Um ensaio de fluorescência de cálcio de "dupla adição" para a triagem de alto rendimento de receptores acoplados à proteína G recombinante
Summary
Neste trabalho, um ensaio de fluorescência de cálcio intracelular de alto rendimento para placas de 384 poços para rastrear pequenas bibliotecas de moléculas em receptores acoplados à proteína G recombinante (GPCRs) é descrito. O alvo, o receptor de cinina do carrapato da febre do gado, Rhipicephalus microplus, é expresso em células CHO-K1. Este ensaio identifica agonistas e antagonistas usando as mesmas células em um ensaio de “adição dupla”.
Abstract
Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) representam a maior superfamília de receptores e são os alvos de inúmeras drogas humanas. A triagem de alto rendimento (HTS) de bibliotecas aleatórias de pequenas moléculas contra GPCRs é usada pela indústria farmacêutica para a descoberta de medicamentos específicos do alvo. Neste estudo, um HTS foi empregado para identificar novos ligantes de moléculas pequenas de neuropeptídeos específicos de invertebrados GPCRs como sondas para estudos fisiológicos de vetores de patógenos humanos e veterinários mortais.
O receptor de cinina específico para invertebrados foi escolhido como alvo porque regula muitos processos fisiológicos importantes em invertebrados, incluindo diurese, alimentação e digestão. Além disso, a farmacologia de muitos GPCRs de invertebrados é mal caracterizada ou não é caracterizada; portanto, a farmacologia diferencial desses grupos de receptores em relação aos GPCRs relacionados em outros metazoários, especialmente humanos, acrescenta conhecimento às relações estrutura-atividade dos GPCRs como uma superfamília. Um ensaio HTS foi desenvolvido para células em placas de 384 poços para a descoberta de ligantes do receptor de cinina do carrapato da febre do gado, ou carrapato do gado do sul, Rhipicephalus microplus. O receptor de cinina do carrapato foi expresso de forma estável em células CHO-K1.
O receptor de cinina, quando ativado por neuropeptídeos endógenos de cinina ou outros agonistas de moléculas pequenas, desencadeia a liberação de Ca2+ das reservas de cálcio no citoplasma. Este ensaio de fluorescência de cálcio combinado com uma abordagem de “adição dupla” pode detectar moléculas de “impacto” de agonistas funcionais e antagonistas na mesma placa de ensaio. Cada ensaio foi conduzido usando placas de drogas carregando uma matriz de 320 pequenas moléculas aleatórias. Um fator Z confiável de 0,7 foi obtido, e três moléculas de ataque agonista e dois antagonistas foram identificados quando o HTS estava em uma concentração final de 2 μM. O ensaio de fluorescência de cálcio relatado aqui pode ser adaptado para rastrear outros GPCRs que ativam a cascata de sinalização Ca2 +.
Introduction
Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs), que estão presentes desde a levedura até os seres humanos, representam a maior superfamília de receptores em muitos organismos1. Eles desempenham papéis críticos na regulação de quase todos os processos biológicos em animais. Existem 50-200 GPCRs no genoma dos artrópodes, o que significa que eles representam a maior superfamília de receptores de membrana2. Eles são classificados em seis classes principais, A-F, com base em sua similaridade de sequência e funções3. Os GPCRs transduziram vários sinais extracelulares, como os de hormônios, neuropeptídeos, aminas biogênicas, glutamato, prótons, lipoglicoproteínas e fótons4. Os GPCRs se acoplam às proteínas G heterotrímeras (Gα, Gβ e Gγ) para transmitir sinais a jusante. Os GPCRs acoplados às proteínas Gαs ou Gαi/o aumentam ou diminuem, respectivamente, os níveis intracelulares de 3′, 5′-monofosfato cíclico de adenosina (cAMP) ativando ou inibindo a adenilil ciclase. GPCRs acoplados a Gαq/11 induzem a liberação de cálcio dos estoques de cálcio do retículo endoplasmático ativando a via fosfolipase C (PLC)-inositol-1,4,5-trifosfato (IP3). GPCRs acoplados a Gα12/13 ativam fatores de troca de nucleotídeos RhoGTPase 5,6. Os GPCRs são alvo de mais de 50% dos medicamentos humanos e de um acaricida, o amitraz4. À medida que os GPCRs transduzem sinais tão diversos, eles são alvos promissores para o desenvolvimento de novos pesticidas que interrompem as funções fisiológicas específicas dos invertebrados.
