Sıkı bariyerler, merkezi sinir sistemini (CNS), kan-beyin bariyeri (BBB) ve kan-beyin omurilik sıvısı (BOS) bariyeri dahil olmak üzere çevreden ayırır. Bu engeller CNS’yi dış hakaretlere karşı korur ve dengeli ve kontrollü bir mikro çevre sağlar ^1,2,3. BBB zaman içinde kapsamlı bir şekilde çalışılmış olsa da, koroid pleksusta (SP) bulunan kan-BOS bariyeri sadece son on yılda artan araştırma ilgisi kazanmıştır. Bu son bariyer beynin dört ventrikülünde bulunabilir (Şekil 1A, B) ve merkezi bir stroma, sızdıran kılcal damarlar, fibroblastlar ve bir lenfoid ve miyeloid hücre popülasyonunu çevreleyen tek bir koroid pleksus epitel (CPE) hücresi tabakası ile karakterizedir (Şekil 1C)^4,5,6. CPE hücreleri sıkı bağlantılarla sıkıca birbirine bağlanır, böylece altta yatan federe kan kılcal damarlarından BOS ve beyne sızıntıyı önler. Ek olarak, CPE hücreleri boyunca taşıma, yararlı bileşiklerin (örneğin, besinler ve hormonlar) kandan BOS’a akışını ve zararlı moleküllerin (örneğin, metabolik atıklar, aşırı nörotransmiterler) diğer yöndeki efflüksünü yöneten bir dizi içe ve dışa taşıma sistemi tarafından düzenlenir ^1,6. Aktif taşıma fonksiyonlarını yerine getirebilmek için, CPE hücreleri sitoplazmalarında çok sayıda mitokondri içerir⁷. Dahası, SP BOS’un ana kaynağıdır ve yerleşik enflamatuar hücrelerin varlığı ile beynin bekçisi olarak işlev görür¹. Kan ve beyin arasındaki eşsiz konumu nedeniyle, SP ayrıca bağışıklık gözetimini gerçekleştirmek için mükemmel bir konuma sahiptir⁸.

Şekil 1: Koroid pleksusun (SP) yeri ve bileşimine şematik genel bakış . (A,B) CP dokusu, (A) insan ve (B) fare beyinlerinin iki lateral, üçüncü ve dördüncü ventriküllerinde bulunur. (C) SP dokusu, fenestrated kılcal damarları, gevşek bağ dokusunu ve lenfoid ve miyeloid hücreleri çevreleyen sıkıca bağlanmış küboidal CP epitel (CPE) hücrelerinin tek bir katmanından oluşur ve kan-beyin omurilik sıvısı bariyerini oluşturur (referans^23’ten uyarlanmış ve modifiye edilmiştir). Şekil Biorender.com ile oluşturulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Son on yılda, araştırma grubumuzdan birkaç rapor da dahil olmak üzere artan kanıtlar, SP’nin sağlık ve hastalıkta merkezi bir rol oynadığını ortaya koymuştur 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Örneğin, yaşlanan kan-BOS bariyerinin, diğerlerinin yanı sıra, çekirdeklerde, mikrovilluslarda ve bazal membranda morfolojik değişiklikler gösterdiği bilinmektedir ^1,19. Ek olarak, Alzheimer hastalığı bağlamında, genel bariyer bütünlüğü tehlikeye girer ve yaşa bağlı tüm bu değişikliklerin daha da belirgin olduğu görülmektedir ^1,8,20. Morfolojik değişikliklere ek olarak, SP’nin transkriptom, proteom ve sekretomu hastalık ^12,21,22,23 sırasında değişir. Bu nedenle, SP’nin nörolojik hastalıklardaki rolünü daha iyi anlamak ve potansiyel olarak yeni terapötik stratejiler geliştirmek için SP’nin ileri düzeyde bilgisi gereklidir.

