הנדסת מוטציות הטרוזיגוטיות אונקוגניות בתאי גזע המטופויאטיים אנושיים ובתאי אב

פרוטוקול זה דורש שימוש ב-CD34+ HSPCs בריאים שמקורם בתורמים ודורש אישור אתי מוועדות הביקורת המוסדיות המקומיות (IRB) והסכמה מדעת חתומה. CD34+ HSPCs המשמשים בפרוטוקול זה בודדו מדם טבורי (UCB) של לידות טווח (>34 שבועות של הריון). הסכמה מדעת התקבלה מהאימהות לפני הלידה, והתקבל אישור אתי לאיסוף UCB (אישור IRB: 31-322 ex 18/19) מהאוניברסיטה הרפואית של גראץ. רשימה מלאה של חומרים המשמשים בפרוטוקול זה ניתן למצוא בטבלת החומרים. 1. תכנון sgRNA והערכת יעילות החיתוך חפש את מיקום המוטציה הרצויה ואת התמליל הנכון בכלי מסד נתונים מקוון (למשל, COSMIC, https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic). בחר sgRNA הסמוך למוטציה (מיקוד אקסוני) או באינטרון הקודם (מיקוד אינטרוני) באמצעות כלי תכנון sgRNA. בפרוטוקול זה, הכלי המקוון של Benchling משמש. ראה את טבלת החומרים לקבלת רשימה של כלים מקוונים אפשריים לתכנון sgRNA. בחר באפשרות + (יצירה) > רצף DNA > ייבוא רצפי דנ”א > ייבוא ממסדי נתונים. הזן את הגן הרצוי, לדוגמה, CALR ובחר אדם כמין > חיפוש > בחר את התעתיק הנכון (לדוגמה, CALR-201 -ENST00000316448) > ייבוא. בחר את אזור העניין שבו יש להציג את הפסקת ה- DS (לדוגמה, intron 7). בחר באפשרות CRISPR בצד ימין של המסך ובחר עיצוב וניתוח של קווי עזר. בחר קו עזר יחיד, שמור על אורך מדריך של 20 סיביות לשנייה ורצף PAM לעריכה עם SpCas9 (NGG). בחר מדריך עם ניקוד גבוה על היעד (סיכוי גבוה לעריכה במקום הרצוי) וציון גבוה מחוץ למטרה (סיכוי נמוך לעריכה במיקום לא רצוי). בחר לפחות שלושה מדריכים לבדיקה על מנת למצוא את ה- sgRNA בעל הביצועים הטובים ביותר. הזמינו את ה-sgRNA כ-sgRNA סינתטי שעבר שינוי כימי מספק מסחרי.הערה: מומלץ בשלב זה להזמין כמות קטנה של sgRNAs סינתטיים עבור המסך הראשוני. לאחר שזוהה sgRNA בעל ביצועים טובים, המשך בסדר גדול יותר של ה- sgRNA שנבחר. הפשרה 2 x 10 5-5 x 105 CD34+ HSPCs. העבירו את התאים ל-10 מ”ל של RPMI1640 שחומם מראש בתוספת 1% אנטיביוטיקה (למשל, פניצילין/סטרפטומיצין).הערה: יש להשתמש בתקליטורי CD34+ HSPCs עם טוהר >90% כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר והניתנות לשחזור ביותר. צנטריפוגה ב-350 x גרם בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10 דקות. לספור את התאים עם המוציטומטר ולהשעות את התאים במדיום SFEM II בתוספת 0.2% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S), 100 ng/mL thrombopoietin (TPO), 100 ng/mL גורם תאי גזע (SCF), 100 ng/mL דמוי FMS טירוזין קינאז 3 ליגנד (FLT3L), 100 ng/mL אינטרלוקין-6 (IL-6), 35 nM UM171, ו-0.75 μM StemRegenin1 (SR1) לריכוז של 2.5 x 105 תאים /מ”ל. דגירה ב 37 °C / 5% CO2 במשך 48 שעות – 72 שעות.הערה: המדיום השלם ייקרא מעתה והלאה מדיום השמירה של HSPC. לאסוף את התאים בצינור 15 מ”ל ולספור את התאים. בדוק את כדאיות התא על-ידי אי-הכללה של טריפאן כחול.