Análisis de expresión génica en folículos humanos

El ovario es un órgano complejo compuesto de unidades funcionales y estructurales, incluidos los folículos dentro de la corteza y el estroma. La foliculogénesis, el proceso de activación, crecimiento y maduración del folículo desde un estado quiescente primordial hasta un folículo maduro capaz de ser fertilizado y apoyar el desarrollo embrionario temprano, se estudia ampliamente en la investigación¹. Desentrañar los mecanismos que impulsan este fenómeno podría mejorar la atención de la fertilidad para las mujeres². Los análisis en tejido humano fijo permiten evaluar la expresión proteica y la localización génica dentro de las unidades funcionales del ovario ^3,4. Sin embargo, se necesitan técnicas específicas para disociar los folículos de la corteza circundante para evaluar con precisión los niveles de expresión génica dentro de los folículos ováricos. Así, en un estudio previo, se desarrolló una técnica de aislamiento de folículos para permitir análisis de expresión génica directamente desde la unidad funcional del ovario⁵. Se han desarrollado diferentes enfoques, como la digestión enzimática y/o el aislamiento mecánico, así como la microdisección por captura láser, que permiten el aislamiento del folículo dentro de un pedazo de tejido 6,7,8,9. El aislamiento folicular es ampliamente utilizado, ya sea con tejido ovárico humano o animal, para evaluar los perfiles de expresión génica de los folículos en todas las etapas de desarrollo^10,11,12. Sin embargo, un procedimiento de aislamiento óptimo debe tener en cuenta la frágil estructura del folículo dentro de la corteza densa y, por lo tanto, debe realizarse con cuidado para evitar cualquier daño⁷. Este manuscrito describe un procedimiento, adaptado de un protocolo descrito por el laboratorio de Woodruff, para aislar folículos humanos de la corteza ovárica congelada-descongelada con el fin de realizar análisis de expresión génica¹³.

El primer paso del aislamiento del folículo ovárico del tejido humano congelado es el procedimiento de descongelación. Este proceso se realiza con base en el protocolo clínico utilizado para el injerto de tejido ovárico criopreservado, como se describió anteriormente^14,15. El proceso tiene como objetivo eliminar los agentes crioprotectores enjuagando la corteza ovárica en concentraciones decrecientes del medio. Luego, el tejido se fragmenta antes del aislamiento enzimático y mecánico para recuperar los folículos. Los folículos en diferentes etapas se pueden distinguir utilizando un microscopio estereoscópico con alto aumento y óptica de buena calidad para aislar los de interés. Cada folículo aislado se mide utilizando una regla integrada en el microscopio, y los folículos se pueden agrupar de acuerdo con su etapa de desarrollo: folículos primordiales (30 μm), folículos primarios (60 μm), folículos secundarios (120-200 μm) y folículos antrales (>200 μm)¹⁶. Se puede realizar una clasificación adicional de acuerdo con la morfología de los folículos: los folículos primordiales tienen una capa de células de la granulosa aplanada (GC), los folículos primarios tienen una capa de GC cuboidales, los folículos secundarios tienen al menos dos capas de GC cuboidales, y la presencia de una cavidad entre los GC caracteriza la etapa antral. Cuando se seleccionan folículos de interés, se realiza la extracción de ARN. La cantidad y la calidad del ARN se evalúan antes de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) (Figura 1).