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医学

Usando uma combinação de calorimetria indireta, termografia infravermelha e níveis de glicose no sangue para medir a termogênese do tecido adiposo marrom em humanos

Published: June 02, 2023
doi:
10.3791/64451
, , , ,
1La Trobe Institute for Molecular Science, Department of Rural Clinical Sciences,La Trobe University, 2School of Biomedical Sciences, Department of Physiology,The University of Melbourne, 3Melbourne Medical School, Department of Rural Health,The University of Melbourne

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar o significado fisiológico do impacto da atividade do tecido adiposo marrom (BAT) no metabolismo humano. Isto é conseguido combinando carga de carboidratos e calorimetria indireta com medidas de mudanças supraclaviculares de temperatura. Esta nova abordagem pode ajudar a desenvolver um alvo farmacológico para a termogênese BAT em humanos.

Abstract

Em mamíferos, o tecido adiposo marrom (BAT) é ativado rapidamente em resposta ao frio para manter a temperatura corporal. Embora a MTD tenha sido muito estudada em pequenos animais, é difícil medir a atividade das MTD em humanos. Portanto, pouco se sabe sobre a capacidade de geração de calor e o significado fisiológico das MTD em humanos, incluindo o grau em que os componentes da dieta podem ativar a MTD. Isso se deve às limitações do método atualmente mais utilizado para avaliar a ativação da glicose radiomarcada com MTD (fluordesoxiglicose ou 18FDG) medida por tomografia computadorizada por emissão de pósitrons (PET-CT).

Esse método é geralmente realizado em indivíduos em jejum, pois a alimentação induz a captação de glicose pelos músculos, o que pode mascarar a captação de glicose para o BAT. Este trabalho descreve um protocolo detalhado para quantificar o gasto energético humano de corpo total e a utilização de substratos da termogênese MTD combinando calorimetria indireta, termografia infravermelha e monitoramento da glicemia em machos adultos carregados de carboidratos. Para caracterizar a significância fisiológica da MTD, medidas do impacto da atividade das MTD na saúde humana são críticas. Demonstramos um protocolo para isso combinando carga de carboidratos e calorimetria indireta com medidas de mudanças supraclaviculares de temperatura. Esta nova abordagem ajudará a compreender a fisiologia e farmacologia da termogênese MTD em humanos.

Introduction

O tecido adiposo marrom (BAT) difere mais notavelmente do tecido adiposo branco (TAB) em seu conteúdo mitocondrial, inervação simpática, gotículas lipídicas multiloculares, capacidade de geração de calor e distribuição anatômica. A MTD foi considerada existente apenas em lactentes e pequenos mamíferos até a confirmação de sua presença em adultos humanos em 2009 1,2,3. Assim, até relativamente recentemente, o papel das MTD na fisiologia humana e na homeostase metabólica era pouco compreendido. Estudos extensivos em pequenos animais demonstraram que, durante a exposição ao frio, mais da metade do metabolismo se deve à capacidade termogênica não trêmula da MTD4. Vários estudos têm demonstrado que, após exposição leve ao frio (17-18 °C), aumentos no gasto energético e na captação de glicose nas MTD correlacionam-se fortemente com a termogênese das MTD em humanos 5,6,7. Além disso, a termogênese MTD pode contribuir com até 10% do gasto energético de repouso em humanos durante a exposição ao frio (para uma revisão, ver Van Schaik et al.8). O estudo da fisiologia e do impacto das MTD na saúde e na doença humanas é atualmente restrito por limitações de protocolo. É, portanto, essencial ter um método preciso para medir o verdadeiro impacto metabólico da MTD para melhor compreender o impacto da termogênese das MTD na obesidade e suas complicações metabólicas em humanos.

A distribuição anatômica da MTD humana torna desafiadora a obtenção de medidas precisas da MTD. Em humanos, a MTD distribui-se dentro dos depósitos de MTD no abdome, tórax e, principalmente,pescoço9. Estudos de autópsia e cadáveres têm sido utilizados para caracterizar anatomicamente as MTD10,11, mas esses métodos não podem fornecer informações funcionais. É um desafio distinguir a MTD usando técnicas de imagem convencionais devido às densidades semelhantes de WAT e BAT8. Uma questão de confusão adicional é que os depósitos de gordura bege também estão localizados dentro das mesmas camadas estreitas de fáscia ou em certos depósitos com o WAT8, o que torna difícil distinguir usando técnicas de imagem convencionais.

Para superar esse problema, o volume MTD é tipicamente medido através da combinação de tomografia por emissão de pósitrons (PET) e tomografia computadorizada (TC). O análogo radiomarcadoda glicose 18 F-fluourodesoxiglicose (18 F-FDG) é o traçador mais comumente utilizado para o estudo da MTD 12. No entanto, sofre várias limitações, como a exposição dos indivíduos à radiação ionizante e por ser invasiva e dispendiosa. Além disso, a maior limitação do traçador 18F-FDG é que ele mede a captação de um análogo de glicose, o que não é ideal, uma vez que os ácidos graxos livres são os substratos preferidos para a termogênese MTD13. A técnica de 18F-FDG PET/CT não mede a captação de ácidos graxos livres como substrato para termogênese e, portanto, não mede a importância fisiológica da termogênese BAT. Existem técnicas alternativas utilizadas para avaliar a MTD humana, que incluem a medida da captação de oxigênio-15 marcada com água (15 O-O2) 14,11 acetato de C 15, um ácido graxo de cadeia longa (ácido 18F-fluoro-6-tia-heptadecanóico)16 ou adenosina 17, bem como espectroscopia de ressonância magnética 18 e ressonância magnética 19, mas ainda são extremamente caros e expõem os indivíduos à radiação ionizante. Portanto, falta um padrão-ouro confiável, barato e, principalmente, seguro para a quantificação de MTD humana.