לפני שתתחיל, הפעל את מערכת ההעברה ובחר את האפשרות עבור cuvettes. בחר את התוכנית המתאימה ואת פתרון הגרעין עבור HSPCs (ראה טבלת חומרים). בין 2 x 105 ל 5 x 106 תאים ניתן nucleofected אחד 100 μL cuvette. הקדישו מספר קטן של תאים (לדוגמה, 1 x 10 5-2 x 105) כדי לשמור בתרבית במשך 48 שעות כדי לשמש כבקרת WT. הכן את קומפלקס RNP. בצינור של 1.5 מ”ל, הוסיפו 15 מיקרוגרם של Cas9 ו-8 מיקרוגרם של sgRNA (יחס טוחן 1:2.5) ודגרו ב-25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בבלוק חימום. בזמן שקומפלקס ה-RNP מדגר, סובבו את התאים ב-350 x g ב-RT למשך 5 דקות והשליכו את הסופר-נטנט באמצעות פיפטה. להשעות את התאים ב 100 μL של תמיסת נוקלאופקציה. מערבבים את התאים עם קומפלקס RNP ומעבירים לתוך הקובט. טפחו בעדינות על הקובט כדי להסיר את בועות האוויר שעלולות להיווצר במהלך ההעברה. הכנס את cuvette לתוך המחזיק של מערכת transfection ו electroporate את התאים עם תוכנית DZ-100. מיד לאחר האלקטרופורציה, יש להוסיף 400 μL של מדיום שימור HSPC שחומם מראש ללא P/S. העבר את התאים עם פיפטה העברה עדינה לצלחת תרבית המכילה אמצעי שימור HSPC מחומם מראש ללא P/S. בהתאם למספר התא, השתמש בצלחת תרבית מתאימה (צלחת 24, 12 או 6 בארות) כדי להגיע לצפיפות שבין 0.25 x 10 6 ו 1 x 106 תאים / מ”ל. מעבירים את הצלחת לחממה ב 37 מעלות צלזיוס / 5% CO2. לדגור את התאים nucleofected במשך 6-8 שעות. לאחר 6-8 שעות, הסר את המדיום הישן והחלף במדיום שימור HSPC טרי שחומם מראש בתוספת P/S. השהה את התאים בריכוז שבין 2.5 x 10 5 ל- 5 x 105 והעבר לצלחת תרבית תאים (צלחת 24, 12 או 6 בארות). דגירה של התאים למשך 48 שעות בטמפרטורה של 37°C/5% CO2. קציר 2 x 105 תאים וצנטריפוגה ב 350 x גרם ב RT במשך 5 דקות. לפני שתתחיל, הגדר את בלוקי החימום ב 65 °C ו 98 °C (68 °F). השליכו את הסופר-נאטנט והשאילו את התאים ב-1 מ”ל של 1x DPBS בצינור של 1.5 מ”ל. צנטריפוגה ב-350 x גרם ב-RT למשך 5 דקות. השליכו את הסופר-נטנט והשעו את התאים בתמיסת מיצוי DNA בנפח 50 μL. וורטקס במשך 15 שניות. דגירה במשך 6 דקות ב 65 מעלות צלזיוס. מערבולת במשך 15 שניות ודגירה במשך 2 דקות ב 98 מעלות צלזיוס. הגבר את האזור של DSB על ידי PCR באמצעות פריימרים המייצרים אמפליקון של כ 400-600 bp עם DSB במרכז. השתמש 0.5-1 μL של דנ”א שחולץ עבור תגובת PCR.הערה: בשל הרכב תמיסת מיצוי הדנ”א, לא ניתן לכמת במדויק את ריכוזי הדנ”א באמצעות ספקטרופוטומטריה. הפעל את מוצר ה- PCR עם סולם DNA על ג’ל אגרוז של 1.5% ב- 100 וולט למשך 45-60 דקות. הניחו את הג’ל על אור כחול או על טרנסילומינטור UV. חלצו את רצועת הדנ”א בגודל הנכון מהג’ל באמצעות ערכה מסחרית זמינה בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים). רצף את הדוגמאות על ידי ריצוף סנגר באמצעות פריימר קדימה או פריימר הפוך מה- PCR. עבור מוצרי PCR באורך של 400-600 bp, נדרשים 75 ננוגרם של דנ”א לריצוף בריכוז של 5 ננוגרם/מ”ל בנפח כולל של 15 μL. נתח את יעילות העריכה של sgRNAs על ידי העלאת קבצי הרצף לתוכנית שנועדה לחשב את יעילות העריכה על ידי זיהוי ההכנסה והמחיקות המיוצרות על ידי sgRNA. בחר את ה- sgRNA בעל הביצועים הטובים ביותר להמשך.