Modelado del desarrollo cerebeloso humano in vitro en estructura 2D
Summary
El presente protocolo explica la generación de una monocapa 2D de células cerebelosas a partir de células madre pluripotentes inducidas para investigar las primeras etapas del desarrollo cerebeloso.
Abstract
El desarrollo preciso y oportuno del cerebelo es crucial no solo para la coordinación y el equilibrio motor precisos, sino también para la cognición. Además, la interrupción en el desarrollo cerebeloso se ha implicado en muchos trastornos del desarrollo neurológico, como el autismo, el trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH) y la esquizofrenia. Las investigaciones del desarrollo cerebeloso en humanos anteriormente solo han sido posibles a través de estudios post-mortem o neuroimágenes, sin embargo, estos métodos no son suficientes para comprender los cambios moleculares y celulares que ocurren in vivo durante el desarrollo temprano, que es cuando se originan muchos trastornos del desarrollo neurológico. La aparición de técnicas para generar células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) a partir de células somáticas y la capacidad de volver a diferenciar aún más las iPSC en neuronas han allanado el camino para el modelado in vitro del desarrollo temprano del cerebro. El presente estudio proporciona pasos simplificados hacia la generación de células cerebelosas para aplicaciones que requieren una estructura monocapa de 2 dimensiones (2D). Las células cerebelosas que representan las primeras etapas del desarrollo se derivan de iPSC humanas a través de los siguientes pasos: primero, los cuerpos embrioides se hacen en cultivo tridimensional (3D), luego se tratan con FGF2 e insulina para promover la especificación del destino cerebeloso, y finalmente, se diferencian terminalmente como una monocapa en sustratos recubiertos de poli-l-ornitina (PLO) / laminina. A los 35 días de diferenciación, los cultivos de células cerebelosas derivadas de iPSC expresan marcadores cerebelosos que incluyen ATOH1, PTF1α, PAX6 y KIRREL2, lo que sugiere que este protocolo genera precursores neuronales cerebelosos glutamatérgicos y GABAérgicos, así como progenitores de células de Purkinje. Además, las células diferenciadas muestran una morfología neuronal distinta y son positivas para marcadores de inmunofluorescencia de identidad neuronal como TUBB3. Estas células expresan moléculas de guía axonal, incluyendo semaforina-4C, plexina-B2 y neuropilina-1, y podrían servir como modelo para investigar los mecanismos moleculares del crecimiento de neuritas y la conectividad sináptica. Este método genera neuronas cerebelosas humanas útiles para aplicaciones posteriores, incluyendo expresión génica, estudios fisiológicos y morfológicos que requieren formatos monocapa 2D.
Introduction
Comprender el desarrollo cerebeloso humano y las ventanas de tiempo críticas de este proceso es importante no solo para decodificar las posibles causas de los trastornos del desarrollo neurológico, sino también para identificar nuevos objetivos para la intervención terapéutica. Modelar el desarrollo cerebeloso humano in vitro ha sido un desafío, sin embargo, con el tiempo, han surgido muchos protocolos que diferencian las células madre embrionarias humanas (hESC) o iPSC con destinos de linaje cerebeloso 1,2,3,4,5,6,7,8 . Además, es importante desarrollar protocolos que generen resultados reproducibles, sean relativamente simples (para reducir el error) y no sean pesados en costos monetarios.
Los primeros protocolos para la diferenciación cerebelosa se generaron a partir de cultivos 2D a partir de cuerpos embrioides (EB) en placas, induciendo el destino cerebeloso con varios factores de crecimiento similares al desarrollo in vivo, incluyendo WNT, BMPs y FGFs 1,9. Los protocolos publicados más recientes indujeron la diferenciación principalmente en el cultivo de organoides 3D con FGF2 e insulina, seguido de FGF19 y SDF1 para estructuras rómbicas similares a labios3,4, o utilizaron una combinación de FGF2, FGF4 y FGF85. Ambos métodos de inducción de organoides cerebelosos dieron como resultado organoides cerebelosos 3D similares, ya que ambos protocolos informaron una expresión similar de marcadores cerebelosos en puntos de tiempo idénticos. Holmes y Heine ampliaron su protocolo 3D5 para mostrar que las células cerebelosas 2D se pueden generar a partir de hESCs e iPSCs, que comienzan como agregados 3D. Además, Silva et al.7 demostraron que las células que representan neuronas cerebelosas maduras en 2D pueden generarse con un enfoque similar al de Holmes y Heine, utilizando un punto de tiempo diferente para cambiar de 3D a 2D y extender el tiempo de crecimiento y maduración.
