온전한 심장 섬유주를 이용한 이완의 기계적 제어

다음 프로토콜은 Wayne State University의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 여기에서 프로토콜은 설치류 실험 대상을 활용하기 위한 단계를 설명하지만 다른 모델 유기체에서 사용하도록 조정할 수 있습니다. 1. 준비 실험 대상을 획득하고 실험실에 적응할 수 있도록 합니다. 250 mL의 관류 용액 및 250 mL의 변형된 티로드 용액(표 1)을 각각 10-20 ppm의O2, pH 7.3으로 산소화하여 준비한다. 캐뉼라가 부착된 5mL 주사기를 준비합니다. 주사기에 관류 용액을 채 웁니다. 마우스의 경우 23G, 작거나 큰 쥐의 경우 각각 18G 또는 16G의 캐뉼라를 사용하십시오. 뭉툭한 바늘 끝에 1mm 길이의 폴리에틸렌(PE) 튜브를 밀어 넣어 대동맥이 묶인 후 캐뉼라에서 미끄러지는 것을 방지합니다. 해부 및 캐뉼레이션 영역의 완전한 준비(그림 1)두 개의 깨끗한 계량 보트를 관류 용액으로 절반 이상 채웁니다. 캐뉼라 주위에 적어도 하나의 이중 루프 봉합사를 배치하여 캐뉼라의 끝을 관류 용액에 담그십시오. 바 클램프로 주사기를 제자리에 고정하십시오. 수술용 가위, 지혈제, 홍채 집게, 작은 구부러진 가위, #3 집게 2개를 쉽게 접근할 수 있도록 놓습니다. 실험 시스템 전체에 변형된 Tyrode의 용액을 프라이밍하고 순환시켜 실험 시스템(그림 2)을 준비합니다. 챔버가 완전히 가득 차고 안정적인지 확인하십시오. 힘 변환기, 길이 모터, 페이싱 시스템, 온도 제어 시스템 및 데이터 수집 컴퓨터를 포함한 모든 데이터 수집 상자를 켭니다. 현재 실험을 참조하는 데 필요한 *.dap 및 포인터 파일이 포함된 템플릿 폴더를 복사하고 이름을 바꿉니다. 데이터 수집 소프트웨어를 엽니다. 섬유주 분리 도구(Vannas 가위, #5 또는 #55 겸자, 유리 프로브)의 팁을 초순수 또는 관류 용액의 10%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)에 담그고 금속을 단백질로 코팅하여 준비합니다(그림 2B).참고: 해부 전에 전체 실험 시스템을 준비해야 합니다. 2. 심한 해부 및 캐뉼러 삽입 동물 피험자의 식별, 체중 및 기타 관련 정보를 기록합니다. 선택적으로 안락사 최소 10분 전에 복강내 주사를 통해 설치류에 멸균 식염수에 헤파린 1,000U/kg을 주사하여 관상동맥 관류 전 응고 위험을 최소화합니다. 동물을 유도실에 넣고 표준 절차에 따라 100% 산소에서 기화된 3%-5% 이소플루란을 사용하여 전신 마취를 유도합니다.알림: 이소플루란에 대한 노출을 최소화하는 데 사용되는 외부 청소부, 다운 드래프트 테이블 또는 흄 후드를 켭니다. 설치류가 교정 반사를 잃고 호흡 속도가 느려지면 :(쥐의 경우) 유도실에서 동물을 꺼내 해부 패드에 앙와위 놓고 코 콘을 통해 계속 마취합니다. (마우스의 경우) 유도 챔버로부터 동물을 제거한 직후 자궁 경부 탈구를 수행한다. 노즈 콘은 필요하지 않습니다. 이소플루란 기화기를 0%로 돌립니다. 필요한 경우 동물에 구멍을 뚫지 않도록 주의하면서 핀으로 지지되는 테이프를 사용하여 설치류의 상지를 흉벽에서 떨어진 해부 패드에 부착합니다. 