הערה: כלים מקוונים ייעודיים מפורטים בטבלת החומרים. ניתוח זה דורש את קבצי .ab1 של HSPCs transfected ו- WT, רצף sgRNA ורצף PAM. 2. תיקון מכוון הומולוגיה (HDR) בנייה וקטורית עיצוב תבנית HDRהערה: יש לעצב שתי תבניות HDR: תבנית לרצף WT ותבנית לרצף שעבר מוטציה.ייבא את הרצף הגנומי ואת רצף הקידוד (CDS) של הגן הרצוי לתוכנה מתאימה לשיבוט מולקולרי (כלים ייעודיים ניתן למצוא בטבלת החומרים). מקובץ הרצף הגנומי, תכנן את זרוע ההומולוגיה השמאלית (HA) על ידי בחירה אידיאלית של 400 bp בקצה 5′ של ה- DSB. הדבק רצף זה בקובץ חדש. אם אינטרון ממוקד עם sgRNA, יש לכלול רצף של מקבל שחבור (SA). בחר את 150 bp האחרונים של intron היעד ולהדביק אותו לאחר HA שמאלה. אם האקסון מכוון ישירות, רצף זה אינו הכרחי (איור 3). מקובץ ה- CDS, בחר את ה- cDNA המעניין. במקרה שרצף אקסוני ממוקד, ודא שה- cDNA מתחיל מיד במורד הזרם של אתר DSB וכולל את כל האקסונים הבאים של הגן המעניין, כמו גם את קודון העצירה. במקרה שאינטרון ממוקד, ודא שה-cDNA מתחיל בקודון הראשון של האקסון הבא. קודון-אופטימיזציה של ה-cDNA והכנסתו לאחר רצף ה-SA. השתמש בכלים מקוונים ייעודיים למטרה זו (טבלת חומרים). הכנס אות פוליאדנילציה 3′ (PolyA) לאחר cDNA של עניין (למשל, SV40 או bGH) (טבלה 1). בעקבות הפוליA, הכנס רצף מקדם (למשל, מיקוד הטחול היוצר וירוס [SFFV] או פוליוביקוויטין C [UBC], טבלה 1) עבור החלבון הפלואורסצנטי. הכנס את הרצף עבור החלבון הפלואורסצנטי (כלומר, GFP, BFP או mCherry). הכנס אות PolyA שני אך שונה.הערה: הכנסת רצף PolyA שונה תמנע בעיות כגון רקומבינציה חיידקית של הפלסמיד או בעיות ביישור רצף בגלל שני רצפים זהים בתבנית. מקובץ הרצף הגנומי, עצב את ה-HA הנכון על-ידי בחירה אידיאלית של 400 bp בקצה 3′ של ה-DSB. הכנס רצף זה לאחר ה- PolyA השני. צור עותק של התבנית כולה ושנה את ה- cDNA של העניין כך שיכיל את רצף המוטציה הרצויה. החליפו את החלבון הפלואורסצנטי בחלבון פלואורסצנטי אחר. לדוגמה, אם נעשה שימוש ב-GFP עבור תבנית WT, החלף אותה ב-BFP או ב-mCherry עבור התבנית המוטנטית. בנה ושכפל את תבניות ה- HDR לפלסמיד pAAV-MCS (או לשדרות שדרה מתאימות אחרות).הערה: השברים הדרושים להרכבה יכולים להיות מיוצרים על ידי PCR או מסודרים באופן מסחרי ועליהם להכיל רצפים חופפים עם השברים השכנים להם. אם המוטציה המעניינת היא מוטציה נקודתית, הכנסה קטנה או מחיקה קטנה, ה-cDNA שעבר מוטציה יכול להיות מיוצר על ידי PCR על ידי ביצוע מוטגנזה מכוונת אתר בתבנית HDR המכילה את ה-WT cDNA. הפוך Escherichia coli מוכשר עם המוצר התאספו באמצעות שיטת הלם חום. לפני שמתחילים, מניחים את החיידקים להפשרה על הקרח למשך 10 דקות. הוסף 2 μL של המוצרים המורכבים ל 50 μL של חיידקים. מערבבים את התוכן על ידי הבהוב עדין. מניחים את הדוגמאות על קרח למשך 30 דקות. מעבירים את הדגימות לתרמובלוק שנקבע ל-42 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. מעבירים את הדגימות על הקרח למשך 5 דקות. הוסיפו 450 μL של SOC בינוני בטמפרטורת החדר ודגרו את הדגימות ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. מורחים את הדגימות על צלחות אגר LB המכילות אמפיצילין. עבור כל דגימה, יש