O objetivo do HTS é identificar moléculas de sucesso que podem modular as funções do receptor. A HTS envolve o desenvolvimento de ensaios, miniaturização e automação7. Os GPCRs neuropeptídicos artrópodes estão envolvidos na maioria das funções fisiológicas, como desenvolvimento, muda e ecdise, excreção, mobilização de energia e reprodução4. A maioria dos GPCRs neuropeptídicos de artrópodes e metazoários sinaliza através da cascata de sinalização de cálcio 2,6,8,9,10, como nos receptores de peptídeo mioinibitório e SIFamida do carrapato Ixodes scapularis; seus ligantes são antagônicos nos ensaios de motilidade do intestino traseiro, com o SIF provocando contração e a PImáx inibindo-a11,12. Um receptor do mosquito da febre amarela, semelhante ao NPY, o Aedes aegypti, regula a busca de hospedeiros fêmeas13. Em comparação com outros ensaios alternativos de mobilização de cálcio, como o ensaio de bioluminescência de cálcio aequorina14, o ensaio de fluorescência de cálcio é fácil de executar, não requer a transfecção de outras proteínas recombinantes de detecção de cálcio e é econômico. O ensaio de fluorescência de cálcio produz um sinal prolongado em comparação com o sinal cinético rápido obtido no ensaio de bioluminescência de cálcio de aequorina14,15.
No exemplo aqui, o receptor de cinina do carrapato da febre bovina, Rhipicephalus microplus, foi expresso recombinantemente na linhagem celular CHO-K1 e usado para o ensaio de fluorescência de cálcio. Existe apenas um gene receptor de cinina encontrado em R. microplus; o receptor sinaliza através de uma via de sinalização dependente da proteína Gq e desencadeia o efluxo de Ca2+ das reservas de cálcio para o espaço intracelular16. Esse processo pode ser detectado e quantificado por um fluoróforo, que provoca um sinal de fluorescência ao se ligar a íons cálcio (Figura 1).
O receptor de cinina é um GPCR específico de invertebrados, que pertence aos receptores de classe A do tipo rodopsina. A cinina é um antigo neuropeptídeo sinalizador presente em Mollusca, Crustacea, Insecta e Acari 4,17,18. Os coleópteros (besouros) não possuem o sistema de sinalização de cinina; no mosquito Aedes aegypti, há apenas um receptor de cinina que se liga a três aedeskininas, enquanto a Drosophila melanogaster possui um receptor de cinina com drosocinina como ligante único 19,20,21. Não existem cininas homólogas ou receptores de cinina em vertebrados. Embora a função exata da cinina seja desconhecida em carrapatos, as fêmeas silenciadas pelo RNAi do receptor de cinina de R. microplus apresentam aptidão reprodutiva significativamente reduzida22. As cininas são peptídeos pleotrópicos em insetos. Em Drosophila melanogaster, estão envolvidos nos sistemas reguladores nervosos central e periférico 23, pré-ecdise24, alimentação 25, metabolismo 26 e padrões de atividade do sono26,27, bem como locomoção larval 28. As cininas regulam a contração do intestino traseiro, a diurese e a alimentação do mosquito A. aegypti 29,30,31. Os peptídeos de cinina possuem um pentapeptídeo C-terminal conservado Phe-X1-X2-Trp-Gly-NH2, que é a sequência mínima necessária para a atividade biológica32. A especificidade dos artrópodes, o pequeno tamanho do ligante endógeno, que os torna passíveis de interferência de moléculas pequenas, e as funções pleiotrópicas em insetos tornam o receptor de cinina um alvo promissor para o controle de pragas4.
