Un metodo di coltura 3D di sferoidi di linee cellulari embrionali e epatiche di zebrafish
Summary
Qui, presentiamo un protocollo di coltura 3D efficace, facile e veloce per la formazione di sferoidi di due linee cellulari di zebrafish (Danio rerio): ZEM2S (embrione) e ZFL (epatocita normale).
Abstract
Le linee cellulari di pesce sono promettenti modelli in vitro per la valutazione dell’ecotossicità; tuttavia, i sistemi di coltura monostrato convenzionali (coltura 2D) hanno limitazioni ben note (ad esempio, la longevità della coltura e il mantenimento di alcune funzioni cellulari in vivo ). Pertanto, sono state proposte colture 3D, come gli sferoidi, poiché questi modelli possono riprodurre strutture simili a tessuti, ricatturando meglio le condizioni in vivo . Questo articolo descrive un protocollo di coltura 3D efficace, facile e veloce per la formazione di sferoidi con due linee cellulari di zebrafish (Danio rerio): ZEM2S (embrione) e ZFL (epatocita normale). Il protocollo consiste nel placcare le celle in una piastra a 96 pozzetti con attacco a fondo tondo, ultra-basso. Dopo 5 giorni sotto scuotimento orbitale (70 giri / min), si forma un singolo sferoide per pozzetto. Gli sferoidi formati presentano dimensioni e forma stabili, e questo metodo evita la formazione di più sferoidi in un pozzo; Pertanto, non è necessario selezionare a mano sferoidi di dimensioni simili. La facilità, la velocità e la riproducibilità di questo metodo sferoidale lo rendono utile per test in vitro ad alta produttività.
Introduction
Gli sferoidi sono piccole sfere di cellule formate quando le cellule vengono coltivate in stretto contatto cellula-cellula in coltura 3D. La capacità degli sferoidi di imitare l’ambiente tissutale in vivo è già stata studiata in una varietà di linee cellulari e cellule primarie 1,2. Tuttavia, sebbene gli sferoidi siano ben sviluppati per gli studi di tossicità sui mammiferi, lo sviluppo di sferoidi per studi di tossicità con vertebrati non mammiferi (ad esempio pesci) è ancora in corso3. Per le linee cellulari di pesce, gli sferoidi sono stati sviluppati con una varietà di metodi diversi, come lo scuotimento orbitale (OS) utilizzando diversi tipi di piastre di pozzo 3,4,5,6,7 e il metodo di levitazione magnetica che utilizza nanoparticelle magnetiche 8. Tuttavia, alcuni di questi metodi di coltura per gli sferoidi possono avere più svantaggi di altri.
Ad esempio, i metodi giratori in micropiastre di grandi dimensioni (piastre a 24 pozzetti) possono generare un numero elevato di sferoidi diversi per dimensioni e forma; In effetti, è stata dimostrata la formazione di strutture multi-sferoidi7. Ciò richiede sforzi intensi per selezionare a mano sferoidi con dimensioni e forma simili per un esperimento. Il metodo di coltura 3D a goccia sospesa è comunemente usato per generare sferoidi di linee cellulari di mammifero 1,2,9,10,11, per cui possono essere generati singoli sferoidi per goccia, evitando i problemi sopra descritti. Tuttavia, sebbene un metodo di goccia sospesa modificato (goccia sospesa + scuotimento orbitale) sia in grado di generare sferoidi ZFL utilizzando un metodo economico, ha i suoi svantaggi12. Gli aggregati cellulari formati non possono essere mantenuti per lunghi periodi nelle gocce; Pertanto, devono essere trasferiti in piastre di pozzo. Questo processo richiede una manipolazione intensa e lunghi periodi di lavoro in una cappa a flusso laminare, poiché viene eseguito a goccia utilizzando una micropipetta12. Inoltre, questo metodo richiede 10 giorni per formare completamente gli sferoidi ZFL (5 giorni in goccia sospesa + 5 giorni in OS)12. Questi svantaggi possono limitare l’applicazione di sferoidi di pesce 3D per i test di tossicità, soprattutto considerando le potenziali applicazioni per la prioritizzazione chimica e la sostenibilità del prodotto.
Pertanto, questo articolo descrive un protocollo di coltura 3D in grado di generare singoli sferoidi di ZFL (Epatocita normale D. rerio) e ZEM2S (embrione fase D. rerio blastula ) basato sull’uso combinato di piastre di attacco ultra-basse a 96 pozzetti (piastre ULA) e uno shaker orbitale (diametro rotazionale 22 mm). Il metodo applicato è semplice e riproducibile e può generare un numero elevato di sferoidi di dimensioni e forma simili in un breve periodo (5 giorni). I vantaggi di questo metodo possono supportare l’applicazione di modelli 3D di pesci per studi di tossicità acquatica sia nell’industria che nel mondo accademico, nonché il progresso dell’implementazione di metodi alternativi per i test di ecotossicità.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo è un metodo semplice, facile e veloce per generare sferoidi di fegato zebrafish e linee cellulari embrionali. Questo metodo è stato sviluppato da questo gruppo sulla base di modifiche dei metodi sferoidi 3D esistenti per superare i problemi riportati negli studi scientifici relativi alla formazione di sferoidi, nonché le incertezze nell’accuratezza dei dati dai saggi sferoidi 3D. Ad esempio, i problemi segnalati risiedono nelle difficoltà di manipolazione, nella natura dispendiosa in termini di tempo della gen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
In memoria del Dr. Márcio Lorencini, coautore di questo lavoro, eccellente ricercatore nel campo della cosmesi e dedito alla promozione della ricerca cosmetica in Brasile. Gli autori sono grati al Laboratorio Multiutente del Dipartimento di Fisiologia (UFPR) per la disponibilità delle attrezzature e per il sostegno finanziario del Coordinamento per il miglioramento del personale dell’istruzione superiore (CAPES, Brasile) (Codice finanziario 001) e del Grupo Boticário.
Materials
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 7007 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software | National Institutes of Health, USA |
Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz's L-15 Medium, powder | Gibco | 41300021 | |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | |
| FBS – Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Sodium bicarbonate, powder, bioreagent for molecular biology | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Trypan blue stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
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