למרוח 100 μL של שלושה דילולים שונים של תמיסת החיידקים (לא מדולל, 1:5 ו-1:10) על מנת לקבל לוחות אגר LB עם מושבות בודדות שניתן לקטוף. דגירה של הצלחות למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. למחרת, בחר שלוש מושבות לכל דגימה. מעבירים את המושבות לצינורות של 15 מ”ל עם פקקים המכילים 4 מ”ל של LB בינוני בתוספת אמפיצילין ודגירה למשך הלילה בשייקר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. Aliquot 500 μL של תמיסת החיידקים מכל מושבה ולאחסן אותה במקרר לשימוש מאוחר יותר. בצע מיני-הכנה כדי לחלץ DNA פלסמיד בהתאם להוראות היצרן. שלח את הדגימות לריצוף סנגר כדי לאשר את ההרכבה הנכונה של הפלסמידים. השתמש במספיק פריימרים המפוזרים ברחבי הפלסמיד כדי להבטיח אישור רצף ללא הפרעה, באופן אידיאלי לכסות כל אזור פעמיים בקריאות קדימה ואחורה. הוסיפו 200 מיקרון של תמיסת החיידקים המכילה את הפלסמיד שהורכב כהלכה ל-200 מ”ל של מצע LB בתוספת אמפיצילין ודגירה בשייקר למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בצעו הכנת מידי או מקסי כדי לחלץ את הדנ”א הפלסמיד בהתאם להוראות היצרן. אחסן את הדנ”א הפלסמיד ב- −20 °C. הכנת רקומביננטי AAV6הערה: יהיה צורך לבצע שתי הכנות נפרדות של AAV6: אחת עבור rAAV6 עם תבנית WT HDR ואחת עבור rAAV6 עם תבנית HDR שעברה מוטציה. סעיף זה מתאר את השלבים הדרושים להכנת וירוס אחד בלבד.הפשרת תאי HEK293T, מעבירים את התאים ל-10 מ”ל של DMEM מחומם מראש בתוספת 10% FBS, 1% P/S ו-25 mM HEPES, וצנטריפוגה ב-350 x g ב-RT למשך 5 דקות. להשעות את התאים בריכוז של 1 x 105 תאים / מ”ל ולהעביר בקבוקון מתאים (למשל, בקבוק 175 ס”מ2 ). מעבירים את הבקבוקון לחממה ב-37 מעלות צלזיוס / 5% CO2.הערה: יש להפשיר מראש תאי HEK293T על מנת לאפשר לתאים להתאושש באופן מלא ולקבל מספר מספיק של תאים (11 x 107 תאים נחוצים לייצור של וירוס אחד). מומלץ להשתמש בתאים לאחר מינימום של שלושה מעברים ולשמור על התאים מתחת ל-20 מעברים. יש לפצל תאי HEK293T שלוש פעמים בשבוע. תוך שמירה על התאים, אלה לא יעלה על 70%-80% מפגש. ה-DMEM המשמש להכנת AAV צריך גם להיות בתוספת L-גלוטמין ונתרן פירובט. לאסוף את התאים בצינור 50 מ”ל צנטריפוגה ב 350 x גרם ב RT במשך 5 דקות. להשעות את התאים ב-20 מ”ל של DMEM בתוספת 10% FBS, 1% P/S ו-25 mM HEPES ולספור עם המוציטומטר. השתמש בכחול טריפאן להרחקת תאים מתים. זרעים של 3 x 106 תאים ב-20 מ”ל של DMEM בתוספת 10% FBS, 1% P/S ו-25 mM HEPES בבקבוקבגודל 175 ס”מ 2. לייצור של וירוס אחד, להכין לפחות ארבעה 175 ס”מ2 צלוחיות. לדגור על התאים ב 37 °C / 5% CO2 במשך 3 ימים.הערה: שלב זה מבוצע בצורה הטובה ביותר ביום שישי מכיוון שהוא מאפשר לתאים להתרחב במהלך סוף השבוע. קציר וספירת תאי HEK293T. להכנת אחד הנגיפים, הכינו עשרה כלים בקוטר 150 מ”מ שכל אחד מהם מכיל 11 x 106 HEK293T ב-20 מ”ל DMEM בתוספת 10% FBS, 1% P/S ו-25 mM HEPES. מניחים את הכלים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס / 5% CO2 למשך 24 שעות. יש להשליך בזהירות את המדיום הישן ולהחליף ב-20 מ”ל של DMEM נטול אנטיביוטיקה בתוספת 10% FBS, 25 mM