görselleştirmeye başlamak için oynat düğmesine tıklayın. Kayda başlamak için, oynat düğmesinin yanındaki dairesel kayıt düğmesine tıklayın.NOT: Kayda tıklamayı unutmak kolaydır; Bunun olmasını önlemek için edinmeye başladığımız andan itibaren verileri kaydederiz. Analog voltaj kontrollü bir stimülatör ile montaj için, aşağıda açıklanan adımları izleyin.Bir analog voltaj girişi tarafından kontrol edilen stimülasyon genliğine sahip sabit akım stimülatörü üzerinde güç. Bu durumda bir DS4 kullanıldı (Şekil 1). PulsePal çıkış kanalı 1, analog voltaj komutu içindir. Bu sinyali bir BNC T-ayırıcı kullanarak bölün ve ardından sabit akım uyarıcı girişine ve G / Ç kartına bağlayın, böylece komut voltajı kaydedilir. PulsePal çıkış kanalı 2, elektriksel stimülasyon TTL olay işaretleyicisi içindir. Bunu G/Ç kartına bağlayın, böylece uyarıcı TTL olay işaretçileri eklentinin kullanması ve post hoc analizi için kaydedilir. Analog voltaj kontrollü bir stimülatör ile montaj için, aşağıda açıklanan adımları izleyin.Stimülasyon genliği döner kodlama kadranı tarafından kontrol edilen sabit akım stimülatörünü açın. Bu durumda bir DS7 kullanıldı (Şekil 1). Step motor kontrol kartını, üretici tarafından sağlanan kabloyu ve manyetik montajı kullanarak step motora bağlayın. Herhangi bir standart USB A – USB mikro-B kablosunu kullanarak kontrol kartını doğrudan bilgisayara bağlayın. Kontrol kartını USB izolatörünün katılımcı tarafına bağlamayın, çünkü bu aynı zamanda 12 V şebeke güç kaynağına da bağlıdır. Kontrol panosunu ilk kez kullanıyorsanız, step motor betiğini GitHub’dan kontrol panosuna yükleyin; Bunun yalnızca bir kez yapılması veya Step Motor komut dosyası için herhangi bir yazılım güncellemesi yayınlanırsa yapılması gerekir. Sabit akım uyarıcısındaki stimülasyon genliği kadranını 0 mA’ya ayarlayın. Step motor ve stimülasyon genlik kadranını aragetirmek için özel bir montaj braketi kullanın. Bunlar, ucuz, hızlı ve özelleştirilebilir montaj çözümleri sağlayan 3D baskılı olabilir. Tercih edilen uyarıcı için bir montajın zaten tasarlanıp tasarlanmadığını görmek için GitHub’a danışın. Step motor namlusunu stimülasyon genliği kontrol kadranına bağlamak için özel bir silindir adaptörü kullanın. Bu adaptörler mukavemet ve dayanıklılık nedenleriyle metalden yapılmış olmalıdır; Bununla birlikte, 3D baskılı parçalar da uygun olacaktır, ancak düzenli olarak değiştirilmeleri gerekebilir. Tercih edilen uyarıcı için bir varil adaptörünün zaten tasarlanıp tasarlanmadığını görmek için GitHub’a danışın. Kontrol kartı / step motor aparatını, özel bir montaj ve namlu adaptörü kullanarak uyarıcı kontrol kadranına gevşek bir şekilde takın.NOT: Montaj ve namlu adaptörü, yazılım başlatıldıktan ve step motor otomatik olarak sıfır konumuna ayarlandıktan sonra daha sonra sıkılacaktır. PulsePal’ı 2.5.2-2.5.3 protokol adımlarında açıklandığı gibi bağlayın (eksi çıkış kanalı 1’i bir uyarıcıya bağlama), çünkü TTL olay işaretçileri oluşturmak analiz ve eklentinin çalışması için hala gereklidir. Ek olarak, tetiklemek için çıkış kanalı 2’yi DS7 uyarıcısına bağlayın. Fare deri-sinir preparatını aşağıda açıklandığı gibi hazırlayın.2-4 aylıkken ve her iki cinsiyetten C57BL / 6J farelerine (Charles River Laboratories, İngiltere, bu çalışmada) yiyecek ve su ad libitum sağlayın. Sodyum pentobarbitalin (≥200 mg / kg) intraperitoneal enjeksiyonu yoluyla anestezik doz aşımı ile toplandıktan ve dolaşımın durduğunu doğruladıktan sonra, Zimmermann ve ark.23 tarafından açıklanan yöntemleri kullanarak, cildi fare arka pençesinin dorsal yönünden ve bu bölgeyi innerve eden safen sinirinden diseke edin. Karbojene sentetik interstisyel sıvıda (Tablo 1) cilt-sinir preparatını, özel yapım çift odacıklı akrilik banyonun yarısında (15 mL / dak perfüzyon hızı, 30 mL hacim) 30-32 ° C’de tutun. Siniri küçük bir delikten mineral yağ dolu odaya geçirin ve petrol jölesi ile kapatın. Yağ, yalıtımlı bir kayıt ortamı sağlar. Süper ince forseps kullanarak sinirin gövdesinden iki ince filamenti uzaklaştırın ve bipolar gümüş / gümüş klorür kayıt elektrodunun her iki tarafına birer tane asın. RHD2216 16 kanallı bipolar başlık kullanarak nöral sinyali dijitalleştirin ve yükseltin ve edinme kartını kullanarak işleyin. Sinyali 300-6.000 Hz’lik bir bandpass filtresiyle 30 kHz’de örnekleyin ve GUI’yi kullanarak görselleştirin. Künt bir cam çubuk kullanarak, preparatın cildini okşayın. Preparatın canlı olduğunu doğrulamak için düşük genlikli kütle aktivitesini kullanın. Aşağıda açıklandığı gibi insan C-fiber mikronörografisi yapın.Daha önce açıklandığı gibi yazılı bilgilendirilmiş onam veren katılımcılarla mikronörografi yapın24. Katılımcı bir yatağa rahatça yaslanmış ve yastıklarla desteklenmiş olarak otururken, bir ultrason tarayıcısı kullanarak yüzeysel peroneal siniri tanımlayın ve lateral malleolusa yaklaşık 5-10 cm proksimal, orta shin seviyesi civarında bir hedef alanı işaretleyin. alkollü mendille %2 klorheksidin kullanarak hedef bölgenin etrafındaki cildi sterilize edin ve orta shin seviyesinde amaçlanan kayıt bölgesinin yakınına deri altından steril bir referans elektrodu yerleştirin. Hedef bölgedeki ultrason rehberliğinde yüzeysel peroneal sinire steril bir kayıt elektrodu yerleştirin. RHD2216 16 kanallı bipolar başlık kullanarak nöral sinyali dijitalleştirin ve yükseltin ve edinme kartını kullanarak işleyin. Sinyali 300-6.000 Hz’lik bir bandpass filtresiyle 30 kHz’de örnekleyin ve GUI’yi kullanarak görselleştirin.NOT: Satın alma ekipmanı, 5 kV RMS izolasyonlu bir USB 3.0 izolatör ile dizüstü bilgisayardan elektriksel olarak izole edildi ve özel yapım 12 V pil güç kaynağı ile çalıştırıldı. Mekanik olarak uyarılmış kitle aktivitesini ortaya çıkarmak için cildi hafifçe okşayarak başarılı intranöral konumlandırmayı onaylayın. Ek olarak, katılımcılar genellikle başarılı intranöral pozisyonlama sonrasında ayağın dorsolateral yönünde parestezi bildirmektedir. 