基于靶向质谱的低丰度蛋白质蛋白分析中的微量采样

来自健康献血者的血清用于制备标准溶液。使用来自健康献血者的血清是严格按照挪威法律进行的。获得所有受试者的知情同意。血清样品使用符合相关指南和法规的方法进行分析。所描述的协议是先前工作14中描述的方法的修改版本。缓冲液和溶液的组成以及如何制备它们的概述可以在 补充表S1中找到，而材料表包含本协议中使用的 材料 ，设备和试剂。 1. 抗体包被磁珠的制备 计算制备所需磁珠数量所需的抗体量。每50毫克磁珠使用1毫克抗体。注意：通常，在后续实验中，每个样品使用 20 μL 的 20 mg/mL 磁珠悬浮液（参见步骤 5.1）。 计算制备所需磁珠数量所需的抗体体积。注意：抗体体积取决于抗体浓度，需要针对每种抗体进行计算。 将所需体积的抗体溶液转移到 5 mL 低蛋白结合微量离心管中。例如，如果抗体溶液含有 1 mg/mL 抗体，则使用 0.4 mL 制备 1.0 mL 磁珠悬浮液（20 mg 磁珠/mL 含 1 mg 抗体/50 mg 磁珠）。注意：抗体应位于无胺缓冲液中。对所有含有蛋白质的溶液使用低蛋白结合微量离心管，以避免分析物因吸附而损失。 在抗体溶液中加入一个小的磁力搅拌棒，并在连续搅拌下将pH调节至2.5。使用带微量电极的pH计测量pH值，并通过逐步添加规定体积的1.0 M HCl来调节pH值（首先添加10 μL份量的1.0 M HCl，并在pH接近2.5时减小体积）。记录将pH调节至2.5所需的1.0 M HCl的总体积。 取出微电极并将酸化抗体在磁力搅拌器的冰上孵育1小时。注意：对抗体进行酸处理以促进磁珠上抗体的正确取向。HCl的浓度可以降低到0.5M或0.2M HCl，具体取决于抗体溶液中的缓冲液浓度。 中和抗体溶液。使用带有微电极的pH计测量pH值，并通过逐步加入规定的1.0 M NaOH体积将pH调节至7（从10 μL部分开始，当pH接近7时减小体积）。记录添加的1.0 M NaOH的总体积。注意：NaOH的浓度应与步骤1.4中使用的HCl浓度相同。氢氧化钠具有很强的腐蚀性;使用防护设备，包括手套和适当的护目镜。 计算要使用的甲苯磺酰活化磁珠的所需体积。注意：通常，建议在进行小规模偶联时使用20 mg磁珠/mL。应至少使用5毫克珠子。 在涡旋混合器上彻底混合磁珠悬浮液，并抽出含有所需磁珠悬浮液量的体积。例如，要制备 1 mL 磁珠悬浮液，请取出含有 20 mg 磁珠的体积（如果磁珠浓度为 30 mg/mL，则为 667 μL）。 将珠悬浮液放在磁性架上1分钟，然后除去上清液。用等体积的 1 型 H2O 洗涤磁珠 2 倍（如果使用 30 mg/mL 磁珠溶液制备 1 mL 20 mg/mL 抗体包被的磁珠，则为 667 μL）。每次加入洗涤溶液后，使用涡旋混合器混合，并在除去上清液之前放在磁性架上1分钟。 向磁珠中添加以下内容：酸处理抗体、0.5 M 硼酸盐缓冲液 （pH 9.5）（总体积的 1/5，因为最终浓度应为 0.1 M;这等于 0.2 mL 以制备 1 mL 磁珠悬浮液）和用于抗体偶联的偶联缓冲液（要制备 1 mL 抗体包被的磁珠，偶联缓冲液的体积应等于 1 mL -酸处理抗体体积 – 0.2 mL 硼酸盐缓冲液）。使用涡旋混合器混合。注意：酸处理抗体的体积等于抗体溶液的体积（0.4 mL，使用1 mg / mL抗体溶液制备1 mL磁珠悬浮液）+用于将pH调节至2.5的1.0 M HCl体积+用于将pH调节至7的1.0M NaOH体积）。注意：0.5 M硼酸盐缓冲液（pH 9.5）和用于抗体偶联的偶联缓冲液的组成可在 补充表S1中找到。 使用端到端样品混合器在环境温度下旋转过夜，最好是相互旋转和振动。 以239× g离心10分钟。将管放在磁铁上2分钟，然后除去上清液。 使用端到端样品混合器在环境温度下旋转抗体珠的存储缓冲液，洗涤磁珠 2 x 2 小时并洗涤一次过夜。使用与步骤 1.10 中的总卷相同的卷。将管放在磁铁上1分钟，并在每次洗涤之间除去上清液。注意：抗体微球储存缓冲液的组成可在 补充表S1中找到。 使用所需磁珠储备浓度（通常为20 mg/mL）储存在所需缓冲液中（例如，与步骤1.13中相同的缓冲液）。存放在冰箱中。 2.制备2 mL胰蛋白酶固定化珠（20 mg / mL磁珠） 将 20 mL 的 1 mM HCl 加入 2 mL NHS 活化的琼脂糖珠中以洗涤磁珠。 混合并以2，655 × g 离心5分钟。