HEPES ו-1 mM נתרן בוטיראט. לפני שתמשיך, בדוק כי מפגש התאים אינו מעל 80%. הכינו שני צינורות 15 מ”ל שיכילו את תערובות הטרנספקציה. לצינור 1, יש להוסיף 5 מ”ל של מדיום מופחת בסרום, 60 מיקרוגרם של פלסמיד HDR שעבר מוטציה ב-rAAV6 ו-220 מיקרוגרם של pDGM6 (פלסמיד עוזר). לצינור 2, יש להוסיף 5 מ”ל של מדיום מופחת בסרום ו-1,120 מיקרו-ליטר של תמיסת פוליאתילנימין במינון 1 מ”ג/מ”ל (PEI, מגיב טרנספקציה). הוסף את התוכן של Tube 2 ל- Tube 1 ומערבולת במשך 30 שניות. דגירה במשך 15 דקות ב-RT כדי להבטיח עטיפה נכונה של הדנ”א לתוך מיצלות PEI.הערה: אין לשמור את הפתרון למשך יותר מ-20 דקות. מוסיפים בזהירות 1.1 מ”ל של התמיסה לכל מנה ומפזרים על ידי מערבולת עדינה. מניחים את הכלים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס / 5% CO2 במשך 48 שעות. לאחר 48 שעות, מוסיפים 250 μL של 0.5 M EDTA לכל מנה ומניחים את הכלים באינקובטור למשך 10 דקות. קציר התאים על ידי שטיפתם מהכלים והעברתם לצינור צנטריפוגה של 500 מ”ל או צינורות מרובים של 50 מ”ל. צנטריפוגה ב 2,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופר-נטנט. כדי להבטיח הסרה מלאה של supernatant, צנטריפוגה שוב ב 2,000 x גרם במשך דקה אחת ב 4 מעלות צלזיוס. השליכו את כל הסופרנאטים שנותרו. כל שארית של סופרנאטנט עלולה לפגוע בטיהור הנגיף. שחררו את הכדור על ידי מערבולות והוציאו את הנגיף באמצעות ערכת טיהור AAV (ראו טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן. לחלופין, בצע מיצוי על ידי אולטרה-צנטריפוגציה של יודיקסנול30,31. Aliquot את הנגיף מטוהר ולאחסן ב -80 °C (80 °F). טיטרט ה-AAV באופן פונקציונלי או כימות של טיטר ה-AAV על-ידי טיפות דיגיטליות PCR (ddPCR)32 על מנת לקבוע את תנאי ההתמרות האופטימליים. חזור על תהליך זה להכנת פלסמיד rAAV6 WT HDR. טיטרציה AAV על ידי ddPCRלפני שתתחיל, הגדר את בלוקי החימום ב 65 °C ו 98 °C (68 °F). חלצו דנ”א נגיפי על ידי הוספת 15 μL של תמיסת מיצוי DNA ל-5 μL של הנגיף. וורטקס במשך 15 שניות. דגירה במשך 6 דקות ב 65 מעלות צלזיוס. וורטקס במשך 15 שניות. דגירה במשך 2 דקות ב 98 מעלות צלזיוס. השתמש בדנ”א שחולץ (שהוא דילול 1:4 של הדנ”א הנגיפי) כדי להכין דילולים סדרתיים (1:400, 1:40,000, 1:160,000, 1:640,000) ללא נוקלאז (nf) H2O עבור ddPCR.הערה: ניתן לאחסן את הדילולים בטמפרטורה של −20 °C אם ה- ddPCR לא יבוצע באופן מיידי. בחר שלושה מהדילולים עבור ddPCR. בחירת הדילול לשימוש תלויה בריכוז הנגיף. רצוי, השתמש בשלושה דילולים שונים (לדוגמה, 1:40,000, 1:160,000 ו- 1:640,000) כדי למצוא את הדילול הטוב ביותר שנמצא בגבול הזיהוי של המכשיר. שמרו את הריאגנטים על הקרח בזמן העבודה. הכינו תערובת אב (כל הדוגמאות יימדדו בכפילויות). עבור כל תגובה, הכן את הדברים הבאים: 12.5 μL של ddPCR Supermix עבור בדיקות, ללא dUTP, 1.25 μL של בדיקת PrimeTime Std qPCR, AAV-ITR (ראה טבלת חומרים), ו- 6.25 μL nf-H2O. ערבבו 5 μL של דנ”א עם 20 μL של תערובת המאסטר. בצע זאת עבור דילולים של 1:40,000, 1:160,000 ו-1:640,000. הנח מחסנית במחזיק המחסנית. הוסף 70 μL של שמן ייצור טיפות