3. Yazılım kurulumu ve periferik nöronların tanımlanması ve fenotiplemesi Yazılımı aşağıda açıklandığı gibi ayarlayın.GUI’yi açın (Şekil 3). Step motor kontrol kartı PC’nize bağlıysa, algılanacak ve kendisini sıfır konumuna ayarlayacaktır. Uyarıcının stimülasyon genliği kadranı ve step motorunun her ikisi de sıfıra ayarlandığından, 2.6.5-2.6.7 adımlarında açıklanan özel montaj ve namlu adaptörünü sıkın.NOT: Step motor ve stimülasyon genlik kadranının her ikisi de “sıfırlanmazsa”, step motorun kontrol kadranını menzilinden çıkarmaya çalışmasına neden olabilir ve bu da hasara neden olabilir. Seçenekler menüsünde Tetikleyici Kanalı’nı seçin. PulsePal çıkış kanalı 2’den elektriksel stimülasyon TTL işaretleyicisini içeren ADC kanalını seçin. Seçenekler menüsünde Veri Kanalı’nı seçin ve elektrofizyolojik verileri içeren kanalı seçin. Stimülasyon kontrol panelinde, kaydırıcıyı kullanarak ilk, minimum ve maksimum stimülasyon genliklerini tanımlayın. TTL belirteçlerinin üretilmesi için mevcut stimülasyonun 0’ın üzerine ayarlandığından emin olun.NOT: Bazı uyarıcılar 1:1 olmayan bir giriş-çıkış ölçeklendirme oranına sahiptir; Uygun bir stimülasyon genliği seçerken bunu göz önünde bulundurun. Örneğin, sabit akım stimülatöründen daha yüksek bir çıkış elde etmek için bazı stimülasyon sistemlerinde 1: 10 çıkış oranı seçilebilir. Stimülasyon kontrol panelinde, stimülasyon talimatlarını içeren bir dosya yüklemek için F’ye tıklayın. Elektriksel stimülasyon protokolleri, kullanıcıların deneyleri için karmaşık stimülasyon paradigmaları oluşturmalarını sağlayan istenen stimülasyon frekansları ve süresinden oluşan virgülle ayrılmış değer (CSV) dosyaları olarak saklanır. Örnek bir şablona buradan ulaşabilirsiniz: https://github.com/Microneurography/APTrack/blob/main/example_playlist.csv Stimülasyon kontrol panelinde, yüklenen stimülasyon paradigmasına başlamak için > tıklayın. Varsayılan olarak, APTrack PulsePal’dan sabit akım uyarıcının stimülasyon genliğini kontrol etmek için değişen genliklerde 0,5 ms süreli pozitif kare dalga darbeleri üretmesini ister. Zamansal raster grafiği, elektriksel stimülasyona verilen yanıtla güncellenmeye başlayacak ve her yeni stimülasyon yanıtı sağda yeni bir sütun olarak görüntülenecektir. Tek nöron aksiyon potansiyellerini görselleştirin ve tanımlayın.Tek nöron aksiyon potansiyellerinin başarılı bir şekilde tespit edilmesi için, uygun görüntü eşiklerinin ayarlanması önemlidir. Zamansal raster çizim panelinde, düşük, algılama ve yüksek görüntü eşik değerlerini ayarlayın.Seçenekler menüsünden bir renk düzeni seçin. WHOT (Beyaz Sıcak) modunda (varsayılan), düşük görüntü eşiğinin altındaki voltajlar siyah renkle kodlanır. Düşük görüntü ve algılama eşikleri arasındaki voltajlar gri tonlamalı olarak kodlanır. Algılama eşiğinin üzerindeki voltajlar yeşil, yüksek görüntü eşiğinin üzerindeki voltajlar ise kırmızı renkle kodlanır. Periferik nöronlar, düşük stimülasyon frekanslarında (<0.25 Hz) sabit gecikme tepkileri sergiler ve bu tepkiler, iletim hızları ve stimülasyon ile kayıt bölgeleri arasındaki mesafe ile belirlenir. Uygun görüntü eşikleri ayarlandığında, algoritmalar tarafından algılanan eşik geçiş olayları yeşil renkte kodlanacaktır (Şekil 4). Uyarıcı elektrodu, kaydedilen sinir tarafından innerve edilen cilt bölgesi etrafında sistematik olarak hareket ettirin ve her bölgede en az üç stimülasyon olayına izin verin. Her elektriksel stimülasyon olayından sonra aynı zaman noktasında meydana gelen eşik geçiş olayları (yeşil ile işaretlenmiş) için zamansal raster grafiğini izleyin.NOT: Farelerde, 5 mA’lık bir arama uyaranı kullanılmıştır. İnsanlarda, transkutanöz elektriksel arama uyaranının genliği, asla 7/10’u geçmeyecek şekilde sözlü bir ağrı derecesine titre edildi. Aynı gecikme süresinde ve aynı uyarım konumunda arka arkaya görünen üç eşik geçiş olayı (yeşil çubuklar) olup olmadığını kontrol edin; Bu, periferik nöron aksiyon potansiyelinin tanımlandığını gösterir. Hedef nöronun alıcı alanının elektriksel olarak en hassas noktasını tanımlayarak uyarıcı elektrot pozisyonunu optimize edin ve ardından elektrodu yerine sabitleyin. İnsan mikronörografisinin bu noktasında, bipolar elektriksel stimülasyon için intradermal elektroakupunktur iğneleri (0.2 mm çapında) kullanmaya geçin, farelerde, stimülasyon pozisyonunun sabit olması için özel bir transkutanöz uyarıcı prob kullanılır. Periferik nöronların sınıflandırılmasını ve duyusal fenotiplemesini gerçekleştirin.Simülasyon genliğini manuel olarak ayarlayarak veya isterseniz APTrack kullanarak hedef eylem potansiyelinin elektriksel eşiğini tahmin edin (adım 4.1-4.2’de açıklanmıştır). Duyusal fenotipleme protokolü boyunca 0.25 Hz frekansında tahmini elektriksel eşiğin 2 katında alıcı alanı uyarın. İletim mesafesini iletim gecikmesine bölerek nöronun iletim hızını hesaplayın. C-lifleri ≤2 m/s’lik bir iletim hızı ile tanımlanabilir. Aktivasyon için mekanik eşiği belirlemek için von Frey filamentlerini kullanarak alıcı alanı mekanik olarak uyarın. Mekanosansasyon, voltaj izi üzerinde görülebilen uyarılmış aksiyon potansiyelleri ve eğer bir C-lifi ise, yeterli kuvvet üzerine nöronun gecikmesindeki bir artış ile tanımlanabilir. Nöronun alıcı alanını ısıtın, yine voltaj izinde görülebilen aksiyon potansiyellerini ve eğer bir C-lifi ise, yeterli ısı uygulaması üzerine nöronun gecikmesinde bir artış