В естественных условиях Кальциевая визуализация нейронных ансамблей в сетях первичных сенсорных нейронов в интактных ганглиях дорсальных корешков
Summary
Этот протокол описывает хирургическое воздействие на ганглий дорсального корешка (DRG) с последующим GCaMP3 (генетически кодируемый индикатор Ca2+ ; Зеленый флуоресцентный белок-кальмодулин-белок M13 3) Ca2+ визуализация нейронных ансамблей с использованием мышей Pirt-GCaMP3 при применении различных стимулов к ипсилатеральной задней лапе.
Abstract
Визуализация Ca 2+ может быть использована в качестве прокси для клеточной активности, включая потенциалы действия и различные сигнальные механизмы, включающие проникновение Ca 2+ в цитоплазму или высвобождение внутриклеточных запасов Ca2+. ВизуализацияCa 2+ на основе Pirt-GCaMP3 первичных сенсорных нейронов ганглия дорсального корешка (DRG) у мышей дает преимущество одновременного измерения большого количества клеток. Можно контролировать до 1,800 нейронов, что позволяет изучать нейронные сети и соматосенсорные процессы как ансамбль в их нормальном физиологическом контексте на популяционном уровне in vivo. Большое количество контролируемых нейронов позволяет обнаруживать паттерны активности, которые было бы сложно обнаружить с помощью других методов. Стимулы могут быть приложены к задней лапе мыши, что позволяет изучать прямое воздействие стимулов на ансамбль нейронов DRG. Количество нейронов, продуцирующих переходные процессы Ca2+, а также амплитуда переходных процессовCa2+ указывает на чувствительность к определенным сенсорным модальностям. Диаметр нейронов свидетельствует об активированных типах волокон (безвредные механические и вредные болевые волокна, волокна Aβ, Aδ и C). Нейроны, экспрессирующие специфические рецепторы, могут быть генетически помечены td-Tomato и специфическими рекомбиназами Cre вместе с Pirt-GCaMP. Таким образом, визуализация PIRT-GCaMP3 Ca2+ DRG предоставляет мощный инструмент и модель для анализа специфических сенсорных модальностей и подтипов нейронов, действующих как ансамбль на популяционном уровне для изучения боли, зуда, прикосновения и других соматосенсорных сигналов.
Introduction
Первичные сенсорные нейроны непосредственно иннервируют кожу и переносят соматосенсорную информацию обратно в центральную нервную систему 1,2. Ганглии дорсальных корешков (DRG) представляют собой скопления клеточных тел из 10 000-15 000 первичных сенсорных нейронов 3,4. Нейроны DRG имеют различный размер, уровни миелинизации и паттерны экспрессии генов и рецепторов. Нейроны меньшего диаметра включают нейроны, чувствительные к боли, а нейроны большего диаметра обычно реагируют на безболезненные механические стимулы 5,6. Нарушения в первичных сенсорных нейронах, такие как травма, хроническое воспаление и периферические невропатии, могут сенсибилизировать эти нейроны к различным раздражителям и способствовать хронической боли, аллодинии и гиперчувствительности к боли 7,8. Поэтому изучение нейронов DRG важно для понимания как соматочувствительности в целом, так и многих болевых и зудящих расстройств.
Нейроны, возбуждающиеся in vivo, необходимы для соматосенсации, но до недавнего времени инструменты для изучения интактных ганглиев in vivo были ограничены относительно небольшим количеством клеток9. Здесь мы описываем мощный метод изучения потенциалов действия или активности нейронов на популяционном уровне in vivo как ансамбля. В методе используется визуализация, основанная на цитоплазматической динамикеCa 2+. Чувствительные флуоресцентные индикаторы Ca 2+ являются хорошими прокси для измерения клеточной активности из-за обычно низкой концентрации цитоплазматического Ca2+. Эти показатели позволили одновременно контролировать от сотен до нескольких тысяч первичных сенсорных нейронов у мышей 9,10,11,12,13,14,15,16 и крыс 17. Метод визуализации in vivo Ca2+, описанный в этом исследовании, может быть использован для непосредственного наблюдения за реакциями популяционного уровня на механические, холодные, тепловые и химические раздражители.
Фосфоинозитид-связывающий мембранный белок Pirt экспрессируется на высоких уровнях почти во всех (>95%) первичных сенсорных нейронах18,19 и может использоваться для управления экспрессией датчика Ca 2+, GCaMP3, для мониторинга активности нейронов in vivo20. В этом протоколе описаны методы выполнения операции in vivo DRG, визуализации Ca2+ и анализа в правой поясничной зоне 5 (L5) DRG мышей Pirt-GCaMP314 с использованием конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (LSM).
Protocol
Representative Results
Discussion
Постоянная боль присутствует при широком спектре расстройств, изнуряя и/или снижая качество жизни примерно у 8% людей29. Первичные сенсорные нейроны обнаруживают вредные раздражители на коже, а их пластичность способствует постоянной боли8. В то время как нейро…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Национального института здравоохранения R01DE026677 и R01DE031477 (для Y.S.K.), стартап-фондом UTHSCSA (Y.S.K.) и премией «Восходящая звезда» от системы Техасского университета (Y.S.K.).
