使用完整的心脏小梁机械控制松弛

以下协议已获得韦恩州立大学机构动物护理和使用委员会的批准。这里的协议描述了利用啮齿动物实验对象的步骤，但可以适用于其他模式生物。 1. 准备 获得实验对象并使其适应实验室。 制备 250 mL 灌注溶液和 250 mL 改良的 Tyrode 溶液（表 1），将每个灌注溶液氧合至 10-20 ppm 的 O2，pH 7.3。 准备一个连接套管的 5 mL 注射器。用灌注溶液填充注射器。对小鼠使用23 G的插管，对小鼠或大鼠分别使用18或16 G的插管。在钝针的末端滑动 1 毫米长的聚乙烯 （PE） 管（材料表），以帮助防止主动脉在绑扎后从套管上滑落。 完全准备解剖和插管区域（图1）用灌注溶液填充两个干净的称重船至少一半。将套管的尖端浸入灌注溶液中，并在套管周围放置至少一条双环缝合线。用条夹将注射器固定到位。 放置手术剪刀、止血器、虹膜钳、一对小弯曲剪刀和两个 #3 镊子，以便于取用。 通过在整个实验系统中启动和循环改良的Tyrode溶液来制备实验系统（图2）。确保腔室完全充满且稳定。 打开所有数据采集盒，包括力传感器、长度电机、起搏系统、温度控制系统和数据采集计算机。 复制并重命名包含所需 *.dap 和指针文件的模板文件夹，以引用当前试验。打开数据采集软件。 准备小梁隔离工具（Vannas剪刀，#5或#55镊子，玻璃探针），方法是将其尖端浸入超纯水或灌注溶液中的10%（w / v）牛血清白蛋白（BSA）中，用蛋白质涂覆金属（图2B）。注意：整个实验系统必须在解剖前准备好。 2.大体解剖和插管 记录动物受试者的身份、体重等相关信息。 可选地，在安乐死前至少 10 分钟通过腹腔注射 向 啮齿动物注射 1，000 U/kg 无菌盐水中的肝素，以尽量减少冠状动脉灌注前凝血的风险。 根据标准程序，将动物置于诱导室中，并使用在100%氧气中蒸发的3%-5%异氟醚诱导全身麻醉。注意：打开任何用于尽量减少接触异氟醚的外部清除器、下风台或通风柜。 一旦啮齿动物失去矫正反射并且呼吸频率减慢：（对于大鼠）将动物从诱导室中取出并将其仰卧放在解剖垫上，通过鼻锥持续麻醉。 （对于小鼠）将动物从诱导室中取出后立即进行颈椎脱位。鼻锥不是必需的。将异氟醚蒸发器转到0%。 如果需要，使用由别针支撑的胶带将啮齿动物的上肢固定在远离胸壁的解剖垫上，注意不要刺穿动物。在进行解剖之前，检查适当的麻醉深度（缺乏脚趾捏反应）。 使用手术剪刀（大鼠蛋黄酱，小鼠梅岑鲍姆），就在木突下方，将啮齿动物腹部整个宽度的皮肤横向切入腹膜空间。 使用手术剪刀，从横向切口在胸壁的左侧和右侧进行两次垂直切口（胸壁两侧）。然后，穿过横膈膜，连接矢状旁切口，释放胸腔。 使用止血器夹紧并抬起木突朝啮齿动物的头部，将胸骨和胸壁向上移向啮齿动物的头部，露出胸腔和心脏。如果需要，迅速将矢状旁切口延伸至第二椎间隙附近，以完全暴露心脏和/或破坏心包膜。 使用弯曲的虹膜钳，小心地抬起心脏以可视化大血管。将镊子放在心肌和啮齿动物的脊柱之间，夹紧较大的血管，抬起心脏，注意不要夹住心房或心室段。在稍微抬起心脏的同时，迅速将弯曲的虹膜剪刀（向上凹陷）放在弯曲的虹膜镊子和啮齿动物的脊柱之间，并将大血管和肺从心脏上切开。快速将心脏移入装有新鲜灌注溶液的称重船或烧杯中，摇晃以帮助清除心脏上的血液。 将异氟烷蒸发器转到 0%，如果尚未完成。如果肺、心包或其他组织的大部分仍然附着在心脏上，此时请小心地切开并丢弃它们，以尽量减少对插管的干扰。 使用弯曲的虹膜钳，将心脏移动到干净的称重船或烧杯中，将准备好的套管浸没。套管主动脉，通过收紧环状丝线固定主动脉，并用多达 5 mL 的灌注溶液冲洗。 从套管中取出心脏，并将其放入涂有硅弹性体的称重盘中，以准备分离小梁。 3. 小梁的分离与平衡 将心脏放入体视显微镜下的有机硅弹性体涂层培养皿中并照亮它。 找到右心室流出道。将左心房和心室顶点固定在培养皿中的有机硅弹性体上。 使用长Vannas剪刀，沿隔从右心室流出道切到顶点。从右心室流出道切到主动脉附近的右心房，然后切开右心房（图3B）。 使用镊子，小心地从流出道拉开右心室（RV）游离壁，注意不要拉伸组织。注意：实验者可能会发现细而白色的结缔组织链，可以放心地切割。较大的粉红色（组织）色链应仔细评估，因为它们可能是可以分离的小梁。 将右心室三角形的自由壁固定在培养皿上，以暴露右心室（图3C）。 使用已熔化并形成薄（直径<500μm）但不锋利的玻璃移液管，在暴露的心内膜中搜索独立小梁（图3C）。注意：独立式小梁是一条肌肉，可以在下面完全探测。使用具有平行边（恒定宽度）的小梁，避免三角形肌。在此过程中和随后的解剖过程中要小心，因为对小梁施加应变会造成损伤，从而减少产生的力。 用小瓦纳斯剪刀解剖小梁。在小梁的每一端留一块 ≥1 毫米立方的组织以允许附着。尽可能不要拉伸小梁，并尽量减少金属工具的接触，因为两者都会对肌肉造成损害。