大肠杆菌抗生素持久性的群体和单细胞分析

注意：使用无菌培养玻璃器皿、移液器吸头和生长培养基。在这里， 大肠杆菌 细胞在低自发荧光化学定义的培养基中生长（见 材料表）。接种在本生燃烧器存在的情况下进行，以尽量减少污染风险。 1. 细胞培养和生长曲线 在Luria-Bertaini（LB）琼脂平板上从冷冻甘油原液中划线感兴趣的菌株（如果需要，补充有选择性抗生素），并在37°C孵育过夜（15小时至19小时之间）以获得单个菌落。注意：这里介绍的实验使用两种菌株，对应于wt菌株的大肠杆菌K-12 MG1655和同基因MG1655 hupA-mCherry菌株22。后一种菌株表达HU类核相关蛋白的荧光标记α亚基。hupA-mCherry报告器集成在hupA的原生位点。HU-mCherry作为代理来跟踪活细胞中的类核动力学，因为它以非特异性方式与DNA结合。 接种 5 mL 培养基（此处为 3-[N-吗啉基] 丙烷磺酸基培养基 [MOPS];表1，表2和表3）补充有葡萄糖0.4%和选择性抗生素（如果需要），在玻璃管（≥25mL）中分离菌落，并将管置于设置为37°C和每分钟180转（rpm）的振荡培养箱中过夜（15小时至19小时之间）。或者，可以使用塑料管、玻璃或塑料烧瓶（≥ 25 mL）代替玻璃管。注意：在整个本文描述的实验中使用了补充有最终浓度为0.4%的甘油的MOPS培养基，除了在MOPS葡萄糖0.4%中进行的过夜培养物。补充葡萄糖的MOPS中 大肠杆菌 的生成时间短于MOPS甘油。在此步骤中使用MOPS葡萄糖0.4%而不是MOPS甘油0.4%可确保细胞在19小时内到达固定相。也可以使用其他生长培养基，例如补充有不同碳源的M9或富定义培养基（RDM）。然而，应该注意的是，生长速率和持久性频率因所用介质和/或碳而异23. 第二天早上，将1mL培养物以2，300×g离心3分钟，弃去上清液，并将沉淀轻轻重悬于相同体积的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。测量 600 nm （OD 600 nm） 处的光密度，并计算初始OD 600 nm 为 0.01nm 所需的体积，最终体积为 2 mL。 将 2 mL MOPS 甘油 0.4% 培养基放入透明底部 24 孔板的孔中，并接种计算的过夜培养体积。将24孔板置于自动酶标仪（参见 材料表）中以监测OD600nm24 小时。将酶标仪设置为在37°C的温度和高轨道旋转（140rpm）下每15分钟测量OD600nm 。注意：如果实验中使用的菌株编码荧光报告基因，请确保其生长速率与 wt 的生长速率相当，以避免在随后的实验中出现任何伪影，因为生长速率会影响抗生素的持久性频率23。由于极低细胞密度下的检测局限性以及对OD600 nm/菌落形成单位（CFU）关系的潜在菌株特异性影响，建议在处理未表征的菌株时通过监测CFU·mL-1 来评估生长动力学。 2.抗生素最小抑菌浓度的测定 注意：最低抑制浓度（MIC）定义为未观察到细菌生长的最低剂量的抗生素。需要对每种抗生素和菌株进行MIC的测定。在这里描述的实验中，使用了氟喹诺酮类抗生素氧氟沙星（OFX）。MIC的测定可以确认抗生素溶液已正确制备，抗生素具有活性，并且菌株对抗生素同样敏感。在这里，执行已发表的琼脂稀释方法以确定所用不同菌株的MIC到OFX24。给定抗生素对给定细菌菌株的MIC也可以通过肉汤稀释法24来确定。 制备用于MIC测定的板通过将 5 mg OFX 溶解在 1 mL 超纯水中，为实验中使用的抗生素制备主储备溶液。加入 20 μL 37% HCl 以增加 OFX 的溶解度。 融化100mL无菌LB琼脂，并保持在55°C以避免凝固。准备六个小玻璃烧瓶（25 mL），并使用无菌移液管将5 mL液体LB琼脂培养基移液到每个烧瓶中。 