除去上清液。 加入 20 mL 的 0.1 M 磷酸盐缓冲液 （pH 7.8）。使用涡旋混合器混合并以2，655× g 离心5分钟。除去上清液。注意：0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.8）的组成可在 补充表S1中找到。 加入 2 mL 的 20 mg/mL 胰蛋白酶（溶解在冷偶联缓冲液中用于胰蛋白酶偶联）。注意：胰蛋白酶偶联的偶联缓冲液组成可在 补充表S1中找到。将缓冲液存放在冰箱中。 使用温控混合器在22°C和1，100rpm下孵育25分钟。以2，655 × g 离心5分钟。除去上清液。 加入2mL修饰缓冲液以制备胰蛋白酶珠，并使用温控混合器在22°C和1，100rpm下孵育20分钟。以2，655 ×g 离心5分钟。除去上清液。注意：用于制备胰蛋白酶珠的修饰缓冲液的组成可以在 补充表S1中找到。将缓冲液存放在冰箱中。 加入10mL封闭缓冲液以制备胰蛋白酶珠，并使用温控混合器在22°C和1，100rpm下孵育10分钟。以2，655 × g 离心5分钟。除去上清液。注意：用于制备胰蛋白酶珠的封闭缓冲液的组成可以在 补充表S1中找到。将缓冲液存放在冰箱中。 加入 2 mL 储存缓冲液，使用涡旋混合器混合，并存放在冰箱中直至使用。注意：胰蛋白酶微球储存缓冲液的组成可在 补充表S1中找到。将缓冲液存放在冰箱中。 3. DSS/VAMS取样及随后提取干燥血清 通过在血清中加入适当水平的ProGRP（或目标蛋白）来制备标准品。将峰值交易量保持在总交易量的 1% ≤。注意：此处使用295 μg/mL ProGRP的水溶液储备溶液制备加标血清标准品。 在涡旋混合器上混合标准品。 将 10 μL 血清（加标标准品）涂在 DBS 卡上，或按照制造商的指南通过 VAMS （10 μL） 收集 10 μL 血清。对于 DSS，请确保该点位于虚线圆圈内。 在环境温度下风干至少2小时。 切下整个斑点并将其转移到 2 mL 低蛋白结合微量离心管中，或从支架上取出 VAMS 并将其放入 2 mL 低蛋白结合微量离心管中。 加入 1，000 μL 100 mM 碳酸氢铵 （ABC） 溶液。使用温控混合器在22°C以1，000rpm从斑点/ VAMS中提取干燥的血清1小时。 将提取物转移到新的 1.5 mL 低蛋白结合微量离心管中进行胰蛋白酶水解。 4. 消化DSS/VAMS提取物 每个样品使用 30 μL 胰蛋白酶珠（如第 2 节中制备）。将所有样品的含有胰蛋白酶珠的体积转移到新的 1.5 mL 低蛋白结合微量离心管中，以 2，655 × g 离心 5 分钟，然后除去上清液。 用 1 mL 冷的 50 mM ABC 洗涤胰蛋白酶珠 2 次，然后以移液的相同体积重悬。以2，655× g 离心5分钟，并在步骤之间除去上清液。 向每个 DSS/VAMS 提取物中加入 30 μL 洗涤过的胰蛋白酶珠以启动消化。 使用温控混合器或类似物在37°C和1，000rpm下孵育2小时。以 2，655 × g 离心 5 分钟，并将上清液（非珠子）转移到新的 2.0 mL 低蛋白结合微量离心管中。 在 100 mM ABC 溶液中加入 25 μL 含有稳定同位素标记 （SIL） 肽 ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6_15 N2] 的 14ng/mL 内标 （IS） 溶液。 5. 使用抗体包被的磁珠捕获蛋白型ProGRP肽 每次提取使用 20 μL 抗体包被的微球（第 1 节中制备的 20 mg/mL）。将所有抗体包被的磁珠转移到新的 1.5 mL 低蛋白结合微量离心管中，放在磁铁上 1 分钟，然后取出储存缓冲液。 用 1 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）、pH 7.4（含有 0.05% 聚山梨酯 20）和 2 x 1 mL PBS 洗涤磁性抗体包被的磁珠，然后重悬于移液的相同体积中。在涡旋混合器上混合，并在缓冲液交换之间放在磁铁上1分钟。注意：PBS 含有 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8 mM Na 2 HPO 4和 1.8 mM KH2PO4。建议以10倍浓度制备溶液以提高稳定性。