לגשושיות בשורה הנקובה כ- Oil. היזהר לא ליצור בועות. הוסף 20 μL של נפח הדגימה בשורה הנקובה כדוגמה. היזהר לא ליצור בועות. אטמו את המחסנית עם האטם והניחו אותה במחולל הטיפות. צור את הטיפות על ידי לחיצה על כפתור ההפעלה במכונה, הסר את האטם, והעבר בזהירות, עם פיפטה רב ערוצית, 40 μL של הטיפות שנוצרו לתוך צלחת 96 באר. עבדו לאט כדי למנוע הרס של הטיפות ובועות האוויר. אטמו את צלחת 96 הבארות עם רדיד אלומיניום נוקב (הפס האדום הפונה כלפי מעלה) באמצעות איטום צלחת PCR. מניחים את הצלחת בתרמו-ציקלר. הגדר את עוצמת הקול ל- 40 μL, את טמפרטורת המכסה ל- 105 °C ואת קצבי הרמפה ל- 2 °C / s. הפעל את תוכנית ה-PCR כמתואר בטבלה 2. הפעל את קורא הטיפות 30 דקות לפני השימוש. פתח את התוכנה בשולחן העבודה. הזן את פריסת הלוחות ובחר ABS בכרטיסיית הניסוי ו – ddPCR Supermix בכרטיסייה Supermix. לאחר מכן, תחילה לחץ על PRIME, ולאחר מכן לחיצה על FLUSH SYSTEM על התוכנה כדי ליזום את המערכת. הזן את הצלחת לתוך הקורא. התחל את הריצה ולאחר שתסיים, ייצא את הנתונים כקובץ CSV לניתוח הבא כגיליון אלקטרוני.הערה: המספרים המופקים על-ידי התוכנה הם עותקי גנום (GC) לכל μL. אלה צריכים להיות מוכפלים בגורמי הדילול: GC/μL x 5 (דילול הדנ”א בתערובת הראשית) x דילול ראשוני (כלומר, 40,000 או 160,000). איור 3: סקירה סכמטית של מיקוד פנימי ואקסוני במהלך דפיקת HDR של CRISPR/Cas9 . השוואה סכמטית בין אסטרטגיות מיקוד אינטרוניות ואקסוניות עבור CRISPR/Cas9 HDR. (A) במהלך מיקוד אינטרוני, הפסקה דו-גדילית מוצגת באינטרון של הדנ”א. תבנית HDR מורכבת מרצף LHA, cDNA ו-RHA. המיקוד האינטרוני דורש, בנוסף, נוכחות של מקבל פרוסות המכיל את אתר השחבור 3′, נקודת ההסתעפות ומערכת הפוליפירימידין. זה מאפשר שחבור נכון. התיבה המנוקדת הירוקה מייצגת את האזור המתאים לרצף SA. הגודל של SA הוא 150 bp. (B) מיקוד אקסוני מסתמך על ייצור של שבר דו-גדילי ישירות באקסון. תבנית HDR מורכבת מרצף LHA, cDNA ו-RHA. התיבות המנוקדות הכתומות מציינות את האזורים המתאימים ל-LHA ול-RHA. הגודל האידיאלי של HAs הוא 400 bp כל אחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. מקדמים שם אורך תיאור: __________ SFFV 492 BP טחול להתמקד יוצר וירוס מקדם. מקדם יונקים חזק. ביטוי מכונן UBC 400 bp מקדם נגזר מהגן האנושי יוביקוויטין C. מבוטא באופן מכונן. CMV 508 BP מקדם נגזר Cytomegalovirus. הוא עשוי להכיל אזור משפר. מבוטא באופן מכונן. מקדם יונקים חזק. ניתן להשתיק. EF-1a 1182 BP תרגום אאוקריוטי אנושי גורם התארכות 1 מקדם אלפא. מבוטא באופן מכונן. מקדם יונקים חזק. EFS 200-300 כ”ס EF-1 אלפא אינטרון ללא צורה קצרה קג”ג 584 BP מקדם יונקים היברידיים המכיל את משפר ה-CMV המוקדם (C), מקדם הבטא-אקטין של העוף (A), ומקבל השחבור של הגן בטא-גלובין ארנב (G). מבוטא באופן מכונן. אותות פוליאדנילציה (PolyA) קיצור אורך תיאור: __________ SV40 פוליה 82-122 כ”ס וירוס סימיאן 40 אות פוליאדנילציה bGH פוליה 224 BP אות פוליאדנילציה של הורמון גדילה בקר rbGlob PolyA 56 BP אות פוליאדנילציה של בטא גלובין ארנב טבלה 1: מקדמים ואותות פוליאדנילציה. צעד טמפרטורה זמן מחזורים הפעלת אנזים 95°C 10 דקות פי 1 דנטורציה 94°C 30 שניות פי 42 חישול 60°C דקה 1 סיומת 72°C 30 שניות השבתת אנזימים 98°C 10 דקות פי 1 אחז 4°C ∞ טבלה 2: תוכנית PCR טיפתית דיגיטלית. 