O ensaio de “dupla adição” (Figura 2) permite a identificação de agonistas ou antagonistas no mesmo ensaio de HTS15. É adaptado de um ensaio de “dupla adição” que é comumente usado na indústria farmacêutica para a descoberta de medicamentos33. Em resumo, a primeira adição de fármacos na placa celular permite a identificação de potenciais agonistas na biblioteca química quando um sinal de fluorescência mais alto é detectado em comparação com a aplicação do controle de solvente. Após 5 minutos de incubação com essas pequenas moléculas, um agonista conhecido (peptídeo cinina) é aplicado a todos os poços. Os poços que receberam aleatoriamente um antagonista da placa de droga exibem um sinal de fluorescência mais baixo após a adição de agonista em comparação com os poços de controle que receberam o solvente na primeira adição. Este ensaio permite então a identificação de potenciais agonistas e antagonistas com as mesmas células. Em um projeto HTS padrão, essas moléculas atingidas seriam validadas através de ensaios de dose-resposta e por ensaios adicionais de atividade biológica, que não são mostrados aqui.
Figura 1: Ilustração do mecanismo de ensaio de fluorescência de cálcio. A proteína Gq desencadeia a via de sinalização de cálcio intracelular. O receptor de cinina (receptor acoplado à proteína G) foi expresso recombinantemente em células CHO-K1. Quando o ligante agonista se liga ao receptor, a proteína Gq associada ao receptor de cinina ativa o PLC, que catalisa a conversão de uma molécula PIP2 em IP3 e DAG. O IP 3 então se liga ao IP3R na superfície do retículo endoplasmático, levando à liberação de Ca 2+ no citoplasma, onde os íons Ca2+ se ligam aos fluoróforos e provocam um sinal de fluorescência. O sinal de fluorescência pode ser obtido por excitação a 490 nm e detectado a 514 nm. Abreviaturas: GPCR = receptor acoplado à proteína G; PLC = fosfolipase C; PIP2 = fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato; IP3 = trisfosfato de inositol; DAG = diacilglicerol; IP3 R = receptor IP3. Criado com BioRender.com. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O fluxo de trabalho para a triagem de alto rendimento de pequenas moléculas em um receptor acoplado à proteína G expresso em células CHO-K1. (A) Células CHO-K1 recombinantes expressando de forma estável o receptor de cinina foram adicionadas à placa de 384 poços (10.000 células/poço) usando um sistema de manuseio de líquidos (25 μL/poço) e incubadas em uma incubadora de CO2 umidificada por 12-16 h. (B ) O tampão de ensaio contendo o corante fluorescente (25 μL/poço) foi adicionado à placa celular utilizando um sistema de manuseio de líquidos. A placa foi incubada por 30 min a 37 °C por 30 min e equilibrada em RT por mais 30 min. (C) O sinal de fluorescência de fundo das células em cada poço foi medido com um leitor de placas. (D) Soluções medicamentosas de uma placa de biblioteca de 384 poços e solvente em branco (todos a 0,5 μL/poço) foram adicionados à placa de ensaio celular usando um sistema de manuseio de líquidos. (E) As respostas celulares de fluorescência de cálcio foram medidas com o leitor de placas imediatamente após a adição das soluções medicamentosas; composto(s) que provocaram sinais de fluorescência acima da média foram escolhidos como a(s) agonista(s) atingida(s). Golpes antagonistas que bloqueiam o GPCR (ícone abaixo) foram revelados após a adição do agonista peptídico durante a etapa G. (F) Na mesma placa de ensaio, após 5 min de incubação das células com compostos de triagem, um peptídeo agonista endógeno Rhimi-K-1 (QFSPWGamida) do receptor de cinina do carrapato foi adicionado a cada poço (1 μM). (G) As respostas de fluorescência celular após a adição do peptídeo agonista foram medidas pelo leitor de placas imediatamente. O(s) composto(s) inibidor(es) do sinal de fluorescência foram selecionados como antagonista(s) hit(s). Abreviaturas: GPCR = receptor acoplado à proteína G; RT = temperatura ambiente; RFU = unidades de fluorescência relativa. Criado com BioRender.com. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