izleyin. Isıya duyarsız nöronlar, aksonal yayılım üzerindeki termodinamik etki nedeniyle gecikmede bir azalma gösterecektir.NOT: İnsan mikronörografisinde, hızlı ve doğru termal kontrol için bir TSC-II kullanın. Fare hazırlığında, nöron terminallerine erişime izin verirken, çevredeki sıvıya hızlı ısı dağılımını kısıtlarken, alıcı alanın üzerine yerleştirilmiş bir alüminyum izolasyon odasına ısıtılmış veya soğutulmuş sentetik interstisyel sıvı ekleyin. Bir termokupl kullanarak sıcaklığı kaydedin. Alıcı alanı soğutun, yine voltaj izinde görülebilen aksiyon potansiyellerini ve yeterli soğuk uygulama üzerine bir C-fiber ise, nöronun gecikmesinde belirgin bir artış izleyin. Tüm nöronlar, aksonal yayılım üzerindeki termodinamik etki nedeniyle gecikmede bir artış gösterecektir, bu nedenle nöronları yalnızca gecikme artışına dayanarak soğuğa duyarlı olarak etiketlemede dikkatli olun. 4. Gecikme süresi ve elektrik eşiği izleme Gecikme izlemeyi aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirin.Zamansal raster grafiğinde tek nöron aksiyon potansiyelinin (potansiyellerinin) tanımlanmasının ardından, arama kutusunun konumunu ayarlamak için zamansal raster grafiğin sağ tarafındaki gri doğrusal kaydırıcıyı hareket ettirin. Zamansal raster grafiğin altında, arama kutusu genişliği döner kaydırıcısını uygun bir genişliğe ayarlayın. Geçici gürültü artışları, kendiliğinden ateşlenen eylem potansiyelleri veya yakındaki diğer sabit gecikmeli eylem potansiyellerinin ilgilenilen eylem potansiyeli olarak yanlış tanımlanma olasılığını azaltmak için arama kutusu genişliğini daraltın. Hedeflenen eylem potansiyelini izlemeye başlamak için, çok birimli izleme tablosunun altındaki + işaretine tıklayın. Tabloya, gecikme konumu, 2-10 uyaranın üzerinden ateşleme yüzdesi (seçenekler menüsünde ayarlanır) ve algılanan tepe genliği dahil olmak üzere hedef eylem potansiyelinin ayrıntılarını içeren yeni bir satır eklenecektir. Çok birimli izleme tablosuna bir eylem potansiyeli eklendiğinde, gecikme izleme algoritması (Şekil 5) sonraki her elektriksel stimülasyonda otomatik olarak yürütülür. Zamansal raster grafiğinde görülebilen birden fazla ayrı eylem potansiyeli varsa, bunları yukarıda açıklandığı gibi çok birimli izleme tablosuna ekleyin. Eşzamanlı gecikme izleme için tabloya eklenebilecek teorik maksimum eylem potansiyeli sayısı, maksimum 32 bit tamsayı değeridir. Arama kutusunu, gecikme izleme algoritması tarafından belirlendiği şekilde, söz konusu eylem potansiyeli için uygun konuma taşımak üzere çok birimli izleme tablosundaki Ani Artışı İzle kutusunu işaretleyin. Bu, gecikme izlemenin gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak tanır ve izlemenin beklendiği gibi eylem potansiyelini izlemesini sağlar. Diğer ani artışların gecikme izlemesi arka planda normal şekilde devam eder. Her satırın sonundaki sil düğmesini kullanarak izlenen eylem potansiyellerini çok birimli izleme tablosundan kaldırın. Elektrik eşiği izlemeyi aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirin.Stimülasyon kontrol panelindeki artış ve azalma oranlarını 0,1 V ile 0,5 V arasında ayarlayın. bu değerleri eşit tutun ve deneysel paradigmanın bir parçası olmadıkça deney sırasında ayarlamayın. Stimülasyon frekansının modülasyonu deneysel paradigmanın bir parçası olmadıkça, stimülasyon frekansının uygun bir hıza, tipik olarak 0.25-0.5 Hz’ye ayarlandığından emin olun. Nosiseptör ateşleme hızlarının arttırılması, nosiseptörün elektriksel eşiğini değiştirebilir. Bir eylem potansiyeli başarıyla izlendikten sonra, elektrik eşiği izleme algoritmasını başlatacak olan çok birimli izleme tablosundaki İzleme Eşiği kutusunu işaretleyin (Şekil 6).NOT: Elektriksel eşik izleme yalnızca hedeflenen eylem potansiyeli üzerinde çalıştırılır; Gerçekten de, çok birimli izleme tablosundaki diğer aksiyon potansiyellerinin ateşleme hızları, stimülasyon genliği değiştikçe buna göre güncellenecektir. Stimülasyon genliğini elektrik eşiğinin tahminine manuel olarak ayarlayın; Bu, elektrik eşiğini belirlemek için bekleme süresini azaltacaktır. Güvenilir bir elektriksel eşik oluşturmak için geçen süre, stimülasyon frekansına, artış ve azalma oranlarına ve ilk stimülasyondan nöronun elektriksel eşiğine kadar stimülasyon genliğindeki farka bağlıdır. Yazılım, nöronların elektriksel eşiğinin tahmini için yukarı-aşağı bir yöntem kullanır. Çok birimli izleme tablosunda, ateşleme hızı önceki 2-10 stimülasyona göre belirlenir (seçenekler menüsünde seçilir). Dikkate alınacak stimülasyon olaylarının sayısını seçin; Daha yüksek bir sayı, eşik tahmininin güvenilirliğini artırır, ancak elde edilmesi daha uzun sürer. İnsan mikronörografisi sırasında, aşırı katılımcı rahatsızlığını önlemek için elektriksel uyaranların ağrısını izlemek önemlidir; Nosiseptörlerin, özellikle sessiz / uyuyan C liflerinin incelenmesi sırasında bazı rahatsızlıklar kaçınılmazdır. Elektrik eşiği takibi sırasında stimülasyon genliği artarken düzenli olarak ağrı derecelendirmeleri isteyin ve katılımcının isteği üzerine devreden çıkarmak için sabit akım uyarıcısının yakınında kalın.NOT: Alternatif olarak, elektriksel stimülasyon, stimülasyon kontrol panelindeki [ ] düğmesine tıklanarak kullanıcı arayüzü üzerinden devre dışı bırakılabilir. ‘lik bir ateşleme oranı, yaklaşık elektrik eşiğinin belirlendiğini gösterir. Elektriksel eşik izleme sırasında, alıcı alana sıcaklık veya ilaç manipülasyonları gibi deneysel bir manipülasyon uygulayın. Bu manipülasyonların nosiseptörün elektriksel eşiği üzerindeki etkileri izlenecektir.NOT: Deneysel manipülasyonu takiben yeni bir nosiseptör eşiği tanımlamak için yeterli zaman tanıyın.