3. עריכה של HSPCs טרנספקציה והתמרה של HSPCsהפשירו CD34+ HSPCs והעבירו את התאים ל-10 מ”ל של RPMI מחומם מראש בתוספת 1% P/S. צנטריפוגה ב-350 x גרם ב-RT למשך 10 דקות. להשעות את התאים במדיום שימור HSPC לריכוז של 2.5 x 105 תאים / מ”ל ולדגור ב 37 °C / 5% CO2 במשך 48 שעות – 72 שעות. לקצור את התאים בצינור 15 מ”ל. ספור את התאים ובדוק את כדאיות התאים על-ידי הרחקה של טריפאן כחול. בין 2 x 10 5 ו5 x 106 תאים ניתן nucleofected ב cuvette אחד. הכינו את המספר המתאים של cuvettes בהתאם למספר התא המחושב שלכם. הכן את קומפלקס RNP. בצינור של 1.5 מ”ל, הוסיפו 15 מיקרוגרם של Cas9 ו-8 מיקרוגרם של sgRNA (יחס טוחן 1:2.5) ודגרו ב-25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בבלוק חימום. בזמן שקומפלקס ה-RNP דוגר, סובבו את התאים בגודל של 350 x g למשך 5 דקות והשליכו את הסופר-נטנט. להשעות את התאים ב 100 μL של תמיסת נוקלאופקציה. מערבבים את התאים עם קומפלקס RNP ומעבירים לתוך הקובט. טפחו בעדינות על הקובט כדי להסיר שאריות של בועות אוויר שעשויות להיווצר במהלך ההעברה. הכנס את הקובט למחזיק של מערכת הטרנספקציה וחשמל את התאים כפי שתואר קודם לכן בסעיף תכנון sgRNA. מיד לאחר האלקטרופורציה, יש להוסיף 400 μL של מדיום שימור HSPC שחומם מראש ללא P/S ולהעביר את התאים עם פיפטה העברה עדינה לתוך צלחת תרבית רקמה המכילה 500 μL של מדיום שימור HSPC מחומם מראש ללא P/S. בהתאם למספר התא, השתמש בלוח תרבית מתאים (צלחת 24, 12 או 6 בארות) על מנת להגיע לצפיפות שבין 0.25 x 106 לבין 1 x 106 תאים / מ”ל. מעבירים את הצלחת לחממה ב 37 מעלות צלזיוס / 5% CO2. הפשירו את הבקבוקונים המכילים את ה-rAAVs הקפואים על הקרח. התמר את התאים על ידי הזרמת הכמות האופטימלית של כל rAAV6 לתרחיף התא. בצע את ההתמרה תוך 20-30 דקות לאחר האלקטרופורציה כדי לקבל יעילות התמרה גבוהה.הערה: יש לקבוע בניסוי את הריכוז האופטימלי של כל וירוס (וירוס אחד עבור תבנית WT HDR ווירוס נפרד אחר עבור תבנית HDR שעברה מוטציה). בדרך כלל, 5,000-10,000 GC/תא (למשל, 5 x 109 GC עבור 1 x 106 תאים ) לגרום להתמרה גבוהה. מערבבים בעדינות את מתלה התא עם הפיפטה. דגירה של התאים המתמרים במשך 6-8 שעות ב-37 מעלות צלזיוס / 5% CO2. לאחר 6-8 שעות, לאסוף את התאים בצינור צנטריפוגה ב 350 x גרם ב RT במשך 5 דקות. השליכו את המדיום הישן והחליפו במדיום שימור HSPC טרי שחומם מראש בתוספת P/S. להשעות את התאים בריכוז שבין 2.5 x 10 5-5x 10 5 תאים למ”ל ולהעביר לצלחת תרבית תאים שטופלה ברקמה (צלחת 24, 12 או6-well). דגירה של התאים במשך 48 שעות ב-37 °C/5% CO2 לפני שתמשיך במיון. מיון זרימה של HSPCs מהונדסים הנושאים את מוטציית GOF ההטרוזיגוטיתקצירת התאים בצינור של 15 מ”ל וצנטריפוגה בגודל 350 x גרם ב-RT למשך 5 דקות. הסר את הסופרנטנט, השעה את התאים ב-1 מ”ל של DPBS המכיל 0.1% BSA, וצנטריפוגה שוב ב-350 x g ב-RT למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט והשעו את התאים בנפח מתאים של DPBS + 0.1% BSA בהתאם למספר התא.