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环境科学

ゼブラフィッシュ胚および肝臓細胞株のスフェロイドの3D培養法

Published: January 20, 2023
doi:
10.3791/64859
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1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics,Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department,Grupo Boticário, 3Department of Cell Biology,Federal University of Paraná (UFPR), 4Department of Genetics,Federal University of Paraná (UFPR)

Summary

ここでは、2つのゼブラフィッシュ(ダニオレリオ)細胞株、ZEM2S(胚)とZFL(正常肝細胞)のスフェロイドを形成するための効果的で簡単かつ高速な3D培養プロトコルを紹介します。

Abstract

魚細胞株は、生態毒性評価のための 有望なin vitro モデルです。しかしながら、従来の単層培養系(2D培養)には周知の制限(例えば、培養寿命およびいくつかの in vivo 細胞機能の維持)がある。したがって、スフェロイドなどの3D培養物が提案されており、これらのモデルは組織様構造を再現できるため、 in vivo 条件をよりよく再キャプチャできます。この記事では、2つのゼブラフィッシュ(Danio rerio)細胞株であるZEM2S(胚)とZFL(正常肝細胞)を使用してスフェロイドを形成するための効果的、簡単、高速の3D培養プロトコルについて説明します。このプロトコルは、丸底の超低アタッチメント96ウェルプレートに細胞をプレーティングすることで構成されています。軌道振盪(70rpm)下で5日後、ウェル当たり単一のスフェロイドが形成される。形成されたスフェロイドは安定したサイズと形状を示し、この方法はウェル内で複数のスフェロイドが形成されるのを回避します。したがって、同様のサイズのスフェロイドを手で選ぶ必要はありません。このスフェロイド法の容易さ、速度、再現性により、ハイスループット のin vitro 試験に役立ちます。

Introduction

スフェロイドは、細胞を3D培養で細胞間密接な接触で培養するときに形成される細胞の小さな球体です。インビボ組織環境を模倣するスフェロイドの能力は、様々な細胞株および初代細胞において既に研究されている1,2。しかし、スフェロイドは哺乳類毒性試験用に十分に開発されていますが、非哺乳類脊椎動物(魚類など)での毒性試験用のスフェロイドの開発はまだ進行中です3。魚類細胞株の場合、スフェロイドは、異なるタイプのウェルプレート3、4、5、6、7を用いた軌道振動(OS)や、磁性ナノ粒子8を用いた磁気浮上法など、さまざまな方法で開発されてきました。ただし、スフェロイドのこれらの培養方法のいくつかは、他の方法よりも不利な点がある可能性があります。

例えば、大型マイクロプレート(24ウェルプレート)での旋回法では、サイズと形状が異なる多数のスフェロイドが生成される可能性があります。実際、多重スフェロイド構造形成が実証されている7。これには、実験のために同じサイズと形状の回転楕円体を厳選するための多大な努力が必要です。ハンギングドロップ3D培養法は、哺乳類細胞株1,2,9,10,11のスフェロイドを生成するために一般的に使用され、それによって、ドロップあたり単一のスフェロイドを生成することができ、上記の問題を回避することができる。しかしながら、修正されたハンギングドロップ法(ハンギングドロップ+軌道振動)は、安価な方法を用いてZFLスフェロイドを生成することができるが、欠点がある12。形成された細胞凝集体は、滴内で長期間維持することはできません。したがって、それらはウェルプレートに移される必要があります。このプロセスは、マイクロピペット12を用いて滴下して行われるため、層流フード内での激しい取り扱いおよび長時間の作業を必要とする。また、この方法では、ZFLスフェロイドを完全に形成するのに10日(ハンギングドロップで5日+OSで5日)12を要します。これらの欠点は、特に化学物質の優先順位付けと製品の持続可能性のための潜在的なアプリケーションを考慮すると、毒性試験のための3D魚スフェロイドの適用を制限する可能性があります。

したがって、この記事では、96ウェルの超低接着プレート(ULAプレート)とオービタルシェーカー(回転直径22 mm)の併用に基づいて、ZFL(D.レリオ 正常肝細胞)およびZEM2S(D.レリオ 胞胚期胚)細胞株の単一スフェロイドを生成できる3D培養プロトコルについて説明します。適用された方法は簡単で再現性があり、短期間(5日間)で同様のサイズと形状のスフェロイドを大量に生成できます。この方法の利点は、産業界と学界の両方での水生毒性研究への魚の3Dモデルの適用、および生態毒性試験の代替方法の実装の進歩をサポートすることができます。

Protocol

丸底96ウェルプレートでZFLおよびZEM2S細胞株の3Dスフェロイドを生成するための重要なステップを 図1に示します。 注:このプロトコルで使用されるすべての材料に関連する詳細については、 材料の 表を、このプロトコルで使用される溶液と培地については 表1 を参照してください。 1. 細胞培養培地…

Representative Results

安定したサイズおよび形状を有するウェル当たり単一のスフェロイドがこの方法によって形成される。図2は、軌道振とう(70rpm)下でのULAプレートのウェルにおけるZFLおよびZEM2S細胞の単一スフェロイドの形成過程を示す。ZFL細胞株とZEM2S細胞株は、3D培養において異なる挙動を示します。ZEM2S細胞株は、眼窩振盪の初日からスフェロイド形状を容易に形成する能力を付与す…

Discussion

これは、ゼブラフィッシュの肝臓および胚細胞株のスフェロイドを生成するための簡単、簡単、かつ迅速な方法です。この方法は、スフェロイド形成に関連する科学的研究で報告された問題、および3Dスフェロイドアッセイからのデータ精度の不確実性を克服するために、既存の3Dスフェロイド法の修正に基づいてこのグループによって開発されました。例えば、報告された問題は、取り扱い…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品の共著者であり、化粧品の分野で優れた研究者であり、ブラジルでの化粧品研究の促進に専念しているマルシオ・ロレンチーニ博士を記念して。著者らは、生理学部(UFPR)のマルチユーザーラボに、機器の入手可能性と、高等教育要員の改善のための調整(CAPES、ブラジル)(財務コード001)およびGrupo Boticárioの財政的支援に感謝しています。

Materials

96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile Corning 7007
DMEM, powder, high glucose, pyruvate Gibco 12800-017
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder Gibco 21700026
HEPES (1M) Gibco 15630080
Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software  National
Institutes of Health, USA		 Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Leibovitz's L-15 Medium, powder Gibco 41300021
Orbital shaker  Warmnest KLD-350-BI 22 mm rotation diameter
Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium Invitrogen 14080055
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
RPMI 1640 Medium Gibco 31800-014
FBS – Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions Gibco 12657-029
Sodium bicarbonate, powder,  bioreagent for molecular biology Sigma-Aldrich S5761
Trypan blue stain (0,4%) Gibco 15250-061
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054
ZEM2S cell line ATCC CRL-2147 This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J.
Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
ZFL cell line BCRJ 256
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References

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de Souza, I. R., Micali Canavez, A. D. P., Schuck, D. C., Costa Gagosian, V. S., de Souza, I. R., de Albuquerque Vita, N., da Silva Trindade, E., Cestari, M. M., Lorencini, M., Leme, D. M. A 3D Culture Method of Spheroids of Embryonic and Liver Zebrafish Cell Lines. J. Vis. Exp. (191), e64859, doi:10.3791/64859 (2023).
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