Representative Results

Bir denemeyi kontrol etmek için çalışan yazılımın temsili bir örneği Şekil 7’de gösterilmiştir. Tek nosiseptörlerin elektriksel eşiğini etkili bir şekilde bulmak için yukarı-aşağı bir yöntem kullanarak stimülasyon genliğini yinelemeli olarak ayarlar. İlk kez, mikronörografi sırasında insanlarda gerçek zamanlı tek nöronlu elektriksel eşik takibinin fizibilitesini gösteriyoruz (Şekil 7A). Ek olarak, bir fare Aδ-fiberinde elektriksel eşik izlemeyi gösteriyoruz (Şekil 7B). Burada kullanıldığı gibi, eşik geçişi ile aksiyon potansiyellerinin tanımlanması, zaman içindeki elektriksel eşiklerin izlenmesi için yeterlidir. Kullanıcıların, sinyaller-gürültü oranını iyileştirmek için bir Faraday kafesi ve bandpass filtreleri kullanmak gibi kayıtları sırasında elektriksel gürültüyü en aza indirecek adımlar atmalarını öneririz. Elektriksel eşik izlemenin insanlarda nosiseptör uyarılabilirliğindeki değişikliklerin bir ölçüsü olarak kullanılabileceğini göstermek için, kademeli bir ısıtma paradigması sırasında elektriksel eşiğin izlenmesi gerçekleştirilmiştir (Şekil 8). Nosiseptör terminallerinin sıcaklığının arttırılması, bir aksiyon potansiyeli ortaya çıkarmak için gereken elektriksel stimülasyon akımını azalttı ve nosiseptör uyarılabilirliğindeki artışı yansıttı (Şekil 8C). Bu muhtemelen C-fiber nosiseptör14’te ifade edilen ısıya duyarlı iyon kanalları tarafından reseptör potansiyellerinin üretilmesinden kaynaklanmıştır. En yüksek sıcaklık basamağı olan 44 °C’de, termal olarak uyarılmış aksiyon potansiyelleri ortaya çıkmıştır (Şekil 8A, uyaran numarası 86-96). Bu, nosiseptör yüksek frekanslı deşarjı takiben refrakter bir durumda olabileceğinden, elektriksel eşikte bir artışa neden olur. Beklendiği gibi, sıcaklık arttıkça izlenen eylem potansiyelinin gecikmesi azaldı. Bunun, C-fiberinin iletim hızını artıran iletim makinesi üzerindeki termodinamik bir etki nedeniyle meydana geldiği düşünülmektedir. Bu C-fiber aynı zamanda parmak arası terlik de sergiliyor olabilir (Şekil 8B, uyaran numarası 47-54), bu da aksiyon potansiyeli algoritma arama penceresinin dışına düşerse, aşağıdaki elektriksel stimülasyonun yanlışlıkla genlikte artmasına neden olabilir. Şekil 1: Kemirgenlerde ve insanlarda APTrack ile nosiseptör elektriksel eşik takibi için gerekli ekipman kurulumunun ve kablo bağlantılarının bir şeması. İki farklı stimülasyon genlik kontrolü yöntemine dikkat edin: insan kurulumumuzda manuel olarak ayarlanan uyarıcılar için bir step motor ve kemirgen kurulumumuzda giriş voltajı kontrollü uyarıcılar için bir PulsePal. (1) Open Ephys platformu için eklentiyi çalıştıran bir PC (Windows, Mac veya Linux). (2) DS7 üzerindeki stimülasyon genliği kadranını çalıştıran bir step motor. (3) İnsanlarda kullanım için onaylanmış sabit akım uyarıcısı; burada bir DS7 kullandık. (4) İnsan katılımcıyı PC’den izole eden bir USB 3.0 optoizolatör (isteğe bağlı, yalnızca insan araştırmaları için gereklidir). (5) TTL zaman damgaları (çıkış kanalı 2) ve istenen stimülasyon genliğine (çıkış kanalı 1) karşılık gelen voltaj adımları üreten bir PulsePal V2 Darbe Jeneratörü. (6) Hayvanlarda kullanılmak üzere sabit akım uyarıcısı; burada bir DS4 kullandık. (7) Sistem için bir DC güç kaynağı (kemirgen kurulumu için kullanılan şebeke DC güç kaynağı ve insan kurulumu için kullanılan pil DC güç kaynağı). (8) Bir satın alma kurulu. (9) Termokupl çıkışları ve TTL işaretleyicileri gibi kaydedilecek sinyalleri taşıyan BNC koaksiyel kablolarını bağlamak için bir I/O kartı. (10) Nosiseptör elektrofizyolojik kayıtlara tabi tutulan fare deri-sinir preparatı. (11) Yüzeysel peroneal sinirdeki C-liflerinden mikronörografi kaydı yapılan bir insan katılımcı. (12) Kayıtların elde edilmesi ve dijitalleştirilmesi için bir Intan RHD2216 headstage. (13) Kayıt elektrotlarının bağlı olduğu ve sinyalin RHD2216 headstage’e iletilmesini sağlayan bir Intan Elektrot Adaptör Kartı. (14) BNC koaksiyel bağlantı yoluyla sıcaklığı çıkarabilen bir termal stimülasyon sistemi. (15) Mekanik stimülasyon olaylarını ve ilaç uygulamalarını işaretlemek için kullanılan 3,3 V pille çalışan bir düğme / ayak pedalı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Şablon sinyal zinciri. Kırmızı ok, G/Ç kartından