根据需要重新定位固定心脏的销钉，以最大程度地减少对已识别小梁附近肌肉的压力。 从 7 mL 移液器的末端切下 ~2 英寸，将小梁慢慢拉入移液管中，然后将其转移到含有 50% 灌注溶液和 50% 改良 Tyrode 溶液的新称量盘中。让肌肉平衡到混合溶液中细胞外钙的增加几分钟。此时重复步骤3.7-3.8解剖其他小梁，以获取其他小梁作为备份。 关闭向实验室提供超流和/或抽吸的泵。使用大口径转移移液器，将小梁移动到充满Tyrode溶液的实验室中。 将小梁末端的一块 >1 mm 立方体组织固定到力传感器上的钩子上，然后将第二个立方体固定到电机上。注意：安装第一侧时，将电机和力传感器分开，以便更好地接近传感器，然后在安装第二个组织立方体时将钩子尽可能靠近，同时小梁保持松弛。 重新启动超级融合并开始起搏肌肉以确定阈值电压。以高于阈值电压20%的速度行驶约1小时，以使小梁平衡。 在这个平衡期结束时，通过观察发展（最小到峰值）张力，使用连接到电机的千分尺缓慢拉伸肌肉，直到达到最佳应力生成。当被动舒张张力上升速度快于峰值张力时，停止增加肌肉长度，表明已通过最佳长度。 关闭透射显微镜照明，并使用鹅颈照明器以陡峭的角度照亮小梁。使用通过先前校准的显微镜光学元件连接的相机，将舒张期间的小梁图像捕获到实验文件夹中。如果小梁比相机的视野宽，请在肌肉上拍摄多张图像。 在报告像素距离的成像软件中打开图像。测量肌肉直径沿其长度四倍的像素距离。以像素为单位测量肌肉（小梁）长度，不包括大立方体组织。 如果肌肉长度长于视野，请使用沿肌肉的参考点来测量整个长度。 使用实验文件夹中的模板，平均直径测量值，并使用先前获得的校准将直径和长度从像素转换为毫米。计算横截面积为 π*直径 2/4 以 mm2 为单位，肌肉长度以 μm 为单位。 4. 数据采集 肌肉平衡后，打开数据采集软件，选择 实验 |长度控制，然后在校准框中输入校准的小梁长度 （FL） 和横截面积（面积 [m 2]）。 从模板文件夹（步骤 1.7）中，确保freeform_file.txt指向正确的文件夹，然后在文本编辑器中打开 freeform.dap 文件。在 *.dap 文件中将等渗级别（等值）设置为 32，000。 在“长度控制”框中，选择“自由格式”选项卡并浏览到相应的“ 自由格式 ”列表文件。确保数据归档路径也是保存数据的正确文件夹。通过按 Run Experiment 开始从完全等距抽搐中获取数据，然后使用具有比例和积分增益参数的反馈控制获取负载钳位数据。 通过在 *.dap 文件中定义后载荷（等值子）来获取负载钳位数据，并通过在文本编辑器中保存文件来迭代比例增益 （propgain） 和积分 （Ki） 参数的值。在数据采集软件界面中按 运行实验 。确保夹具包括在此迭代期间重新延长回其原始长度（有时称为松弛载荷5），以达到最大应变率范围，方法是将模式 （flswitch） 从 1 开始，并将结束载荷钳位的阈值（flthreshold）从零增加。 通过将模式（flswitch）从1更改为零来控制负载钳位的末端。重复采集，同时将负载钳的末端从零重新延长更改为完全重新延长回起始长度。要增加长度，请逐渐增加结束负荷钳夹（flthreshold）的阈值，从零开始，直到肌肉几乎重新拉长到原来的长度。 重置模式（flswitch = 1）和阈值（flthreshold = 0），然后运行一次最终数据采集。 如果需要，通过重复步骤4.4-4.6来修改研究中的余载荷。此次收购可能会立即完成。 如果需要，通过拉伸或缩短肌肉来改变预紧力，或者通过在 Tyrode 溶液中添加化合物来治疗肌肉。如果改变预载荷或添加化合物，请等待至少 20 分钟以确保慢力响应9，15 已稳定和/或化合物完全穿透肌肉。 数据采集完成后，去除小梁。如果需要，冷冻或固定小梁以进行生化或组织学分析。 清洁工作区域和实验系统，用水冲洗所有管道，并关闭所有组件。 5. 数据分析 通过将程序定向到适当的文件路径，使用定量分析程序打开数据文件。 通过确保数据分析程序分析钳位节拍，并且程序正确获取负载钳位的开始来量化松弛。确保确定负载钳的末端，以便根据等长松弛期间应力的峰值负导数量化松弛率（1/τ）。 使用格兰茨方法16 来确定该指数时间常数，或其他适当的松弛量化（应力的最小导数，逻辑时间常数17或运动学模型18）。 确保数据分析程序通过取应变的时间导数来计算应变率，其中应变计算为长度作为时间的函数除以最佳收缩处的长度。 对给定条件的所有跟踪重复上述步骤。 绘制松弛率和应变率之间的关系，将最大数据限制为小于 1 s-1 的生理应变率。排除低应变率下的数据（图4C），因为弛豫阶段可能无法反映指数衰减17，18。 获取松弛率与应变率之间的直线斜率，并将斜率记录为MCR的指标。 对询问的每个条件重复上述分析。