在 90 μL 超纯水中稀释 10 μL 的 5 mg·mL-1 OFX 原储备液（母原液的 1：10 稀释度）。向含有 5 mL 琼脂培养基的六个玻璃烧瓶中分别加入 0 μL、2 μL、4 μL、6 μL、8 μL 或 10 μL 的 500 μg·mL-1 OFX 溶液中，以生成终浓度为 0 μg·mL−1、0.02 μg·mL−1、0.04 μg·mL−1 的 LB 琼脂培养基， 分别为0.06 μg·mL−1、0.08 μg·mL−1和0.1 μg·mL-1 OFX。通过旋转烧瓶几次来混合溶液。注意：如果已知目标抗生素的MIC，则浓度范围应从低于实际MIC到高于实际MIC为止。如果 MIC 未知，建议使用log2 稀释系列的大浓度范围。在添加抗生素之前，请确保LB琼脂培养基已冷却，因为高温可能会使其失活。然而，重要的是在添加抗生素之前不要让LB琼脂培养基凝固，因为这可能导致抗生素在LB琼脂培养基中的非均匀分布。 使用无菌移液管将步骤2.1.3中制备的6种LB琼脂培养基中的每一种5mL以剂量递增的方式倒入6孔培养板中。让琼脂冷却直至凝固，并在使用前将板干燥。注意：在进行测定的当天准备抗生素溶液和培养板。 MIC 测定测定将5mL LB培养基与玻璃管（≥25mL）中的分离菌落接种，并将玻璃管置于设置为37°C和180rpm的振荡培养箱中过夜（15小时至19小时之间）。 第二天早上，测量OD600nm，并将培养物稀释到试管中至PBS中的最终细胞密度为1 x 107 CFU·mL-1 。对于此处测试的菌株，1 x 107 CFU·mL−1 对应于 OD600 nm 为 0.0125。注意：如果CFU·mL-1与OD 600 nm之间的相关性未知，则应建立CFU和OD 600 nm测量确定的生长曲线，以计算CFU·mL-1与OD 600 nm之间的相关因子。 将 2 μL 先前稀释的培养物点到干燥的 6 孔板的每个孔上。在将板放入37°C的培养箱中过夜（15小时至19小时之间）之前，让斑点干燥。 第二天，计算每个孔中形成的菌落。MIC对应于未检测到细菌生长的抗生素最低浓度的孔。 3. 点测定 注意：点测定方法是一种定性方法，可以估计活细胞（抗生素应激后能够产生集落的细胞）的数量。在定时杀灭测定之前进行点测定，以深入了解测试条件下使用的菌株的可行性，并告知定时杀灭测定期间所需的稀释度（见第4节）。 为了制备用于点测定的LB琼脂平板，将50mL的LB琼脂倒入方形培养皿（144cm2）中。每个时间点准备一个方形培养皿。让LB琼脂凝固，并在使用前干燥平板。 在玻璃管（≥25mL）中接种5mL培养基（MOPS葡萄糖0.4%），并将管置于设置为37°C和180rpm的振荡培养箱中过夜（15小时至19小时之间）。 第二天，测量OD600nm，并将培养物稀释到玻璃管（≥25mL）中的新鲜温度调节培养基（37°C，MOPS甘油0.4%）中至最终OD600nm ~0.001。让培养物在37°C的培养箱中以180rpm（15小时至19小时）生长过夜。 第二天，测量OD 600nm，并将培养物孵育至最终OD600nm为0.3。 孵育时，通过将 90 μL 的 0.01 M MgSO4 溶液放入除第一行（A 行）的孔之外的每个孔中来制备 96 孔板。96孔板将用于步骤3.7中的10倍系列稀释。注意：在本实验中，在七个不同的时间点对两种菌株（wt 和 hupA-mCherry 菌株）一式三份进行测试。由于一块板由12根色谱柱组成，因此一块板可用于两个时间点，因此总共制备了四个板。 在OD 600nm为0.3时，提取每种细菌培养物的200μL 。这些样品对应于抗生素治疗前的t0（未处理）时间点，并允许在抗生素治疗前测定CFU·mL-1 。 将样品以2，300 x g 离心3分钟。