ADC girişini etkinleştirmek için düğmeyi işaret eder. Sarı ok, Open Ephys dosya formatını seçmek için açılan menüyü gösterir. Yeşil ok, Oynat ve Kaydet düğmelerini gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Grafik kullanıcı arayüzü. GUI dört ana bileşenden oluşur. (1) Veri görselleştirme ve grafiğin kontrolüyle ilişkili ayarlar için Zamansal Raster Grafiği paneli (yeşil). Etkinliğe bağlı kademeli yavaşlamayı gösteren sabit bir gecikme yanıtı yeşil okla gösterilir. (2) Stimülasyon genlik parametrelerini ayarlamak ve stimülasyon paradigması komut dosyalarını yüklemek için Stimülasyon Kontrol paneli (sarı). (3) Gecikme ve elektrik eşiği izlemeyi izlemek ve etkinleştirmek için eylem potansiyellerini eklemek için Çok Birimli İzleme Tablosu (mavi). (4) Veri ve TTL tetikleyicileri için renk stillerini ve giriş kanalını seçmek için Seçenekler Menüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: APTrack kullanarak zamansal raster grafiği üzerinde gerçek zamanlı veri görselleştirme yoluyla sabit gecikmeli eylem potansiyellerinin tanımlanmasının kolaylaştırılması. Bu, yüksek sinyal-gürültü oranına sahip bir örnektir. Temporal raster grafiğinde sunulan veriler, mikronörografi sırasında yüzeysel peroneal sinirden bir insan C-lifi kaydından alınmıştır. Voltaj İzleme, Open Ephys içindeki osiloskop benzeri LFP Viewer eklentisidir. APTrack Kullanıcı Arabirimi, eklentinin grafik kullanıcı arabirimidir. İzlenen eylem potansiyeli yeşil oklarla gösterilir ve zamansal raster grafiğinin kenarındaki dairesel kaydırıcı, algoritmaların eşik geçiş olaylarını arayacağı arama kutusu konumunu kontrol etmek içindir. Elektriksel stimülasyon artefaktı, voltaj izi üzerinde mavi renkle işaretlenmiştir. Analog voltaj komutunun stimülasyon genliği kırmızı ile gösterilir; Bunun, stimülatörde ayarlanan ölçekleme faktörüne bağlı olarak stimülasyon akımı genliği ile aynı olmayabileceğini unutmayın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: Gecikme izleme algoritmasının grafik gösterimi. Basit bir ifadeyle, eşik geçişi ile bir eylem potansiyeli tespit edilirse, arama kutusu konumunu tepe voltajı sırasında kendisini merkezleyecek şekilde ayarlayacaktır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: Elektrik eşiği izleme algoritmasının grafiksel gösterimi. Basit bir ifadeyle, eşik geçişi ile bir aksiyon potansiyeli tespit edilirse, stimülasyon genliği azalma oranı ile azaltılacaktır. Herhangi bir aksiyon potansiyeli tespit edilmezse, stimülasyon genliği artış oranı ile artırılacaktır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 7: 0.25 Hz stimülasyon frekansında tek nöron aksiyon potansiyellerinin otomatik elektriksel eşik takibi . (A) Bir mikronörografi deneyi sırasında yüzeysel peroneal sinirin bir insan C-lifinin sıralı izleri. (B) Bir farenin safen sinirinin Aδ-lifinin deri-sinir preparasyonu sırasında sıralı izleri, lif elektrofizyolojisi ile dalga geçmiştir. İzler, bir aksiyon potansiyeli tanımlandığında kırmızı renkteydi ve bu da uyaran genliğinde bir azalmaya neden oldu. Yazılım algoritması,% 50 ateşleme olasılığı için gereken uyaran genliğini etkili bir şekilde bulur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 8: Bir insan C-fiber nosiseptörünün termal stimülasyonu sırasında 0.25 Hz stimülasyon frekansında elektriksel eşik izleme. Y ekseni, paradigmanın başlangıcından itibaren stimülasyon sayısını kodlar. (A) Elektriksel stimülasyonu takiben 4.000 ms boyunca gerilim izi, eşik geçiş olayları kırmızı ile işaretlenmiştir. (B) A’dan gelen voltaj izi, izlenen aksiyon potansiyelinin etrafına yakınlaştırılmıştır. İzlenen aksiyon potansiyeli tespit edildiğinde izler kırmızı renkteydi. Dikey mavi çizgi, izlenen birimin temel gecikme süresidir. (C) APTrack tarafından komuta edilen stimülasyon akımı. Dikey mavi çizgi, taban çizgisi elektrik eşiğidir. (D) Alıcı alan TCS-II termal uyarıcı prob sıcaklığı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Bileşik Konsantrasyon Arjantin 107,8 milyon NaHCO3 26,2 milyon Kartal 3,5 milyon NaH2PO4 1,67 milyon CaCl2 1,53 milyon MgSO4 0,69 milyon Sodyum Glukonat 9,64 milyon Sakaroz 7,6 milyon Glikoz 5,55 milyon Tablo 1: Fare derisi-sinir preparasyonu için sentetik interstisyel sıvının içeriği23.