El protocolo actual induce el destino cerebeloso en iPSC libres de alimentador mediante la generación de cuerpos embrioides (EB) flotantes libres utilizando insulina y FGF2 y luego colocando los EB en platos recubiertos de OLP / laminina el día 14 para el crecimiento y diferenciación 2D. Para el día 35, se obtienen células con identidad cerebelosa. La capacidad de recapitular las primeras etapas del desarrollo cerebeloso, especialmente en un entorno 2D, permite a los investigadores responder preguntas específicas que requieren experimentos con una estructura monocapa. Este protocolo también es susceptible de modificaciones adicionales, como superficies con micropatrones, ensayos de crecimiento axonal y clasificación celular para enriquecer las poblaciones celulares deseadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacidad de modelar el desarrollo cerebeloso humano in vitro es importante para el modelado de enfermedades, así como para promover la comprensión del desarrollo normal del cerebro. Los protocolos menos complicados y rentables crean más oportunidades para la generación de datos replicables y una amplia implementación en múltiples laboratorios científicos. Aquí se describe un protocolo de diferenciación cerebelosa utilizando un método modificado de generación de EB que no requiere enzimas o agentes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Jenny Gringer Richards por su minucioso trabajo en la validación de nuestros sujetos de control, a partir de los cuales generamos las iPSC de control. Este trabajo fue apoyado por NIH T32 MH019113 (a D.A.M. y K.A.K.), el Nellie Ball Trust (a T.H.W. y A.J.W.), NIH R01 MH111578 (a V.A.M. y J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (a A.J.W.) y Roy J. Carver Charitable Trust (a V.A.M., J.A.W. y A.J.W.). Las figuras fueron creadas con BioRender.com.
Materials
| 10 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26D | |
| 1-thio-glycerol | Sigma | M6145 | |
| 2 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26B | |
| 250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia | Fisher Scientific | FB12566502 | |
| 35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish | Falcon | 353001 | |
| 4D Nucleofector core unit | Lonza | 276885 | Nucleofector |
| 5 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-25D | |
| 60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish | Falcon | 353004 | |
| 6-well ultra-low attachment plates | Corning | 3471 | |
| 9" Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell culture grade water | Cytiva | SH30529.02 | |
| Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Chroman 1 | Cayman | 34681 | |
| Class II, Type A2, Biological safety Cabinet | NuAire, Inc. | NU-540-600 | Hood, UV light |
| Costar 24-well plate, TC treated | Corning | 3526 | |
| Costar 6-well plate, TC treated | Corning | 3516 | |
| DAPI solution | Thermo Scientific | 62248 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO (Dimethly sulfoxide) | Sigma | D2438 | |
| DPBS+/+ | Gibco | 14040133 | |
| Emricasan | Cayman | 22204 | |
| Epi5 episomal iPSC reprogramming kit | Life Technologies | A15960 | |
| Essential 8-Flex | Gibco | A2858501 | PSC medium with heat-stable FGF2 |
| EVOS XL Core Imaging system | Life Technologies | AMEX1000 | |
| Fetal bovine serum – Premium Select | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| GlutaMAX supplement | Gibco | 35050061 | L-alanine-L-glutamine supplement |
| Ham's F12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| HERAcell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Human Anti-EN2, mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-293311 | |
| Human anti-Ki67/MKI67, rabbit | R&D Systems | MAB7617 | |
| Human anti-PTF1a, rabbit | Novus Biologicals | NBP2-98726 | |
| Human anti-TUBB3, mouse | Biolegend | 801213 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Insulin | Gibco | 12585 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| MEM-NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Mini Centrifuge | Labnet International | C1310 | Benchtop mini centrifuge |
| Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg) | New England BioLabs | T2040 | Silica spin columns |
| Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England BioLabs | T2010 | Silica spin columns |
| N-2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| PFA 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polyamine supplement | Sigma | P8483 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | 3655 | |
| Potassium chloride | Sigma | 746436 | |
| SB431542 | Sigma | 54317 | |
| See through self-sealable pouches | Steriking | SS-T2 (90×250) | Autoclave pouches |
| Sodium citrate dihydrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia | Research Products International | 256131 | |
| Trans-ISRIB | Cayman | 16258 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | Phenol and guanidine isothiocyanate |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Gibco | 12604039 | Cell dissociation reagent |
| Vapor pressure osmometer | Wescor, Inc. | Model 5520 | Osmometer |
| Y-27632 | Biogems | 1293823 |
References
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