O objetivo do HTS é identificar moléculas atingidas através da triagem de um grande número de moléculas pequenas. Portanto, os resultados deste exemplo representam apenas uma pequena parte de um experimento HTS convencional. Além disso, as moléculas atingidas identificadas precisam ser validadas em ensaios a jusante, como um ensaio dose-dependente na mesma linhagem celular recombinante e em uma linhagem celular CHO-K1 carregando apenas o vetor vazio, que pode ser realizado simultaneamente para salvar pequenas mol?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Prêmio USDA-NIFA-AFRI Saúde Animal e Bem-Estar (número do Prêmio 2022-67015-36336, PVP [Diretor do Projeto]) e de fundos competitivos do Programa de Concessão de Doenças Vetoriais de Insetos de Pesquisa da Texas A & M AgriLife Research (FY’22-23) para P.V.P. O grupo de professores da A.W.E.S.O.M.E. da Faculdade de Agricultura e Ciências da Vida, TAMU, é reconhecido por ajudar a editar o manuscrito. A Tabela Suplementar S2 contém dados de uma biblioteca interna, aleatória e de pequenas moléculas obtida do laboratório do Dr. James Sachettini na Texas A & M University e Texas A & M AgriLife Research.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco Invitrogen | 15050-065 | with phenol red |
| 0.4% trypan blue | MilliporeSigma | T8154 | liquid, sterile |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fisher | AM12400 | RNase-free Microfuge Tubes |
| 5 mL serological pipette | Corning | 29443-045 | Corning Costar Stripette individually wrapped |
| 10 mL serological pipette | Corning | 29443-047 | Corning Costar Stripette individually wrapped |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 352196 | sterile |
| 20 µL filter tips | USA Scientifc Inc. | P1121 | sterile, barrier |
| 25 mL serological pipette | Corning | 29443-049 | Corning Costar Stripette individually wrapped |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430828 | graduated, sterile |
| 150 mL auto-friendly reservior | Integra Bioscience | 6317 | sterile, individually wrapped for cell seeding in day 1 |
| 150 mL auto-friendly reservior | Integra Bioscience | 6318 | sterile, stacked, for loading dye in day 2 |
| 384/ 12.5 µL low retention tips | Integra Bioscience | 6405 | long, sterile filter |
| 384/ 12.5 µL tips | Integra Bioscience | 6404 | long, sterile filter |
| 384-well plate | Greiner | 781091 | CELLSTAR, clear polystyrene, µClear, Black/Flat |
| Aluminum plate seals | Axygen Scientific | PCR-AS-200 | polyester-based |
| Aluminum foil wrap | Walmart | ||
| Biosafty cabinet II | NuAire | NU-540-300 | |
| Cell counter | Nexcelom | AutoT4 | |
| cell counting slides | Nexcelom | SD-100 | 20 µL chamber |
| CO2 humidified incubator | Thermo Fisher | Forma Series II | |
| Desk Lamp | SunvaleeyTEK | RS1000B | |
| Dimethyl sulfoxide | MilliporeSigma | 276855 | anhydous, >99.9% |
| Drug plate | Corning | 3680 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning | 21-031-CV | DPBS, 1x without calcium amd magnesium |
| Ethanol | Koptec | 2000 | |
| F-12K Nutrient Mixture | Corning | 45000-354 | (Kaighn's Mod.) with L-glutamine |
| Fetal bovine serum | Equitech-Bio | SFBU30 | |
| Fluorescent calcium assay kit | ENZO Lifescience | ENZ-51017 | 10×96 tests |
| G418 sulfate | Gibco Invitrogen | 10131-027 | Geneticin selective antibiotic 50 mg/mL |
| Hank's buffer | MilliporeSigma | 55037C | HBSS modified, with calcium, with magnesium, without phenol read |
| HEPES buffer | Gibco Invitrogen | 15630-080 | 1 Molar |
| HTS data storage plateform | CDD vault | https://www.collaborativedrug.com/ | |
| Liquid handling system | Integra Bioscience | Viaflo | 384/12.5 µL |
| Plate centrifuge | Thermo Fisher | Sorvall ST8 | |
| Plate reader | BMG technology | Clariostar | |
| Poly-D-lysine | MilliporeSigma | P6407 | |
| Rhimi-K-1 agonist peptide | Genscript | custom order | QFSPWGamide |
| T-75 flask | Falcon | 353136 |
References
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