Genexpressionsanalysen in humanen Follikeln
Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll, das beschreibt, wie menschliche Ovarialfollikel aus gefrorenem und aufgetautem kortikalem Gewebe isoliert werden können, um Genexpressionsanalysen durchzuführen.
Abstract
Der Eierstock ist ein heterogenes Organ, das sich aus verschiedenen Zelltypen zusammensetzt. Um die molekularen Mechanismen während der Follikulogenese zu untersuchen, kann die Lokalisierung von Proteinen und Genexpression auf fixiertem Gewebe durchgeführt werden. Um die Genexpression in einem menschlichen Follikel richtig beurteilen zu können, muss diese komplexe und empfindliche Struktur jedoch isoliert werden. Daher wurde ein angepasstes Protokoll entwickelt, das zuvor von Woodruffs Labor beschrieben wurde, um die Follikel (die Eizelle und die Granulosazellen) von ihrer Umgebung zu trennen. Das kortikale Gewebe der Eierstöcke wird zunächst manuell bearbeitet, um kleine Fragmente mit zwei Werkzeugen zu erhalten: einem Gewebeschneider und einem Gewebezerkleinerer. Das Gewebe wird dann mit 0,2 % Kollagenase und 0,02 % DNase für mindestens 40 min enzymatisch verdaut. Dieser Aufschlussschritt wird bei 37 °C und 5 % CO2 durchgeführt und von einem mechanischen Pipettieren des Mediums alle 10 min begleitet. Nach der Inkubation werden die isolierten Follikel manuell mit einer kalibrierten Mikrokapillarpipette unter mikroskopischer Vergrößerung entnommen. Wenn noch Follikel in den Gewebestücken vorhanden sind, wird der Eingriff mit einer manuellen Mikrodissektion abgeschlossen. Die Follikel werden auf Eis in einem Nährmedium gesammelt und zweimal in Tröpfchen phosphatgepufferter Kochsalzlösung gespült. Dieser Verdauungsvorgang muss sorgfältig kontrolliert werden, um eine Verschlechterung der Follikel zu vermeiden. Sobald die Struktur der Follikel beeinträchtigt zu sein scheint oder nach maximal 90 Minuten, wird die Reaktion mit einer 4 °C heißen Blockierlösung gestoppt, die 10 % fötales Kälberserum enthält. Es sollten mindestens 20 isolierte Follikel (mit einer Größe unter 75 μm) entnommen werden, um nach der RNA-Extraktion eine ausreichende Menge an Gesamt-RNA für die quantitative Polymerase-Kettenreaktion in Echtzeit (RT-qPCR) zu erhalten. Nach der Extraktion erreicht die Quantifizierung der Gesamt-RNA aus 20 Follikeln einen Mittelwert von 5 ng/μL. Die gesamte RNA wird dann in cDNA retrotranskribiert und die interessierenden Gene werden mittels RT-qPCR weiter analysiert.
Introduction
Der Eierstock ist ein komplexes Organ, das aus funktionellen und strukturellen Einheiten besteht, einschließlich der Follikel innerhalb der Hirnrinde und des Stromas. Die Follikulogenese, der Prozess der Follikelaktivierung, des Wachstums und der Reifung von einem ursprünglichen Ruhezustand zu einem reifen Follikel, der befruchtet werden kann und die frühe Embryonalentwicklung unterstützt, wird in der Forschung umfassend untersucht1. Die Entschlüsselung der Mechanismen, die dieses Phänomen antreiben, könnte die Fruchtbarkeitsversorgung von Frauen verbessern2. Analysen an fixiertem menschlichem Gewebe ermöglichen die Beurteilung der Proteinexpression und der Genlokalisation innerhalb der funktionellen Einheiten des Ovars 3,4. Es sind jedoch spezielle Techniken erforderlich, um die Follikel von der umgebenden Hirnrinde zu trennen, um die Genexpression in den Eierstockfollikeln genau zu bestimmen. Daher wurde in einer früheren Studie eine Follikelisolationstechnik entwickelt, die Analysen der Genexpression direkt aus der funktionellen Einheit des Ovars ermöglicht5. Es wurden verschiedene Ansätze entwickelt, wie z. B. der enzymatische Aufschluss und/oder die mechanische Isolierung sowie die Laser-Capture-Mikrodissektion, die eine Follikelisolierung innerhalb eines Gewebestücks ermöglichen 6,7,8,9. Die Follikelisolierung wird häufig verwendet, entweder mit menschlichem oder tierischem Eierstockgewebe, um die Genexpressionsprofile von Follikeln in allen Entwicklungsstadien zu bewerten10,11,12. Ein optimales Isolationsverfahren sollte jedoch die fragile Struktur des Follikels innerhalb des dichten Kortex berücksichtigen und daher mit Sorgfalt durchgeführt werden, um Schäden zu vermeiden7. Dieses Manuskript beschreibt ein Verfahren, das von einem von Woodruffs Labor beschriebenen Protokoll adaptiert wurde, um menschliche Follikel aus gefrorener und aufgetauter Eierstockrinde zu isolieren, um Genexpressionsanalysen durchzuführen13.