Materials
| Anased Injection (Xylazine) | Covetrus, Akorn | 33197 | |
| C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC | Cal Zeiss | 422642-9900-000 | |
| Cotton Tipped Applicators | McKesson | 24-106-1S | |
| Curved Hemostat | Fine Science Tools | 13007-12 | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| DC Temperature Controller Heating Pad | FHC | 40-90-2-05 | |
| Dumont Ceramic Coated Forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| FHC DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Fluriso (Isoflurane) | MWI Animal Health, Piramal Group | 501017 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16221-14 | |
| GelFoam | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Ketaset (Ketamine) | Zoetis | KET-00002R2 | |
| Luminescent Green Stage Tape | JSITON/ Amazon | B803YW8ZWL | |
| Matrx VIP 3000 Isoflurane Vaporizer | Midmark | 91305430 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Micro dissecting spring scissors | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| Micro dissecting spring scissors | Roboz | RS-5677 | |
| Mini Rectal Thermistor Probe | FHC | 40-90-5D-02 | |
| Operating scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Pirt-GCaMP3 C57BL/6J mice | Johns Hopkins University | N/A | Either sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice. |
| SMALGO small animal algometer | Bioseb In vivo Research Instruments | BIO-SMALGO | |
| Stereotaxic frame | Kopf Model 923-B | 923-B | |
| td-Tomato C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 7909 | |
| Top Plate, 6 in x 10 in | Newport | 290-TP | |
| TrpV1-Cre C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 17769 | |
| Zeiss LSM 800 confocal microscope | Cal Zeiss | LSM800 | |
| Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software | Cal Zeiss | Zen (Blue Edition) 2.6 |
References
- Rivero-Melián, C., Grant, G. Distribution of lumbar dorsal root fibers in the lower thoracic and lumbosacral spinal cord of the rat studied with choleragenoid horseradish peroxidase conjugate. The Journal of Comparative Neurology. 299 (4), 470-481 (1990).
- Wessels, W. J., Marani, E. A rostrocaudal somatotopic organization in the brachial dorsal root ganglia of neonatal rats. Clinical Neurology and Neurosurgery. 95, 3-11 (1993).
- Schmalbruch, H. The number of neurons in dorsal root ganglia L4-L6 of the rat. The Anatomical Record. 219 (3), 315-322 (1987).
- Sørensen, B., Tandrup, T., Koltzenburg, M., Jakobsen, J. No further loss of dorsal root ganglion cells after axotomy in p75 neurotrophin receptor knockout mice. The Journal of Comparative Neurology. 459 (3), 242-250 (2003).
- Basbaum, A. I., Woolf, C. J. Pain. Current Biology. 9 (12), 429-431 (1999).
- Liu, Y., Ma, Q. Generation of somatic sensory neuron diversity and implications on sensory coding. Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 52-60 (2011).
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
- Stucky, C. L., Mikesell, A. R. Cutaneous pain in disorders affecting peripheral nerves. Neuroscience Letters. 765, 136233 (2021).
- Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiology of Pain. 11, 100083 (2022).
- Chen, Z., et al. Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy. Scientific Reports. 9 (1), 7651 (2019).
- Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., McMahon, S. B. Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6. eNeuro. 5 (1), (2018).
- Emery, E. C., et al. In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP. Science Advances. 2 (11), 1600990 (2016).
- Ishida, H., et al. In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment. The Journal of Neuroscience. 41 (41), 8494-8507 (2021).
- Kim, Y. S., et al. Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- MacDonald, D. I., et al. Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain. Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).
- Wang, F., et al. Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold. Cell Reports. 23 (7), 2001-2013 (2018).
- Kucharczyk, M. W., et al. The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli. Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).
- Kim, A. Y., et al. a phosphoinositide-binding protein, functions as a regulatory subunit of TRPV1. Cell. 133 (3), 475-485 (2008).
- Kim, Y. S., et al. Central terminal sensitization of TRPV1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain. Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Mahadevan, A. S., et al. cytoNet: Spatiotemporal network analysis of cell communities. PLoS Computational Biology. 18 (6), 1009846 (2022).
- Barretto, R. P., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).
- Leijon, S. C. M., et al. Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: modulation by capsaicin, menthol and mustard oil. The Journal of Physiology. 597 (7), 2045-2061 (2019).
- Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nature Communications. 7, 11450 (2016).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6, 8171 (2015).
- Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. The coding of cutaneous temperature in the spinal cord. Nature Neuroscience. 19 (9), 1201-1209 (2016).
- Yarmolinsky, D. A., et al. Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system. Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).
- Torrance, N., Smith, B. H., Bennett, M. I., Lee, A. J. The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey. The Journal of Pain. 7 (4), 281-289 (2006).
- Shannonhouse, J., et al. Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca(2+) activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy. The Journal of Neuroscience. 42 (31), 6020-6037 (2022).
- Luiz, A. P., et al. Cold sensing by Na(V)1.8-positive and Na(V)1.8-negative sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3811-3816 (2019).
- Hartung, J. E., Gold, M. S. GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons. Cell Calcium. 89, 102225 (2020).
- Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5810 (2021).
- Chan, S. L., Mayne, M., Holden, C. P., Geiger, J. D., Mattson, M. P. Presenilin-1 mutations increase levels of ryanodine receptors and calcium release in PC12 cells and cortical neurons. The Journal of Biological Chemistry. 275 (24), 18195-18200 (2000).
- Sierra, D. A., Popov, S., Wilkie, T. M. Regulators of G-protein signaling in receptor complexes. Trends in Cardiovascular Medicine. 10 (6), 263-268 (2000).
- Yoshihara, K., et al. Astrocytic Ca(2+) responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin. Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 101-104 (2018).
- Tan, C. H., McNaughton, P. A. The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth. Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).
- Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Knöpfel, T. Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins. Nature Methods. 7 (8), 643-649 (2010).
- Gong, Y., et al. High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor. Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).
- Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision. Nature Methods. 7 (5), 399-405 (2010).
- Harada, K., et al. Red fluorescent protein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivo imaging. Scientific Reports. 7 (1), 7351 (2017).