Discussion

APTrack, Open Ephys platformuyla kullanım için bir yazılım eklentisidir. Bu platformu açık kaynaklı, esnek ve uygulanması ucuz olduğu için seçtik. Sabit akım stimülatörünün maliyeti dahil değil, eklentiyi kullanmaya başlamak için gereken tüm ekipman, yazma sırasında yaklaşık 5.000 ABD Doları karşılığında satın alınabilir. Bunun, araştırmacıların periferik sinir elektrofizyolojisi çalışmalarında APTrack’i daha kolay uygulamalarını sağlayacağını umuyoruz. Ayrıca, araştırmacılar yazılımı deneysel ihtiyaçlarına uyacak şekilde serbestçe değiştirebilirler. Önemli olarak, bu araç, insanlarda ilk kez tek C-fiber nosiseptörlerin elektriksel eşik takibine izin vermiştir.

Sinyal-gürültü oranı ne kadar yüksek olursa, algoritmalar aksiyon potansiyellerini o kadar iyi tanımlayabilir. Mikronörografi sırasındaki sinyal-gürültü oranı, kayıtlarımızın çoğunda yeterliydi, ancak kullanıcılar zaman içinde sinyal bozulması riskine karşı uyanık olmalıdır. Bu, daha uzun deneysel protokoller için özellikle önemlidir, çünkü izlenen aksiyon potansiyelinin genliği tespit eşiğinin altına düşerse, stimülasyon genliği yanlışlıkla artacaktır; Bu, deneycilerin eklentiyi izlemesi ve ardından gerekirse ayarları değiştirmesiyle azaltılabilir. Sinyal-gürültü oranı, bandpass filtreleme ile iyileştirilmiştir, ancak daha büyük geçici olanlar, arama kutusu zaman penceresinde gelmeleri durumunda eylem potansiyeli olarak yanlış tanımlanabilir. Geçici gürültüyü bir eylem potansiyeli olarak yanlış tanımlama riski, eklentinin eylem potansiyellerini aradığı zaman penceresini daraltarak ve eşik ayarlarını optimize ederek azaltılabilir. Bununla birlikte, eklentinin performansını engelleyen hala karşılaşılabilecek durumlar vardır. Spontan aktivite, daha büyük genlikli aksiyon potansiyelleri algoritmanın arama kutusu penceresine düşerse, hedef eylem potansiyeli olarak yanlış tanımlanacakları için zorluklara neden olabilir. Ek olarak, ilgilenilen nörondaki spontan aktivite, elektriksel stimülasyonun refrakter döneminde düştüğü ve bir aksiyon potansiyeli üretememesine neden olduğu anlamına gelebilir. Yazılımı kullanmadaki zorluklar, birincil afferent nöronlar flip-flop sergilediğinde de ortaya çıkabilir, böylece tek bir nöronun alternatif terminal dalları uyarılır, böylece uyandırılan eylem potansiyelinin karşılıklı olarak dışlayan iki (veya daha fazla) temel gecikme süresine sahip olmasına neden olur20. Yüksek sinyal-gürültü oranlarına sahip parmak arası terlik sergileyen nöronlardan yapılan kayıtlar sırasında, nöronun sergilediği tüm potansiyel iletim hızlarını kapsüllemek için arama kutusu genişliğini artırarak gecikme ve elektriksel eşik izlemeyi başarıyla gerçekleştirdik. Bununla birlikte, elektriksel eşik, uyarılan nöronun terminal dalına bağlı olarak değişebilir, bu da kısmen elektriksel stimülasyon bölgesinden alternatif nosiseptör terminallerine olan mesafedeki farklılıklardan kaynaklanmaktadır. Örneğin, şablon eşleştirmeyi içerecek eylem potansiyeli tanımlama süreci üzerinde ek çalışmalar yapılabilir ve bu yazılıma entegre edilebilir. Bant durdurma veya uyarlanabilir gürültü filtreleme için GUI eklentileri, geliştirilmeleri durumunda sinyal zincirindeki APTrack’in yukarı yönünde de kullanılabilir.

Zamanın %50’sinde, kullanıcı tarafından tanımlanan elektriksel uyaran sayısında, tipik olarak 2-10 arasında bir aksiyon potansiyeli ortaya çıkarmak için gereken akım olarak belirlenen elektrik eşiğini dikkate alıyoruz. Elektriksel stimülasyonun morfolojisi 0.5 ms ve pozitif, kare dalga darbeleridir. Bu, nöronal uyarılabilirliğin yaygın olarak kullanılan bir ölçüsü olan reobazın belirlenmesiyle aynı şey değildir. Eklenti, reobase’i belirlemek için uyarlanabilir. Bununla birlikte, daha basit bir önlem aldık, çünkü ısıtma sırasında meydana geldiği varsayılanlar gibi uyarılabilirlikteki dinamik değişikliklerin, reobaz değişiklikleriyle ölçülmesi, elektrik eşiği tahminimizden daha zor olurdu.

Bu yazılım hem insan hem de kemirgen deneylerinde kullanılabilir. Bu, elektriksel stimülasyon sistemleri için esnek destek ile mümkün olmaktadır. Yazılım, analog komut voltajını kabul eden veya bir step motorla manuel olarak arayüzlenebilen herhangi bir uyarıcı ile çalışacaktır. Mikronörografi için, insan araştırmalarında kullanılmak üzere tasarlanmış ve stimülasyonu bir kadran tarafından kontrol edilen CE işaretli bir sabit akım uyarıcısı ile kullandık. Analog voltaj komutlarını kabul eden uyarıcılar, uyaranlar arasındaki devrenin bağlantısını kesmedikleri için gürültülü olabilir, yani analog girişteki herhangi bir 50/60 Hz hum veya gürültü kayda iletilir. Devreyi bağlamak için ek bir TLL tetikleme sinyali gerektiren ve analog voltaj girişine benzer bir akımda bir uyaranın üretilmesine izin veren bir uyarıcı, eklenti ile kullanım için idealdir. Bu, gürültünün uyaranlar arasındaki kayda iletilmesini önler.

Yazılım, elektrik eşiğini tahmin etmek için basit bir yukarı-aşağı yöntem kullanır. Bu, onlarca yıldır psikofizik testlerinde kullanılmaktadır25. Yukarı-aşağı yöntemine uygun olarak, stimülasyon genliğini modüle etmek için elektriksel eşik izleme algoritması, bir sonraki stimülasyonun genliğini hesaplarken yalnızca önceki stimülasyonun genliğini ve tepkisini dikkate alır. Bu, stimülasyon genliğinin gerçek elektriksel eşiğin etrafında salınacağı ve böylece eşiğin sabit olduğu varsayılarak% 50’lik bir ateşleme hızı üreteceği anlamına gelir. Bir artış veya azalmanın minimum boyutu 0,01 V’dir; bu, uyarıcının 1 V: 1 mA giriş-çıkış oranına ve bu küçük adım değişikliklerini elde etmek için yeterli çözünürlüğe sahip olduğunu varsayarsak, 0,01 mA’ya eşdeğerdir. Eklenti, hedef eylem potansiyelinin elektriksel eşiğinin canlı tahminini, kullanıcı tarafından tanımlanan önceki uyaran sayısına (2-10) göre% 50’lik bir ateşleme oranına her ulaştığında güncelleyecektir. Post hoc, elektrik eşiğini tahmin etmek için son 2-10 uyaran üzerindeki stimülasyon genliğinin yuvarlanan ortalamasını kullanmanızı öneririz ve bu tahminin yalnızca ateşleme oranı% 50’de nispeten kararlı olduğunda doğru olacağı belirtilmelidir. Elektrik eşiğinin hem canlı hem de post hoc tahminlerinde, dikkate alınması gereken bir çözünürlük, güvenilirlik ve zaman dengesi vardır. Daha küçük artış ve azaltma adımlarının kullanılması, elektrik eşiği tahmininin doğruluğunu artıracak, ancak başlangıçta ve pertürbasyondan sonra yeni elektrik eşiğini bulmak için geçen süreyi artıracaktır. Elektrik eşiğini daha fazla sayıda önceki uyaran üzerinden hesaplamak daha iyi güvenilirlik sağlayacaktır, ancak doğru bir tahmine ulaşmak için gereken süreyi artıracaktır.