해부를 진행하기 전에 적절한 마취 깊이(발가락 꼬집 반응 부족)를 확인하십시오. 자이포성 과정 바로 아래에 있는 수술용 가위(쥐의 경우 Mayo, 생쥐의 경우 Metzenbaum)를 사용하여 설치류의 복부 전체 너비를 가로질러 복막 공간으로 피부를 가로질러 자릅니다. 수술 용 가위를 사용하여 가로 절단에서 흉벽의 왼쪽과 오른쪽 모두에 두 개의 수직 절단 parasagittal (흉벽의 측면 위로)을 만듭니다. 그런 다음 횡격막을 가로질러 절단하여 시상 주위 절단을 연결하고 흉부 공간을 확보합니다. 설치류의 머리 쪽으로 지혈제를 사용하여 자염돌기를 고정하고 들어 올려 흉골과 흉벽을 설치류의 머리 쪽으로 움직여 흉부 공간과 심장을 노출시킵니다. 필요한 경우 시상주위 절개를 두 번째 척추 공간 근처로 빠르게 확장하여 심장을 완전히 노출시키거나 심낭 막을 파괴합니다. 구부러진 홍채 집게를 사용하여 심장을 조심스럽게 들어 올려 큰 혈관을 시각화합니다. 심근과 설치류의 척추 사이에 집게를 놓고 더 큰 혈관을 조이고 심방 또는 심실 부분을 조이지 않도록주의하면서 심장을 들어 올리십시오.심장을 약간 들어 올리면서 구부러진 홍채 집게와 설치류의 척추 사이에 구부러진 홍채 가위 (오목한 부분)를 빠르게 놓고 큰 혈관과 폐를 심장에서 잘라냅니다. 신선한 관류 용액이 들어 있는 계량 보트나 비커에 심장을 빠르게 옮기고 흔들어 심장에서 혈액을 제거합니다. 이소플루란 기화기를 아직 완료하지 않은 경우 0%로 돌립니다. 폐, 심낭 또는 기타 조직의 큰 부분이 심장에 붙어 있는 경우 캐뉼라 삽입 간섭을 최소화하기 위해 이 때 조심스럽게 잘라내어 버리십시오. 구부러진 홍채 집게를 사용하여 준비된 캐뉼라를 물에 담근 상태에서 심장을 깨끗한 계량 보트 또는 비커로 옮깁니다. 대동맥을 캐뉼러하고 고리가 있는 실크 봉합사를 조여 대동맥을 고정하고 최대 5mL의 관류 용액으로 씻어냅니다. 캐뉼라에서 심장을 제거하고 실리콘 엘라스토머 코팅 계량 접시에 넣어 섬유주 분리를 준비합니다. 3. 섬유주의 격리 및 평형 실리콘 엘라스토머 코팅 접시에 심장을 넣고 실체 현미경으로 비춥니다. 우심실 유출로를 찾습니다. 좌심방과 심실 정점을 접시의 실리콘 엘라스토머에 고정합니다. 긴 Vannas 가위를 사용하여 우심실 유출로에서 중격을 따라 정점까지 자릅니다. 우심실 유출로에서 대동맥 근처의 우심방으로 절개한 다음 우심방을 절단합니다(그림 3B). 집게를 사용하여 조직이 늘어나지 않도록 주의하면서 유출로에서 우심실(RV) 자유 벽을 조심스럽게 당겨 엽니다.참고: 실험자는 걱정 없이 절단할 수 있는 얇고 흰색 결합 조직 가닥을 찾을 수 있습니다. 더 큰 분홍색(조직) 색상의 가닥은 분리할 수 있는 섬유주일 수 있으므로 주의해서 평가해야 합니다. 우심실 삼각형의 자유 벽을 접시에 고정하여 우심실을 노출시킵니다(그림 3C). 얇은(직경 <500μm) 성형되었지만 끝이 날카롭지 않은 유리 피펫을 사용하여 노출된 심내막에서 독립형 섬유주를 검색합니다(그림 3C).참고: 독립형 섬유주는 그 아래를 완전히 조사할 수 있는 근육 조각입니다. 평행 한면 (일정한 너비)을 가진 섬유주를 사용하여 삼각형 유두 근육을 피하십시오. 이 과정과 후속 해부 과정에서 섬유주에 변형을 가하면 손상되어 전개된 힘이 감소할 수 있으므로 주의하십시오. 