JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
环境科学

Een 3D-kweekmethode van sferoïden van embryonale en lever zebraviscellijnen

Published: January 20, 2023
doi:
10.3791/64859
, , , , , , , , ,
1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics,Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department,Grupo Boticário, 3Department of Cell Biology,Federal University of Paraná (UFPR), 4Department of Genetics,Federal University of Paraná (UFPR)

Summary

Hier presenteren we een effectief, eenvoudig en snel 3D-kweekprotocol voor de vorming van sferoïden van twee zebravissen (Danio rerio) cellijnen: ZEM2S (embryo) en ZFL (normale hepatocyt).

Abstract

Viscellijnen zijn veelbelovende in vitro modellen voor ecotoxiciteitsbeoordeling; conventionele monolaagcultuursystemen (2D-cultuur) hebben echter bekende beperkingen (bijv. Levensduur van de cultuur en behoud van sommige in vivo cellulaire functies). Zo zijn 3D-culturen, zoals sferoïden, voorgesteld, omdat deze modellen weefselachtige structuren kunnen reproduceren, waardoor de in vivo omstandigheden beter worden heroverd. Dit artikel beschrijft een effectief, eenvoudig en snel 3D-kweekprotocol voor de vorming van sferoïden met twee zebravissen (Danio rerio) cellijnen: ZEM2S (embryo) en ZFL (normale hepatocyt). Het protocol bestaat uit het plateren van de cellen in een ronde bodem, ultra-lage aanhechting, 96-well plaat. Na 5 dagen onder orbitaal schudden (70 rpm) wordt een enkele sferoïde per put gevormd. De gevormde sferoïden hebben een stabiele grootte en vorm, en deze methode voorkomt de vorming van meerdere sferoïden in een put; Het is dus niet nodig om sferoïden van vergelijkbare grootte met de hand te selecteren. Het gemak, de snelheid en de reproduceerbaarheid van deze sferoïde methode maken het nuttig voor high-throughput in vitro tests.

Introduction

Sferoïden zijn kleine bolletjes cellen die worden gevormd wanneer cellen worden gekweekt in nauw cel-tot-celcontact in 3D-cultuur. Het vermogen van sferoïden om de in vivo weefselomgeving na te bootsen is al bestudeerd in een verscheidenheid aan cellijnen en primaire cellen 1,2. Hoewel sferoïden goed ontwikkeld zijn voor toxiciteitsstudies bij zoogdieren, is de ontwikkeling van sferoïden voor toxiciteitsstudies met gewervelde dieren van niet-zoogdieren (bijv. vissen) nog steeds aan de gang3. Voor viscellijnen zijn sferoïden ontwikkeld met behulp van verschillende methoden, zoals orbitaal schudden (OS) met behulp van verschillende soorten putplaten 3,4,5,6,7, en de methode van magnetische levitatie met behulp van magnetische nanodeeltjes8. Sommige van deze kweekmethoden voor sferoïden kunnen echter meer nadelen hebben dan andere.

Tolmethoden in grote microplaten (24-putplaten) kunnen bijvoorbeeld een groot aantal sferoïden genereren die verschillen in grootte en vorm; Inderdaad, multi-sferoïde structuurvorming is aangetoond7. Dit vereist intense inspanningen om sferoïden met een vergelijkbare grootte en vorm met de hand te selecteren voor een experiment. De hanging drop 3D-cultuurmethode wordt vaak gebruikt voor het genereren van sferoïden van zoogdiercellijnen 1,2,9,10,11, waarbij enkele sferoïden per druppel kunnen worden gegenereerd, waardoor de hierboven beschreven problemen worden vermeden. Hoewel een aangepaste hangende druppelmethode (hangende druppel + orbitaal schudden) in staat is om ZFL-sferoïden te genereren met behulp van een goedkope methode, heeft het zijn nadelen12. De gevormde cellulaire aggregaten kunnen niet gedurende lange perioden in de druppels worden bewaard; ze moeten dus worden overgebracht naar putplaten. Dit proces vereist intensieve hantering en lange perioden van werk in een laminaire stromingskap, omdat het druppelsgewijs wordt uitgevoerd met behulp van een micropipette12. Bovendien vereist deze methode 10 dagen om de ZFL-sferoïden volledig te vormen (5 dagen in hangende druppel + 5 dagen in OS)12. Deze nadelen kunnen de toepassing van 3D-vissferoïden voor toxiciteitstests beperken, vooral gezien mogelijke toepassingen voor chemische prioritering en productduurzaamheid.