APTrack, periferik sinir kayıtlarında, özellikle de aksiyon potansiyeli gecikmesinin altta yatan nöronal aktiviteye bağlı olarak değişebileceği dönemlerde deneysel ve patolojik pertürbasyonlar sırasında C-liflerinin elektriksel eşiklerini izlemek için tasarlanmıştır. Bu yöntem, sağlıklı gönüllülerde ve hastalarda sadece aksonal uyarılabilirliğin değil, aynı zamanda nosiseptör jeneratör potansiyellerinin de incelenmesini sağlayacaktır. Elektrofizyolojinin diğer alanlarının, uyaran kilitli bir aktivitenin elektriksel eşik takibini gerektiren herhangi bir deneyde kullanılmak üzere bu aracı benimseyebileceğini ve uyarlayabileceğini tahmin ediyoruz. Örneğin, bu, APTrack’ten tahrik edilen ışık darbeleriyle optogenetik stimülasyon için kolayca uyarlanabilir. Eklenti açık kaynaklıdır ve GPLv3 lisansı altında araştırmacılar tarafından kullanılabilir. Uyarlanabilir, düşük maliyetli, açık kaynaklı bir veri toplama sistemi olan Open Ephys platformu üzerine kurulmuştur. Eklenti, eylem potansiyeli bilgilerini çıkarmak ve ek kullanıcı arayüzleri veya uyarlanabilir paradigmalar sağlamak için aşağı akış eklentileri için ek kancalar sağlar. Eklenti, eylem potansiyellerinin gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesi ve gecikme süresi takibi için basit bir kullanıcı arayüzü sağlar. Ayrıca önceki verileri oynatabilir ve zamansal raster grafiğini kullanarak bunları görselleştirebilir. Ayrıca, önceki verilerin oynatılması sırasında gecikme izlemeyi de gerçekleştirebilir. Gerçek zamanlı gecikme takibi için başka yazılım paketleri mevcut olsa da, açık kaynaklı değildir ve elektrik eşiği izleme26,27 gerçekleştiremezler. APTrack, veri görselleştirme için zamansal bir raster grafiği kullandığından, voltaj izlerinden sabit gecikmeli aksiyon potansiyellerini tanımlamaya yönelik geleneksel yöntemlere göre bir avantaja sahiptir. Ayrıca, düşük sinyal-gürültü oranlarına sahip deneylerde kullanma deneyimlerimiz, zamansal raster arsa görselleştirme yönteminin, aksi takdirde kaçırılmış olabilecek sabit gecikmeli eylem potansiyellerinin tanımlanmasına izin verdiğini göstermiştir.

Tüm sinir eşiği izleme, aksonal uyarılabilirliği değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir13. Kemirgen C-liflerinde tek nöron elektriksel eşik takibi daha önce nosiseptör uyarılabilirliğini ölçmek için kullanılmıştır14 ve insanlardaki faydası10,11; Ancak, şimdiye kadar, bu mümkün değildi. Hem kemirgen hem de insan periferik sinir elektrofizyolojik çalışmalarında tek nosiseptör uyarılabilirliğini doğrudan ölçmek için yeni, açık kaynaklı bir araç sunuyoruz. APTrack, ilk kez insanlarda tek nöron aksiyon potansiyellerinin gerçek zamanlı, açık kaynaklı, elektriksel eşik takibini mümkün kılar. Kemirgenler ve insanlar arasındaki nosiseptörlerin translasyonel çalışmalarını kolaylaştıracağını tahmin ediyoruz.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Fon sağlayıcılarımıza destekleri için teşekkür ederiz: Tıp Bilimleri Akademisi (J.P.D., A.E.P.), Versus Arthritis (J.P.D., A.E.P.), Jean Golding Enstitüsü Seedcorn Grant (J.P.D., A.E.P., G.W., A.C.S., M.M.P.) ve Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi işbirlikçi eğitim ortaklığı Eli Lilly (G.W.T.N.) ile doktora öğrenciliği. APTrack’in geliştirilmesine katkıda bulunan tüm katılımcılara teşekkürlerimizi sunarız. Ayrıca mikronörografi deneylerine katılan gönüllülerimize ve Hasta ve Halkın Katılımı ve Katılımı işbirlikçilerimize paha biçilmez katkılarından dolayı teşekkür ederiz.