작은 Vannas 가위를 사용하여 섬유주를 해부합니다. 부착을 위해 섬유주의 양쪽 끝에 ≥1mm 입방체의 조직 조각을 남겨 둡니다. 가능하면 섬유주를 늘리지 말고 금속 도구의 접촉을 최소화하십시오. 식별된 섬유주 근처 근육의 긴장을 최소화하기 위해 필요에 따라 심장을 고정하는 핀을 재배치합니다. 2mL 이송 피펫의 끝에서 ~7인치를 자르고 섬유주를 피펫에 천천히 끌어들인 다음 50% 관류 용액과 50% 변형된 Tyrode 용액이 들어 있는 새 계량 접시에 옮깁니다. 근육이 몇 분 동안 혼합 용액 내에서 세포 외 칼슘의 증가와 평형을 이루도록 합니다.3.7-3.8단계를 반복하여 이 시점에서 추가 섬유주를 해부하여 백업으로 추가 섬유주를 얻습니다. 실험 챔버에 과융합 및/또는 흡입을 공급하는 펌프를 끕니다. 대구경 이송 피펫을 사용하여 섬유주를 Tyrode의 용액으로 채워진 실험 챔버로 옮깁니다. 섬유주 끝에 있는 >1mm 정육면체 조직 조각을 힘 변환기의 고리에 고정한 다음 두 번째 정육면체를 모터에 고정합니다.알림: 변환기에 더 잘 접근할 수 있도록 첫 번째 면을 장착할 때 모터와 힘 변환기를 분리한 다음 섬유주가 느슨한 상태에서 조직의 두 번째 큐브를 장착할 때 후크를 최대한 가깝게 이동합니다. 과융합을 다시 시작하고 근육의 속도를 조절하여 임계 전압을 결정합니다. 섬유주가 평형을 이루도록 약 1시간 동안 임계 전압보다 20% 높은 속도로 진행합니다. 이 평형 기간이 끝나면 발달 된 (최소에서 최고조까지) 장력을 관찰하여 최적의 발달 스트레스 생성이 달성 될 때까지 모터에 연결된 마이크로 미터를 사용하여 근육을 천천히 스트레칭합니다. 수동적 이완기 장력이 최대 장력보다 빠르게 상승하여 최적의 길이가 통과되었음을 나타내는 근육 길이 증가를 중지하십시오. 투과된 현미경 조명을 끄고 구즈넥 조명기를 사용하여 가파른 각도로 섬유주를 비춥니다. 이전에 보정된 현미경 광학 장치를 통해 연결된 카메라를 사용하여 확장기 동안 섬유주의 이미지를 실험 폴더에 캡처합니다. 섬유주가 카메라의 시야보다 넓은 경우 근육을 가로질러 여러 이미지를 촬영합니다. 픽셀 거리를 보고하는 이미징 소프트웨어에서 이미지를 엽니다.길이를 따라 근육 직경의 픽셀 거리를 4 번 측정합니다. 조직의 큰 입방체를 제외한 근육 (trabecula) 길이를 픽셀 단위로 측정하십시오. 근육 길이가 시야보다 길면 근육을 따라 기준점을 사용하여 전체 길이를 측정합니다. 실험 폴더의 템플릿을 사용하여 지름 측정값의 평균을 구하고 이전에 얻은 보정을 사용하여 지름과 길이를 픽셀에서 mm로 변환합니다. 단면적을 π*직경 2/4 in mm2로 계산하고 근육 길이를 μm 단위로 계산합니다. 4. 데이터 수집 근육이 평형을 이루면 데이터 수집 소프트웨어를 열고 실험 | 길이 제어를 선택하고 보정 상자에 보정된 섬유주 길이(FL)와 단면적(면적[m2])을 입력합니다. 템플릿 폴더(1.7단계)에서 freeform_file.txt 올바른 폴더를 가리키는지 확인하고 텍스트 편집기에서 freeform.dap 파일을 엽니다. *.dap 파일에서 등장성 수준(isoton)을 32,000으로 설정합니다. 길이 제어(Length Control) 상자에서 자유형(Freeform) 탭을 선택하고 적절한 자유형 목록 파일을 찾습니다. 데이터 파일링 경로도 데이터를 저장할 올바른 폴더인지 확인합니다. 