在离心期间，将所需浓度的OFX加入液体培养物中，并在振荡的同时继续在37°C下孵育。注意：这里使用浓度为5μg·mL-1 的OFX（相当于MIC乘以83倍）。在先前的研究中，该浓度用于表征OFX暴露25下的持久性现象。用于定时/杀灭测定的抗生素浓度可能因抗生素、培养基和细菌生长状态而异。 离心后，将细胞沉淀重悬于200μL的0.01M MgSO4 溶液中。将 100 μL 放入步骤 3.5 中制备的 96 孔板的空孔中。通过将 10 μL A 行的孔转移到含有 90 μL 0.01 M MgSO4 的 B 行孔中进行稀释。通过将 B 行中的 10 μL 孔转移到 C 行的孔中来继续连续稀释.重复直至达到 10−7 的稀释度（每次转移为 10 倍稀释）。注意：在本实验中，每个时间点测试六种培养物（三种用于 wt 菌株，三种用于 hupA-mCherry 菌株）。根据该方案，使用多通道移液器同时对六种菌株进行连续稀释。为了尽量减少技术错误，移液器吸头在每次转移之间更换。 将每种稀释液的 10 μL 点到步骤 3.1 中制备的 LB 琼脂平板上。注意：多通道移液器用于同时发现六种培养物的相同稀释度（例如，10−4 稀释液）。在点样过程中，应使用多通道移液器的第一挡块，而不推第二挡块，因为这会导致微滴被分配到板上。 在加入抗生素后的相关时间点，取出 200 μL 培养物，并按照步骤 3.8 中所述进行连续稀释。如步骤 3.9 中所述，点缀每次稀释液 10 μL。注意：对于此处描述的实验，收集了七个时间点（t0，t1h，t2h，t3h，t4h，t5h，t6h）。对于与 wt 相比表现出更高的抗生素敏感性的菌株，可以在MgSO4 0.01 M中进行多次洗涤以去除残留的抗生素。 将板在37°C孵育过夜（15小时至19小时之间）。第二天，计算可以检测到菌落的两个最高稀释度的菌落数。理想情况下，琼脂平板上用于这些稀释液的斑点包含3至30个菌落，从而可以准确测定每个样品的CFU·mL-1 。 通过将计算出的每个时间点的CFU·mL-1除以t0处初始群体的CFU·mL-1来计算生存率。 4. 定时杀伤测定 注意：虽然斑点测定是一种易于使用的方法，用于估计给定抗生素的给定菌株的存活率，但定时杀灭测定可提供更高分辨率的存活率，并且用于准确量化细菌活力。杀伤曲线的轮廓可用于确定给定细菌菌株在给定条件下是否对抗生素敏感、耐受或耐药。此外，定时杀灭测定可以确定检测持久性现象（双相杀灭曲线第二斜率的开始）以及持久性频率所需的抗生素暴露时间。 准备LB琼脂平板用于定时电镀测定。将 25 mL LB 琼脂倒入培养皿 （±57 cm2） 中。每个时间点至少准备两个培养皿（每个时间点接种每个菌株两次稀释）。 让LB琼脂凝固，并干燥平板，然后向每个平板添加五到八个无菌玻璃珠。根据应变/条件/时间点倒置并标记板。注意：玻璃珠允许细菌在步骤4.7和步骤4.9期间在琼脂平板上传播。或者，可以使用撒布器将细胞分散在琼脂平板上。 对于每个样品，制备含有 900 μL 0.01 M MgSO4 溶液的 10 倍系列稀释玻璃管。每个样品需要制备的稀释玻璃管数量对应于在斑点测定中检测菌落所需的稀释度。 在玻璃管（≥25mL）中接种5mL培养基（MOPS葡萄糖0.4%），并将管置于设置为37°C和180rpm的振荡培养箱中过夜（15小时至19小时之间）。 生长16小时后，测量OD 600nm，并将培养物稀释到玻璃管中的新鲜温度调节培养基（37°C，MOPS甘油0.4%）中至最终OD600nm~0.001。让培养物在37°C的培养箱中以180rpm（15小时至19小时）生长过夜。 第二天，测量OD 600nm，并将培养物孵育至最终OD600nm为0.3。 