Der erste Schritt der Isolierung der Eierstockfollikel aus gefrorenem menschlichem Gewebe ist das Auftauen. Dieser Prozess wird auf der Grundlage des klinischen Protokolls durchgeführt, das für die Transplantation von kryokonserviertem Eierstockgewebe verwendet wird, wie zuvor beschrieben14,15. Das Verfahren zielt darauf ab, die Kryoprotektiva zu entfernen, indem die Eierstockrinde in abnehmenden Konzentrationen des Mediums gespült wird. Anschließend wird das Gewebe fragmentiert, bevor es enzymatisch und mechanisch isoliert wird, um die Follikel zu gewinnen. Follikel in verschiedenen Stadien können mit einem Stereomikroskop mit hoher Vergrößerung und hochwertiger Optik unterschieden werden, um die interessierenden Follikel zu isolieren. Jeder isolierte Follikel wird mit einem in das Mikroskop integrierten Lineal gemessen, und die Follikel können nach ihrem Entwicklungsstadium zusammengefasst werden: Primordialfollikel (30 μm), Primärfollikel (60 μm), Sekundärfollikel (120-200 μm) und Antralfollikel (>200 μm)16. Eine weitere Klassifizierung kann nach der Morphologie der Follikel vorgenommen werden: primordiale Follikel haben eine Schicht abgeflachter Granulosazellen (GCs), primäre Follikel haben eine Schicht quaderförmiger GCs, sekundäre Follikel haben mindestens zwei Schichten quaderförmiger GCs, und das Vorhandensein eines Hohlraums zwischen den GCs charakterisiert das Antralstadium. Wenn die interessierenden Follikel ausgewählt werden, wird eine RNA-Extraktion durchgeführt. Die RNA-Quantität und -Qualität wird vor der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) in Echtzeit bewertet (Abbildung 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Kryokonservierung von Eierstockgewebe ist ein vielversprechender Ansatz, um die Fruchtbarkeit von Krebspatientinnen zu erhalten. In der Klinik wird aufgetautes kortikales Gewebe nach der Remission wieder in die Patientin transplantiert, was die Wiederaufnahme der Eierstockfunktion und der Fruchtbarkeit ermöglicht19,20. Neben der klinischen Verwendung können am Ende der Lagerzeit auch verbleibende Eierstockfragmente für die Forschung gespendet werden, um di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch einen Excellence of Science (EOS) Grant (ID: 30443682) unterstützt. I.D. ist assoziierter Forscher am Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).
Materials
| 2 mm gridded Petri dish | Corning | 430196 | |
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
| 2100 Expert software | Agilent | version B.02.08.SI648 | |
| 4-wells plate | Sigma Aldrich | D6789 | |
| 6-wells plate | Carl Roth | EKX5.1 | |
| Agilent total RNA 6000 pico kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes | Sigma Aldrich | A5177 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Collagenase IV | LifeTechnologies | 17104-019 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DNase | Sigma Aldrich | D4527-10kU | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| GoScript reverse transcriptase | Promega | A5003 | |
| HSA | CAF DCF | LC4403-41-080 | |
| Leibovitz-15 | LifeTechnologies | 11415-049 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes | LifeTechnologies | 12330-031 | |
| McIlwain tissue chopper | Stoelting | 51350 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm | CooperSurgical | 7-72-2200/1 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm | CooperSurgical | 7-72-2075/1 | |
| NanoDrop 2000/2000c operating software | ThermoFisher | version 1.6 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | 2000/2000c | |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | P3032 | |
| PowerTrack SYBR green master mix | ThermoFisher | A46109 | |
| Primers: GDF9 | F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG | ||
| Primers: HPRT | F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA | ||
| Primers: Kit Ligand | F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT | ||
| Real-Time qPCR Quantstudio 3 | ThermoFisher | A33779 | |
| RNAqueous-micro total RNA isolation kit | ThermoFisher | AM1931 | |
| Selenium | Sigma Aldrich | S9133 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Streptomycine sulfate | Sigma Aldrich | S1277 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
| Thermo Scientific Forma Series II water-jacketed CO2 incubators | ThermoFisher | 3110 | |
| Thomas Stadie-Riggs tissue slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | |
| Transferrin | Roche | 10652202001 |
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