הערה: מומלץ להשעות את התאים בנפח מינימלי של 200 μL ולא יעלה על 1 x 107 תאים למ”ל על מנת להפחית את הסיכון לסתימת המיון. העבר את התאים לצינור FACS סטרילי המצויד בכובע. הוסיפו 7-AAD או צבע כדאיות אחר (בהתאם לתאימות שלהם לחלבונים הפלואורסצנטיים) לתרחיף התאים להרחקת תאים חיים/מתים. מיין את התאים החיים שהם חיוביים כפולים עבור חלבוני הכתב הפלואורסצנטי לצינור איסוף המכיל 200 μL של מדיום שימור HSPC.הערה: יש להוסיף פקדים מתאימים המורכבים מתאים מתאים המומרים באמצעות AAVs בלבד כדי להבטיח סידור תקין במהלך הליך המיון. צנטריפוגה של התאים הממוינים ב-350 x g ב-RT למשך 5 דקות והשהה את התאים במדיום שימור HSPC בריכוז של 2.5 x 105 תאים /מ”ל להרחבה נוספת בתרבית או השתמש בתאים ישירות לבדיקות פונקציונליות. 4. אישור על עריכת גנים מוצלחת מיצוי DNA גנומילפני שתתחיל, הגדר את בלוקי החימום ב 65 °C ו 98 °C (68 °F). קציר 2 x 10 5 תאים ערוכים גנום ומטוהרים מיון וצנטריפוגה ב 350 x גרם במשך5 דקות. חלץ את ה- gDNA כפי שתואר קודם לכן. השתמש בתמיסת ה- DNA ישירות עבור PCR או אחסן ב- −20 °C. PCR פנימיתכננו שני פריימרים כדי להגביר את אתר ההחדרה 5′ (איור 4A): פריימר קדימה 1 מכוון למוקד הגנומי מחוץ לזרוע ההומולוגיה השמאלית; פריימר הפוך 2 מכוון לרצף המשולב. עבור ה-PCR הנכנס, הכן את תערובת ה-PCR הבאה לכל תגובה:10 מיקרון של תערובת מאסטר PCR (2x; ראו טבלת חומרים)1 μL של פריימר קדימה 1 (10 μM מלאי)1 μL של פריימר הפוך 2 (מלאי של 10 μM)0.5-1.0 μL של דנ”א שחולץנטול נוקלאז H2O עד לנפח סופי של 20 μLהערה: עבור יותר מתגובה אחת, מומלץ להכין תערובת אב המכילה תגובה אחת נוספת כדי להסביר שגיאות פיפטינג. חשוב לכלול בקרה שאינה תבנית ודנ”א של תבנית מדגימה שטופלה בלעג. הפעל את תגובות ה-PCR באמצעות תוכנית המחזור התרמית המתאימה (עיין בהוראות היצרן).הערה: מומלץ לבדוק תחילה את זוג הפריימרים לקבלת טמפרטורת החישול האופטימלית. זה יכול להיעשות על ידי חישוב Tm ולאחר מכן על ידי הפעלת PCR עם thermocycler שיכול לבצע טמפרטורה הדרגתית. הפעל את מוצרי ה-PCR עם סולם דנ”א על ג’ל אגרוז של 1.5% ב-100 וולט למשך 45-60 דקות (איור 4B). הניחו את הג’ל על אור כחול או על טרנסילומינטור UV. הבלו את הרצועות מן הג’ל. חלצו את הדנ”א מהרצועות באמצעות ערכת מיצוי ג’ל DNA. שלח את דגימות ה- PCR שחולצו עם פריימרים מתאימים לריצוף סנגר כדי לאשר את האינטגרציה הנכונה והחלקה של ה- cDNA הרצוי במוקד הגן האנדוגני. איור 4: אימות של אינטגרציה גנומית על-ידי PCR in-out . (A) ייצוג סכמטי של אסטרטגיית ה-PCR הנכנסת. באסטרטגיה המתוארת תוכננו שני פריימרים. הפריימר קדימה 1 מכוון ללוקוס הגנומי מחוץ ל-LHA, והפריימר הפוך 2 מכוון לרצף הממוטב לקודון. (B) ייצוג סכמטי של אלקטרופורזה בג’ל אגרוז. רק תאים שעברו עריכה מוצלחת (RNP + AAV) ייצרו מוצר PCR במהלך ה-PCR הנכנס, בעוד שהדגימות הלא ערוכות (AAV בלבד) לא ייצרו מוצר PCR. קיצור: NTC = פקד שאינו תבנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.