Zo beschrijft dit artikel een 3D-kweekprotocol dat in staat is om enkele sferoïden van ZFL (D. rerio normale hepatocyt) en ZEM2S (D. rerio blastula fase embryo) cellijnen te genereren op basis van het gecombineerde gebruik van 96-well, ultra-lage bevestigingsplaten (ULA-platen) en een orbitale shaker (22 mm rotatiediameter). De toegepaste methode is eenvoudig en reproduceerbaar en kan in een korte periode (5 dagen) grote aantallen sferoïden van vergelijkbare grootte en vorm genereren. De voordelen van deze methode kunnen de toepassing van 3D-modellen voor aquatische toxiciteitsstudies in zowel de industrie als de academische wereld ondersteunen, evenals de voortgang van de implementatie van alternatieve methoden voor ecotoxiciteitstests.

Protocol

De belangrijkste stappen voor het genereren van 3D-sferoïden van ZFL- en ZEM2S-cellijnen in een ronde bodem met 96-putplaat worden weergegeven in figuur 1. OPMERKING: Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen die in dit protocol worden gebruikt en Tabel 1 voor oplossingen en kweekmedia die in dit protocol worden gebruikt. 1. Celkweekmedium en monolaagculturen<…

Representative Results

Enkele sferoïden per put met een stabiele grootte en vorm worden door deze methode gevormd. Figuur 2 illustreert het vormingsproces van enkele sferoïden van ZFL- en ZEM2S-cellen in een put van een ULA-plaat onder orbitaal schudden (70 rpm). De ZFL- en ZEM2S-cellijnen hebben verschillende gedragingen in 3D-cultuur. De ZEM2S-cellijn vertoont kenmerken die het vermogen verlenen om gemakkelijk een bolvorm te vormen sinds de eerste dag van het orbitale schudden (figuur 2E</…

Discussion

Dit is een eenvoudige, gemakkelijke en snelle methode voor het genereren van sferoïden van zebravislever en embryonale cellijnen. Deze methode is ontwikkeld door deze groep op basis van modificaties van bestaande 3D-sferoïdemethoden om problemen te overwinnen die zijn gemeld in wetenschappelijke studies met betrekking tot sferoïdevorming, evenals onzekerheden in de nauwkeurigheid van gegevens van 3D-sferoïde-assays. De gemelde problemen liggen bijvoorbeeld in moeilijkheden bij de hantering, de tijdrovende aard van he…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ter nagedachtenis aan Dr. Márcio Lorencini, een co-auteur van dit werk, een uitstekende onderzoeker op het gebied van cosmetica en toegewijd aan het bevorderen van cosmetisch onderzoek in Brazilië. De auteurs zijn het Multi-user Laboratory in de afdeling Fysiologie (UFPR) dankbaar voor de beschikbaarheid van apparatuur en voor de financiële steun van de Coördinatie voor de Verbetering van het Personeel van het Hoger Onderwijs (CAPES, Brazilië) (Finance Code 001) en de Grupo Boticário.