在OD 600nm为0.3时，取出100μL培养物，根据斑点测定中获得的数据稀释（在OD 600nm为0.3且不含抗生素的情况下，10-5稀释通常产生200-300菌落），并在步骤4.1-4.2制备的LB琼脂平板上平板100μL。 轻轻摇动平板以避免珠子接触培养皿边缘，因为这会导致细菌细胞在LB琼脂培养基上的非均匀扩散。抗生素治疗前的第一个样本对应于t0时间点（抗生素治疗前的CFU·mL-1）。 加入所需浓度的OFX，并在振荡的同时继续在37°C下孵育。注意：这里使用浓度为5μg·mL-1 的OFX（相当于MIC乘以83倍）。 在加入抗生素后的相关时间点，取出100μL培养物，根据点测定中获得的数据稀释，并在步骤4.1-4.2制备的LB琼脂平板上平板100μL。如步骤4.7所述将细胞铺板。注意：对于此处描述的实验，收集了七个时间点（t0，t1h，t2h，t3h，t4h，t5h，t6h）。对于与 wt相比表现出更高的抗生素敏感性的菌株，可以在MgSO4 0.01 M中进行多次洗涤以去除残留的抗生素。 将板在37°C孵育过夜（15小时至19小时之间）。第二天，计算可以检测到菌落的两个最高稀释度的菌落数。理想情况下，板应包含30-300个菌落，以便准确测定每个样品中的CFU·mL-1 。 通过对每个时间点的CFU·mL-1在t0处的CFU·mL-1进行归一化来计算存活率。将对数10 归一化 CFU·mL-1 绘制为时间的函数。 5. 微流控延时显微镜成像 注意：以下部分描述了微流体板的制备以及延时图像采集和图像分析程序。本实验的目的是在单细胞水平上观察和分析抗生素治疗后的持久性表型。在该实验期间收集的数据可用于产生广泛的结果，具体取决于所解决的问题和/或实验中使用的荧光报告基因。在这里描述的实验中，对细胞长度和HU-mCherry荧光22进行了定量分析，反映了持久性和非持久性细胞中的类核组织。 用于微流控延时显微镜的细菌细胞培养将5mL培养基（MOPS甘油0.4%，如果需要，补充选择性抗生素）接种在玻璃管（≥25mL）中的分离菌落，并将管置于设置为37°C和180rpm的振荡培养箱中过夜（15小时至19小时之间）。 第二天，测量OD 600nm，并将培养物在玻璃管中的新鲜温度调节培养基（37°C，MOPS甘油0.4%）中稀释至最终OD600nm~0.001。让培养物在37°C和180rpm的振荡培养箱中生长过夜（15小时至19小时），以便在第二天获得早期指数期培养物。 微流控板的制备和延时显微镜成像注意：微流体实验可以在市售的微流体装置（如此处所述）或内部生产的微流体系统中进行。从微流体板的每个孔中取出保存溶液（如果存在），并用新鲜培养基替换它。注意：如果微流控板包含废物出口井，则应去除出口井的保存溶液，但不要用介质替换。 通过单击“ 密封 ”按钮或通过微流体软件（首先选择“工具”，然后选择“密封板”）使用歧管系统 密封微流控 板。注意： 要密封板，应通过手动将板挤压到歧管上，对板和歧管施加均匀的压力。如果执行正确，注释“密封”应出现在 ONIX2 界面上。重要的是不要对载玻片施加任何压力，以避免任何破坏歧管的潜在风险。 密封后，执行第一个启动序列（单击微流体软件界面上的运行 液体启动序列 ）。注意： 运行液体 灌注顺序对应于1-5孔在6.9 kPa下灌注5分钟，然后对于8井在6.9 kPa下灌注5分钟，在6.9 kPa下对6井进行最后一次灌注，持续5分钟。 运行液体灌注序列 允许去除可能仍然存在于连接不同孔的通道中的保护溶液。 在显微镜成像开始之前，将板在显微镜的恒温控制柜中以所需温度（此处为37°C）孵育至少2小时。 在开始实验之前开始第二次 运行液体启动序列 。 通过单击微流体软件界面上的密封来密封微流控板。