비례 및 적분 이득 매개변수가 있는 피드백 컨트롤을 사용하여 로드 클램프 데이터를 수집하기 전에 Run Experiment를 눌러 완전 아이소메트릭 트위치에서 데이터 수집을 시작합니다. *.dap 파일에서 사후 하중(isoton)을 정의하여 하중 클램핑된 데이터를 수집하고, 텍스트 편집기에 파일을 저장하여 비례 이득(propgain) 및 적분(Ki) 파라미터의 값을 반복합니다. 데이터 수집 소프트웨어 인터페이스에서 Run Experiment 를 누릅니다.모드(flswitch)를 1에서 설정하고 로드 클램프(flthreshold)를 종료하기 위한 임계값을 0에서 늘림으로써 변형률의 최대 범위를 달성하기 위해 이 반복 중에 클램프가 원래 길이(이완 하중5라고도 함)로 다시 늘어나는 것을 포함하는지 확인합니다. 모드(flswitch)를 1에서 0으로 변경하여 load-cl의 끝을 제어합니다.amp. 로드 cl을 변경하면서 수집을 반복합니다.amp 제로 재연장에서 시작 길이로 다시 연장을 완료합니다.길이를 늘리려면 근육이 원래 길이로 거의 다시 늘어날 때까지 로드 클램프(flthreshold)를 종료하기 위한 임계값을 0에서 점진적으로 늘립니다. 모드(flswitch = 1) 및 임계값(flthreshold = 0)을 재설정하고 최종 데이터 수집을 한 번 실행합니다. 원하는 경우 4.4-4.6단계를 반복하여 스터디의 후하중을 수정합니다. 이 인수는 즉시 수행될 수 있습니다. 원하는 경우 근육을 늘리거나 줄여 예압을 수정하거나 Tyrode의 용액에 화합물을 추가하여 근육을 치료하십시오. 예압을 변경하거나 화합물을 추가하는 경우 저속 힘 응답20이 안정화되고 화합물이 근육에 완전히 침투할 때까지 최소 9,15분을 기다리십시오. 데이터 수집이 완료되면 섬유주를 제거합니다. 필요한 경우 생화학적 또는 조직학적 분석을 위해 섬유주를 동결하거나 고정합니다. 작업 영역과 실험 시스템을 청소하고 모든 튜브를 물로 세척하고 모든 구성 요소를 끕니다. 5. 데이터 분석 프로그램을 적절한 파일 경로로 보내 정량 분석 프로그램을 사용하여 데이터 파일을 엽니다. 데이터 분석 프로그램이 클램핑된 비트를 분석하고 프로그램이 부하 클램프의 시작을 올바르게 획득하는지 확인하여 이완을 정량화합니다.로드 클램프의 끝이 식별되어 이완률(1/τ)이 등척성 이완 중 응력의 피크 음의 도함수에서 정량화되도록 합니다. Glantz 방법(16)을 사용하여 이 지수 시간 상수 또는 이완의 다른 적절한 정량화(응력의 최소 미분, 로지스틱 시간 상수 17 또는 운동학적 모델18)를 결정합니다. 데이터 분석 프로그램이 변형률의 시간 도함수를 사용하여 변형률 속도를 계산하는지 확인합니다. 여기서 변형률은 최적 수축에서 시간을 길이로 나눈 함수로 길이를 계산합니다. 주어진 조건의 모든 추적에 대해 위의 단계를 반복합니다. 이완 속도와 변형률 속도 사이의 관계를 플로팅하여 최대 데이터를 1 s-1 미만의 생리학적 변형률로 제한합니다. 낮은 변형률 속도(그림 4C)에서 데이터는 제외하는데, 이는 완화 단계가 지수 감쇠를 반영하지 않을 수 있기 때문입니다17,18. 이완률과 변형률 사이의 선의 기울기를 구하고 기울기를 MCR의 지수로 기록합니다. 조사된 각 조건에 대해 위의 분석을 반복합니다.