Materials

96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile Corning 7007
DMEM, powder, high glucose, pyruvate Gibco 12800-017
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder Gibco 21700026
HEPES (1M) Gibco 15630080
Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software  National
Institutes of Health, USA		 Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Leibovitz's L-15 Medium, powder Gibco 41300021
Orbital shaker  Warmnest KLD-350-BI 22 mm rotation diameter
Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium Invitrogen 14080055
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
RPMI 1640 Medium Gibco 31800-014
FBS – Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions Gibco 12657-029
Sodium bicarbonate, powder,  bioreagent for molecular biology Sigma-Aldrich S5761
Trypan blue stain (0,4%) Gibco 15250-061
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054
ZEM2S cell line ATCC CRL-2147 This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J.
Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
ZFL cell line BCRJ 256
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033 (2019).
  2. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnology and Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).
  3. Baron, M. G., Purcell, W. M., Jackson, S. K., Owen, S. F., Jha, A. N. Towards a more representative in vitro method for fish ecotoxicology: morphological and biochemical characterisation of three-dimensional spheroidal hepatocytes. Ecotoxicology. 21 (8), 2419-2429 (2012).
  4. Alves, R. F., Rocha, E., Madureira, T. V. Fish hepatocyte spheroids – A powerful (though underexplored) alternative in vitro model to study hepatotoxicity. Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology. 262, 109470 (2022).
  5. Baron, M. G., et al. Pharmaceutical metabolism in fish: using a 3-D hepatic in vitro model to assess clearance. PloS One. 12 (1), 0168837 (2017).
  6. Langan, L. M., et al. Spheroid size does not impact metabolism of the β-blocker propranolol in 3D intestinal fish model. Frontiers in Pharmacology. 9, 947 (2018).
  7. Lammel, T., Tsoukatou, G., Jellinek, J., Sturve, J. Development of three-dimensional (3D) spheroid cultures of the continuous rainbow trout liver cell line RTL-W1. Ecotoxicology and Environmental Safety. 167, 250-258 (2019).
  8. Jeong, Y., et al. Differential effects of CBZ-induced catalysis and cytochrome gene expression in three dimensional zebrafish liver cellculture. Journal of Environmental and Analytical Toxicology. 6, 2161 (2016).
  9. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).
  10. Lee, W. G., Ortmann, D., Hancock, M. J., Bae, H., Khademhosseini, A. A hollow sphere soft lithography approach for long-term hanging drop methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (2), 249-259 (2010).
  11. Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods in Molecular Medicine. 140, 141-151 (2007).
  12. de Souza, I. R., et al. Development of 3D cultures of zebrafish liver and embryo cell lines: a comparison of different spheroid formation methods. Ecotoxicology. 30 (9), 1893-1909 (2021).
  13. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ user guide. ImageJ/Fiji. 1, 151-161 (2012).
  14. Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368 (2021).
  15. da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755 (2020).
  16. Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966 (2020).
  17. Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
  18. Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
  19. Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892 (2020).
  20. Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24 (2021).
  21. ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2022)
  22. Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
  23. Gajski, G., et al. Genotoxic potential of selected cytostatic drugs in human and zebrafish cells. Environmental Science and Pollution Research International. 23 (15), 14739-14750 (2016).
  24. Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843 (2021).
  25. Mueller-Klieser, W. Method for the determination of oxygen consumption rates and diffusion coefficients in multicellular spheroids. Biophysical Journal. 46 (3), 343-348 (1984).
  26. Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).
  27. Ho, R. K., Kimmel, C. B. Commitment of cell fate in the early zebrafish embryo. Science. 261 (5117), 109-111 (1993).
  28. Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. Protocadherin-19 and N-cadherin interact to control cell movements during anterior neurulation. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 1029-1041 (2010).
  29. Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
  30. He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).

Tags

3D Cell CultureZebrafish Cell LinesSpheroidsIn Vitro ModelToxicity TestingCell ViabilityTrypan BlueCell Counting96-well ULA Plate

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
de Souza, I. R., Micali Canavez, A. D. P., Schuck, D. C., Costa Gagosian, V. S., de Souza, I. R., de Albuquerque Vita, N., da Silva Trindade, E., Cestari, M. M., Lorencini, M., Leme, D. M. A 3D Culture Method of Spheroids of Embryonic and Liver Zebrafish Cell Lines. J. Vis. Exp. (191), e64859, doi:10.3791/64859 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image