用 200 μL 新鲜培养基替换孔 1 和孔 2 中的培养基，在孔 3 中用 200 μL 含有抗生素的新鲜培养基替换培养基（此处为 5 μg·mL−1），在孔 4 和孔 5 中用 200 μL 新鲜培养基替换培养基，在孔 6 中用 200 μL 新鲜培养基替换培养基，在孔 8 中用 200 μL 培养样品（来自步骤 5.1.2）稀释至OD 600 nm 在新鲜培养基中为 0.01。 如步骤5.2.2所述密封微流控板，并将板放在显微镜柜内的显微镜物镜上。注意：在放置微流体板之前，请确保将一滴浸油滴在显微镜物镜上。 在微流控软件中，单击细胞加载以允许将 细胞加载 到微流控板中。注意： 细胞加载 步骤包括8号井在13.8 kPa下灌注15秒，然后对6号井和8号井在27.6 kPa下灌注15秒，以及6.9 kPa下6井的最终灌注轮30秒。微流控板中细胞的密度对于实验至关重要。该微流体方案的第一部分包括在抗生素治疗之前在新鲜培养基中培养细菌6小时。生长6小时后，细胞密度必须足以检测稀有的持久性细胞（在本研究中使用的条件下，持久性细胞以10-4的频率生成）。如果细胞密度太高，则难以区分单个细胞，从而无法进行精确的单细胞分析。由于生长速率直接取决于培养基，因此在开始实验之前应评估显微镜视野中的细胞密度。 使用透射光模式设置最佳焦点，并选择几个观察适当细胞数的感兴趣区域 （ROI）（每个视场最多 300 个细胞）。注意：选择至少 40 个 ROI 以确保对稀有的持久性细胞进行成像。 在微流体软件上，单击 创建协议。编程以6.9kPa注射新鲜培养基6小时（孔1-2），然后以6.9kPa注射含有抗生素的培养基6小时（孔3），最后以6.9kPa注射新鲜培养基20小时（孔4-5）。注意：稀释至OD600nm 的细菌培养物为0.01，允许细菌在微流体室中生长6小时，确保细胞处于指数生长期。根据在加载步骤中引入微流体装置的细胞数量（参见步骤5.2.8），可以调整生长期的持续时间以获得每个ROI最多300个细胞。由于持久性是一种罕见现象，因此增加每个ROI的细胞数量可以提高观察持久性细胞的可能性。但是，每个ROI的细胞数不应超过300个细胞，因为这使得单细胞分析变得乏味。 在延时模式下使用透射光和荧光报告基因的激发光源每 15 分钟进行一帧的显微镜成像。这里，使用了用于mCherry信号的560 nm激发光源（580 nm LED，功率为10%，滤光片00 [530-585 ex，615LP em，蔡司]和mCherry的100 ms曝光）。蔡司兼容的Zen3.2软件用于细胞成像。 图像分析注意：显微镜图像的打开和可视化是使用开源 ImageJ/Fiji 软件 （https://fiji.sc/）26 执行的。定量图像分析使用开源的ImageJ/Fiji软件和免费的MicrobeJ插件（https://microbej.com）27进行。在该协议中，使用了MicrobeJ 5.13I（14）版本。打开计算机上的 ImageJ/Fiji 软件，然后将超堆栈延时显微镜图像拖到斐济加载栏中。使用 “图像>颜色”>“合成” 来融合超堆栈的不同通道。如果延时实验的通道与所需颜色不对应（例如，相衬显示为红色而不是灰色），请使用 “图像>颜色”>“排列通道 ”将适当的颜色应用于通道。 打开 MicrobeJ 插件，使用手动编辑界面检测细菌细胞。删除自动检测到的单元格，并逐帧手动勾勒感兴趣的持久单元格。注意：可以使用不同的设置来自动检测单个细胞。这里使用手动检测，因为分析的持久细胞形成长丝，很少使用自动检测正确检测。 检测后，使用 MicrobeJ 手动编辑界面中的 Result 图标生成 ResultJ 表。保存 ResultJ 文件，并使用 ResultJ 表深入了解单细胞分析感兴趣的不同参数。在该协议的情况下，输出HU-mCherry强度，细胞长度和单个细胞的细胞面积的平均荧光。