Método de Cultura 3D de Esferoides de Linhagens Celulares de Zebrafish Embrionárias e Hepáticas
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo de cultura 3D eficaz, fácil e rápido para a formação de esferoides de duas linhagens celulares de zebrafish (Danio rerio): ZEM2S (embrião) e ZFL (hepatócito normal).
Abstract
Linhagens celulares de peixes são modelos in vitro promissores para avaliação de ecotoxicidade; no entanto, os sistemas convencionais de cultura monocamada (cultura 2D) têm limitações bem conhecidas (por exemplo, longevidade da cultura e manutenção de algumas funções celulares in vivo ). Assim, culturas 3D, como os esferoides, têm sido propostas, uma vez que esses modelos podem reproduzir estruturas semelhantes a tecidos, recapturando melhor as condições in vivo . Este artigo descreve um protocolo de cultura 3D eficaz, fácil e rápido para a formação de esferoides com duas linhagens celulares de zebrafish (Danio rerio): ZEM2S (embrião) e ZFL (hepatócito normal). O protocolo consiste em plaquear as células em uma placa de fundo redondo, ultrabaixa e de 96 poços. Após 5 dias sob agitação orbital (70 rpm), um único esferoide por poço é formado. Os esferoides formados apresentam tamanho e forma estáveis, e este método evita a formação de múltiplos esferoides em um poço; assim, não é necessário escolher esferoides de tamanhos semelhantes. A facilidade, velocidade e reprodutibilidade deste método esferoide o tornam útil para testes in vitro de alto rendimento.
Introduction
Esferoides são pequenas esferas de células formadas quando as células são cultivadas em contato próximo célula a célula em cultura 3D. A capacidade dos esferoides de mimetizar o ambiente tecidual in vivo já foi estudada em uma variedade de linhagens celulares e célulasprimárias1,2. No entanto, embora os esferoides estejam bem desenvolvidos para estudos de toxicidade em mamíferos, o desenvolvimento de esferoides para estudos de toxicidade com vertebrados não mamíferos (por exemplo, peixes) ainda está em andamento3. Para linhagens celulares de peixes, esferoides têm sido desenvolvidos por uma variedade de métodos diferentes, como o orbital shaking (OS) usando diferentes tipos de placas de poço3,4,5,6,7, e o método de levitação magnética usando nanopartículas magnéticas8. No entanto, alguns desses métodos de cultivo para esferoides podem ter mais desvantagens do que outros.
Por exemplo, métodos giratórios em microplacas grandes (placas de 24 poços) podem gerar um alto número de esferoides diferindo em tamanho e forma; De fato, a formação de estruturas multiesferóides tem sido demonstrada7. Isso requer esforços intensos para escolher esferoides com tamanho e forma semelhantes para um experimento. O método de cultura 3D em gota suspensa é comumente utilizado para geração de esferoides de linhagens celulares de mamíferos 1,2,9,10,11, onde esferoides únicos por gota podem ser gerados, evitando os problemas descritos acima. No entanto, embora um método de queda suspensa modificado (queda suspensa + agitação orbital) seja capaz de gerar esferoides ZFL usando um método barato, ele tem suas desvantagens12. Os agregados celulares formados não podem ser mantidos por longos períodos nas gotas; assim, eles precisam ser transferidos para placas de poço. Esse processo requer manuseio intenso e longos períodos de trabalho em capela de fluxo laminar, pois é realizado em gota a gota com o uso de uma micropipeta12. Além disso, esse método requer 10 dias para formar completamente os esferoides ZFL (5 dias em gota suspensa + 5 dias em EO)12. Essas desvantagens podem limitar a aplicação de esferoides de peixes 3D para testes de toxicidade, especialmente considerando potenciais aplicações para priorização química e sustentabilidade do produto.
Assim, este artigo descreve um protocolo de cultura 3D capaz de gerar esferoides únicos de linhagens celulares ZFL (D. rerio hepatócito normal) e ZEM2S (embrião fase blastula de D. rerio) baseado no uso combinado de placas de fixação ultrabaixas de 96 poços (placas ULA) e um agitador orbital (22 mm de diâmetro rotacional). O método aplicado é simples e reprodutível, podendo gerar um grande número de esferoides de tamanho e forma semelhantes em um curto período (5 dias). As vantagens deste método podem apoiar a aplicação de modelos 3D de peixes para estudos de toxicidade aquática na indústria e no meio acadêmico, bem como o progresso da implementação de métodos alternativos para testes de ecotoxicidade.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este é um método simples, fácil e rápido para gerar esferoides de linhagens celulares de fígado e embrião de peixe-zebra. Este método foi desenvolvido por este grupo com base em modificações de métodos esferoides 3D existentes para superar problemas relatados em estudos científicos relacionados à formação de esferoides, bem como incertezas na precisão dos dados de ensaios esferoides 3D. Por exemplo, os problemas relatados residem nas dificuldades de manuseio, na demora na geração de esferoides, na necess…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Em memória do Dr. Márcio Lorencini, coautor deste trabalho, excelente pesquisador na área de cosméticos e dedicado a promover a pesquisa cosmética no Brasil. Os autores agradecem ao Laboratório Multiusuário do Departamento de Fisiologia (UFPR) pela disponibilidade dos equipamentos e pelo apoio financeiro da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Brasil) (Código Financeiro 001) e do Grupo Boticário.
Materials
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 7007 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software | National Institutes of Health, USA |
Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz's L-15 Medium, powder | Gibco | 41300021 | |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | |
| FBS – Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Sodium bicarbonate, powder, bioreagent for molecular biology | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Trypan blue stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
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