Materials

12V DC Power Supply  NA NA To power uStepper S-lite. Required for dial-controlled stimulators.
36 Pin Electrode Adapter Board Intan Technology C3410 APTrack Dependency. For connecting electrode input to headstage. $255 USD as of March 2021.
APTrack Plugin NA NA https://github.com/Microneurography/APTrack
Bipolar Ag/AgCl Recording Electrode Custom NA Recording electrode for the skin-nerve preparation. Or equivalent.
Bipolar Concentric Stimulating Electrode World Precision Instruments SNE-100 For electrical stimulation in the mouse skin-nerve preparation. Or equivalent.
Bipolar Transcutaneous Stimulating Electrode Custom NA For transcutaneous electrical stimulation while searching for single-neuron action potentials during microneurography.
BNC T Splitter (1+) NA NA APTrack Dependency. Any standard BNC T splitter.
BNC to BNC cables (3+) NA NA APTrack Dependency. Any standard BNC cables. 
C6H11NaO7 Merck S2054 Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
CaCl2 Merck C5670 Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
Digitimer DS4 Constant Current Stimulator Digitimer DS4 Constant current stiulator for animal research. £1,695 GBP as of September 2022. 
Digitimer DS7 Constant Current Stimulator Digitimer DS7A Constant current stiulator for human research. £3,400 GBP as of September 2022. 
Electroaccupuncture Classic Plus Stimulating Electrodes Harmony Medical NA For fixed position intradermal electrical stimulation of the dorsal aspect of the foot during human microneurography.
Glucose Fisher Scientific G/0450/60 Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
HDMI Cable NA NA APTrack Dependency. Any standard passive HMDI cable. To connect OE I/O Board to OE Acquisition Board.
KCl Merck P9541 Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
MgSO4 Acros Organics 213115000 Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
Mineral Oil Merck 330779 Electrical insulation for nerve recordings in th skin-nerve preparation. Or equivalent.
NaCl Merck S9888 Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
NaHCO3 Merck S6014 Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
NaHCO3 Merck S0751 Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
Open Ephys Acquisition Board Open Ephys NA APTrack Dependency. Includes USB cable to connect to computer and mains socket power supply. €2,955 EUR as of September 2022.
Open Ephys Graphical User Interface Open Ephys NA https://github.com/open-ephys/plugin-GUI
Open Ephys I/O Board Open Ephys NA APTrack Dependency. For ADC voltage inputs via BNC cables. €12.5 EUR without connectors, €85 EUR with connectors as of September 2022.
PulsePal V2 Sanworks 1102 APTrack Dependency. Open-source DAC and train generator. $725 USD pre-assembled as of September 2022. Approx. $275 USD for self-assembly.
RHD 6ft SPI Cable Intan Technology C3206 APTrack Dependency. For connecting headstage to OE Acquisition Board. $295 USD as of March 2021
RHD2216 16ch Bipolar Headstage Intan Technology C3313 APTrack Dependency. For data acquisition and digitization. $725 USD as of March 2021. Or equivalent RHD2000 series headstage.
Sucrose Fisher Scientific S/8560/60 Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
TCS-II Thermal Stimulator QST.Lab NA For thermal stimualtion of nociceptor receptive fields during human microneurography.
Tungsten Microelectrode Pair (Active + Reference) FHC 30085 For microneurography recordings. 35mm.
Ultrasound Scanner iQ+  Butterfly Network NA For ultrasound-guided electrode insertion during microneurography.
USB 3.0 5kV RMS Isolation Inota Technology 7055-D For isolating human microneuroography participant from computer. €459 EUR as of September 2022.
USB-A to micro USB-B cable (2) NA NA APTrack Dependency. To connect computer to PulsePal and to uStepper S-lite if using stepper-stimulator interfacing. 
uStepper S-lite + NEMA17 motor uStepper NA To interface with stimulators via a control dial. €50 EUR as of September 2022.
Von Frey Filaments Ugo Basile 37450-275 For mechanical stimulation of receptive fields during sensory phenotyping of nociceptors.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dubin, A. E., Patapoutian, A. Nociceptors: The sensors of the pain pathway. Journal of Clinical Investigation. 120 (11), 3760-3772 (2010).
  2. Serra, J., et al. Microneurographic identification of spontaneous activity in C-nociceptors in neuropathic pain states in humans and rats. Pain. 153 (1), 42-55 (2012).
  3. Serra, J., et al. Hyperexcitable C nociceptors in fibromyalgia. Annals of Neurology. 75 (2), 196-208 (2014).
  4. Namer, B., et al. Specific changes in conduction velocity recovery cycles of single nociceptors in a patient with erythromelalgia with the I848T gain-of-function mutation of Nav1.7. Pain. 156 (9), 1637-1646 (2015).
  5. Kleggetveit, I. P., et al. High spontaneous activity of C-nociceptors in painful polyneuropathy. Pain. 153 (10), 2040-2047 (2012).
  6. Orstavik, K., et al. Abnormal function of C-fibers in patients with diabetic neuropathy. Journal of Neuroscience. 26 (44), 11287-11294 (2006).
  7. Orstavik, K., et al. Pathological C-fibres in patients with a chronic painful condition. Brain. 126, 567-578 (2003).
  8. Raja, S. N., Ringkamp, M., Guan, Y., Campbell, J. N., John, J. Bonica Award Lecture: Peripheral neuronal hyperexcitability: The "low-hanging" target for safe therapeutic strategies in neuropathic pain. Pain. 161, S14-S26 (2020).
  9. Middleton, S. J., et al. Studying human nociceptors: From fundamentals to clinic. Brain. 144 (5), 1312-1335 (2021).
  10. Marshall, A., Alam, U., Themistocleous, A., Calcutt, N., Marshall, A. Novel and emerging electrophysiological biomarkers of diabetic neuropathy and painful diabetic neuropathy. Clinical Therapeutics. 43 (9), 1441-1456 (2021).
  11. Themistocleous, A. C., et al. Axonal excitability does not differ between painful and painless diabetic or chemotherapy-induced distal symmetrical polyneuropathy in a multicenter observational study. Annals of Neurology. 91 (4), 506-520 (2022).
  12. Bostock, H., Cikurel, K., Burke, D. Threshold tracking techniques in the study of human peripheral nerve. Muscle Nerve. 21 (2), 137-158 (1998).
  13. Kiernan, M. C., et al. Measurement of axonal excitability: Consensus guidelines. Clinical Neurophysiology. 131 (1), 308-323 (2020).
  14. Sauer, S. K., et al. Can receptor potentials be detected with threshold tracking in rat cutaneous nociceptive terminals. Journal of Neurophysiology. 94 (1), 219-225 (2005).
  15. Vallbo, A. B. Microneurography: How it started and how it works. Journal of Neurophysiology. 120 (3), 1415-1427 (2018).
  16. Torebjork, H., Hallin, R. A new method for classification of C-unit activity in intact human skin nerves. Advances in Pain Research and Therapy. 1, 29-34 (1976).
  17. Brown, G. L., Holmes, O. The effects of activity on mammalian nerve fibres of low conduction velocity. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 144 (918), 1-14 (1956).
  18. Obreja, O., et al. Patterns of activity-dependent conduction velocity changes differentiate classes of unmyelinated mechano-insensitive afferents including cold nociceptors, in pig and in human. Pain. 148 (1), 59-69 (2010).
  19. Serra, J., Campero, M., Ochoa, J., Bostock, H. Activity-dependent slowing of conduction differentiates functional subtypes of C fibres innervating human skin. Journal of Physiology. 515, 799-811 (1999).
  20. Weidner, C., Schmidt, R., Schmelz, M., Torebjork, H. E., Handwerker, H. O. Action potential conduction in the terminal arborisation of nociceptive C-fibre afferents. Journal of Physiology. 547, 931-940 (2003).
  21. Siegle, J. H., et al. Open Ephys: An open-source, plugin-based platform for multichannel electrophysiology. Journal of Neural Engineering. 14 (4), 045003 (2017).
  22. Sanders, J. I., Kepecs, A. A low-cost programmable pulse generator for physiology and behavior. Frontiers in Neuroengineering. 7, 43 (2014).
  23. Zimmermann, K., et al. Phenotyping sensory nerve endings in vitro in the mouse. Nature Protocols. 4 (2), 174-196 (2009).
  24. Dunham, J. P., Sales, A. C., Pickering, A. E. Ultrasound-guided, open-source microneurography: Approaches to improve recordings from peripheral nerves in man. Clinical Neurophysiology. 129 (11), 2475-2481 (2018).
  25. Levitt, H. Transformed up-down methods in psychoacoustics. Journal of the Acoustical Society of America. 49 (2), 467 (1971).
  26. Turnquist, B., RichardWebster, B., Namer, B. Automated detection of latency tracks in microneurography recordings using track correlation. Journal of Neuroscience Methods. 262, 133-141 (2016).
  27. Kiernan, M. C., Burke, D., Andersen, K. V., Bostock, H. Multiple measures of axonal excitability: A new approach in clinical testing. Muscle Nerve. 23 (3), 399-409 (2000).

Tags

Open-sourceReal-timeClosed-loopElectrical Threshold TrackingTranslational Pain ResearchNociceptor SensitizationAutomated Electrical Threshold TrackingNociceptor ExcitabilityBiomarkerAP TrackElectrophysiologyOptogeneticsAcquisition BoardIO BoardIntan RHD Recording HeadstagePulse PalConstant Current StimulatorStepper Motor Control BoardCustom Mounting BracketBarrel Adapter

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Nickerson, A. P., Newton, G. W. T., O’Sullivan, J. H., Martinez-Perez, M., Sales, A. C., Williams, G., Pickering, A. E., Dunham, J. P. Open-Source Real-Time Closed-Loop Electrical Threshold Tracking for Translational Pain Research. J. Vis. Exp. (194), e64898, doi:10.3791/64898 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image