有关 100 mL 10x PBS 的组成，请参见补充表 S1。稀释 10x PBS 10x 将达到 ~7.4 的 pH 值。 向每个含有消化的 DSS/VAMS 提取物和 IS 的低蛋白结合微量离心管中加入 20 μL 洗涤磁珠悬浮液。在环境温度下使用端到端样品混合器进行免疫提取1小时。 使用以下溶液洗涤磁珠：500 μL PBS 与 0.05% （v/v） 聚山梨酯 20、400 μL PBS、300 μL 10 mM Tris HCl （pH 7.4） 和 300 μL 100 mM ABC。加入每种洗涤溶液后，从磁架上取出带有珠子和洗涤溶液的低蛋白结合微量离心管，并小心地倒置直至均匀。然后，将低蛋白结合微量离心管放在磁铁上30秒，倒置30秒，然后放在磁铁上1分钟。取出洗涤液。 使用微量离心机旋转剩余的悬浮液。放在磁铁上1分钟，然后除去剩余的洗涤溶液。 向每个样品中加入 15 μL 1 H 2 O 型2% （v/v） 甲酸，并使用温控混合器或类似方法在 22 °C 和 1，000 rpm 下孵育 5 分钟，以洗脱捕获的肽。放在磁铁上1分钟，然后将洗脱液转移到新的1.5mL低蛋白结合微量离心管中。重复一次并将第二个洗脱液转移到与第一个洗脱液相同的低蛋白结合微量离心管中。 向每个洗脱液中加入 20 μL 的 100 mM ABC（总体积为 50 μL）。 离心机（微量离心机）并将 40 μL 洗脱液转移到微量插入物中，用于高效液相色谱 （HPLC） 样品瓶。 6. 通过LC-MS/MS进行分析 使用具有电喷雾电离功能的微型液相色谱三重四极杆质谱仪，以实现高稳定性。 用流动相A（H2O和MeCN中的20 mM FA，95：5 v/v）和B（H2O和MeCN中的20 mM FA，5：95 v/v）吹扫泵，准备LC-MS/MS系统进行分析。 插入分析柱（C18，50 mm x 1 mm 内径 [ID]，3 μm 颗粒）。 按照特定仪器的启动程序继续准备仪器进行分析。 在仪器软件中，将柱炉温度设置为25°C，流速设置为50 μL/min（100%流动相A）。 用流动相A平衡色谱柱至少15分钟。 将样品放入自动进样器中。 准备用于分析ProGRP特异性胰蛋白酶肽ALGNQQPSWDSEDSSNFK及其IS的仪器方法。注意：有几个方法参数是特定于仪器的，必须针对所使用的特定仪器进行优化。此处使用的方法参数的详细信息在步骤 6.9 至 6.11 中描述。 对于LC中的梯度程序，请使用以下设置：流速：50 μL/分钟;从时间0.0到3.0分钟：100%流动相A;从时间3.0到18.0分钟：运行0%至50%流动相B的线性梯度;从时间18.0到18.1分钟：将流动相B从50%增加到100%;从时间18.1到20.0分钟：100%流动相B;从时间20.0到20.1分钟：将流动相B从100%降低到0%;从时间20.1到30分钟：100%流动相A重新平衡色谱柱（使用至少10个色谱柱体积）。 对于 MS/MS 设置，请使用确保高效电离的仪器设置在正模式下运行 MS/MS。要遵循此协议，请使用 +4，000 V 的喷雾电压、270 °C 的加热毛细管温度、氮气作为片状气体（5 个任意单位）和氩气 （2 mTorr） 进行碰撞诱导解离 （CID） 碎裂。如果仪器允许，引导液相色谱流浪费运行的前 2 分钟（0-2 分钟）和后 1 分钟（29-30 分钟），而不是进入 MS。 对（A）特征肽（ALGNQQPSWDSEDSSNFK）：1，005.45→913.3，1，005.45→1，028.3和1，005.45→1，398.5）使用选定的反应监测（SRM）通道，以及（B）IS SIL肽（ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6_15N2]）：1，009.45→921.3，1，009.45→1，036.3和1，009.45→1，406.5。对所有受监控的转换使用优化的碰撞能量（本协议中为 35 V）。 使用适用于您的LC-MS/MS系统的软件准备包含要运行的样品的序列。将进样体积设置为 10 μL。注意：确保根据需要添加空白样品和质量控制样品。 按仪器软件中的“运行序列”开始序列。 监测亲和捕获的ProGRP特异性胰蛋白酶肽ALGNQQPSWDSEDSSNFK及其IS SIL肽的峰面积。注意：特征肽ALGNQPSWDSEDSSNFK的选择和确认在别处描述14。