SP’nin beyin ventriküllerinden doğru mikrodiseksiyonu için etkili bir yöntem, bu küçük beyin yapısının düzgün bir şekilde araştırılmasına izin veren ilk paha biçilmez adımdır. Yüksek vaskülarize doğası nedeniyle (Şekil 2B), beynin ventrikül boşluklarında yüzen SP, bir binoküler mikroskop kullanılarak tanımlanabilir. Bununla birlikte, aşağı akış analizi için sıklıkla transkardiyal perfüzyon gereklidir, bu da SP dokusunun doğru tanımlanmasını ve izolasyonunu zorlaştırır (Şekil 2C). Daha sonraki işlem adımları izin veriyorsa (örneğin, RNA ve protein analizi durumunda), SP, bromofenol mavisi ile transkardiyal perfüzyon yoluyla görselleştirilebilir (Şekil 2A). Birkaç yayın, SP’nin sıçan²⁴ ve fare yavrusu beyinlerinden^25’ten izole edildiğini zaten tanımlamaktadır. Burada, SP’yi yetişkin farelerden izole etmek için bir mikrodiseksiyon izolasyon tekniği tanımlanmıştır. Önemli olarak, bu izolasyon tekniği SP içindeki hücrelerin canlılığını, işlevini ve yapısını korur. Dördüncü ve lateral ventriküllerde yüzen SP’nin izolasyonu burada açıklanmaktadır. Kısacası, fareler terminal anestezi altına alınır ve gerekirse transkardiyal olarak perfüze edilir. Bununla birlikte, perfüzyonun SP içindeki hücrelerin yapısına zarar verebileceği unutulmamalıdır. Sonuç olarak, numune transmisyon elektron mikroskobu (TEM), seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu (SBF-SEM) veya odaklanmış iyon ışını SEM (FIB-SEM) kullanılarak analiz edilecekse, perfüzyon yapılmamalıdır. Daha sonra, tüm beyin izole edilir ve forsepsler beyni sagittal olarak hemiseke etmek için kullanılır. Buradan, lateral ventriküllerde yüzen SP’ler tanımlanabilir ve diseke edilebilirken, dördüncü ventrikülden gelen SP beynin serebellar tarafından izole edilebilir.

Şekil 2: (A-D) bromofenol mavi perfüzyonundan sonra (A-K) dördüncü ve (D-F) lateral ventrikül koroid pleksusunun (SP) görüntülenmesi, (B,E) perfüzyon olmaması ve (C,F) perfüzyonunun PBS/heparin ile görüntülenmesi. Görüntüler stereo mikroskopla (8x-32x büyütme) alınır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

SP beyin ventriküllerinden düzgün bir şekilde diseke edildikten sonra, bu yapının işlevi hakkında daha fazla bilgi edinmek için bütün bir teknik repertuarı uygulanabilir. Örneğin, akış sitometrisi veya tek hücreli RNA dizilimi, belirli hastalık koşulları altında sızan enflamatuar hücreleri ölçmek ve fenotipik olarak analiz etmek için yapılabilir^26,27. Hücresel bileşime ek olarak, SP’nin moleküler bileşimi, enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA), immünoblot yoluyla veya sitokin boncuk dizisi²⁸ kullanılarak çoklu sitokinlerin eşzamanlı analizi yoluyla sitokinlerin ve kemokinlerin varlığını değerlendirmek için analiz edilebilir. Ayrıca mikrodiseke SP eksplantları²⁹ üzerinde transkriptom, vasküler, immün hücre histolojisi ve sekretom analizleri yapılabilmektedir. Burada, CP yapısının genel bir görünümünü elde etmek için tüm montaj CP’sinde taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılır. SEM, yüzeyi taramak ve yüzeyin topografyasının ve kompozisyonunun bir görüntüsünü oluşturmak için odaklanmış elektronlardan oluşan bir ışın kullanır. Elektronların dalga boyu ışığınkinden çok daha küçük olduğundan, SEM’in çözünürlüğü nanometre aralığındadır ve bir ışık mikroskobunkinden daha üstündür. Sonuç olarak, hücre altı seviyedeki morfolojik çalışmalar SEM aracılığıyla yapılabilir. kısaca, diseke edilen SP derhal bir gece fiksasyonu için glutaraldehit içeren bir fiksatife aktarılır, ardından osmikasyon ve uranil asetat boyanması yapılır. Numuneler daha sonra kurşun aspartat lekesi ile muamele edilir, dehidre edilir ve nihayetinde görüntüleme için gömülür.

Böylece, bu protokol, SP’nin fare beyin ventriküllerinden verimli bir şekilde izole edilmesini kolaylaştırır; bu, yapısını ve işlevini araştırmak için çeşitli aşağı akış teknikleri kullanılarak daha fazla analiz edilebilir.