A termografia infravermelha (TRI) é uma técnica alternativa de imagem não invasiva20,21 que mede a temperatura da pele sobrepondo um depósito conhecido de BAT. Embora isso infera o aumento do gasto energético, se a temperatura medida não exceder a temperatura central, então não pode ser determinado se a mudança medida na temperatura é simplesmente uma consequência do fluxo sanguíneo alterado. Além disso, um aumento medido na temperatura local não fornece valores de gasto energético alterado, que é frequentemente o desfecho desejado. Vários grupos de pesquisa usaram a TRI para medir um aumento na temperatura em depósitos de MTD humana após uma intervenção com cafeína ou estímulo frio; Este depósito é a fossa supraclavicular 22,23,24,25,26,27.

No entanto, não está claro se a ação da cafeína sobre a MTD é direta ou mediada via circuitos neurais. Há evidências de que a cafeína induz características de escurecimento em adipócitos in vitro22, e trabalhos anteriores demonstraram que a cafeína (100 mg) aumenta a variabilidade da frequência cardíaca, o que pode ser um indicador de um aumento do drive nervoso simpático sistemicamente no organismo27. Isso está de acordo com evidências em roedores, nos quais a cafeína via sistema nervoso central aumenta a termogênese sem impacto cardiodinâmico adverso28.

Como o substrato preferencial para a termogênese de MTD são os ácidos graxos livres derivados de triglicerídeos13 e os MTD ativos sequestram lipídios circulantes para sustentar a termogênese29, medidas de utilização do substrato são importantes na avaliação da ativação fisiológica da BAT. A razão de troca respiratória (RER) é a razão entre o volume de oxigênio consumido (V̇O 2) e dióxido de carbono produzido (V̇CO2)30. Um RER de 0,7 é indicativo de metabolismo de ácidos graxos e um RER de 1,0 é indicativo de metabolismo de carboidratos31. Portanto, a evidência de uma preferência pela utilização de ácidos graxos em detrimento de um aumento no gasto energético é um correlato chave da termogênese BAT.

Além disso, dado que a captação de glicose é um correlato conhecido da atividade do MTD (ver acima), uma queda na glicemia em paralelo com a mudança na utilização do substrato são os principais correlatos da termogênese do MTD. Estudos prévios utilizando a calorimetria indireta isoladamente ou em conjunto com o registro da temperatura em indivíduos em jejum relataram pouca ou nenhuma mudança aguda na utilização do substrato32,33. Como isso provavelmente é mascarado pelo estado de jejum (onde o metabolismo pré-absortivo favorece a utilização de gordura), propomos combinar TRI e calorimetria indireta com carga de carboidratos.

Este artigo visa fornecer uma abordagem passo-a-passo que os pesquisadores clínicos podem usar para quantificar de forma confiável e, importante, segura a importância fisiológica da MTD em humanos, combinando TRI, calorimetria indireta e níveis de glicose no sangue. Esta técnica é melhor utilizada depois de os indivíduos terem sido carregados de hidratos de carbono e expostos a agentes BAT farmacológicos ou a estímulos ambientais. Os resultados dessa abordagem podem ser usados para estudar a atividade da MTD, a utilização do substrato e o gasto energético após a ativação da MTD em indivíduos do estudo27.

Protocol

Todos os participantes (n = 8) assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido, e todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Seres Humanos da Universidade; os dados foram derivados de Van Schaik et al.27. 1. Instalação de equipamentos e softwares Medir a massa gorda por meio da absorciometria de raios-X de dupla energia (DXA) conforme Van Schaik et al.27. Estimar a utilização do substrato e o gasto energético do gás expirado; Meça isso usando um analisador de gases respiratórios de acordo com as diretrizes do fabricante. Coletar amostras de sangue através de punção do dedo (capilar) e determinar os níveis de glicose no sangue usando um glicosímetro de acordo com as diretrizes do fabricante. Use um termômetro infravermelho sem contato para determinar as medições de temperatura corporal central de acordo com as diretrizes do fabricante (o erro deste dispositivo é de ±0,2 °C). 2. Procedimentos prévios às visitas dos participantes Examine todos os participantes quanto ao seu estado de saúde. Estabelecer os seguintes critérios de exclusão: índice de massa corporal de >30 kg/m2 (devido à atividade das MTD estar inversamente correlacionada com adiposidade34,35, participantes em uso de medicamentos prescritos e diabetes mellitus. Antes ou após a sessão de teste, certifique-se de que os participantes sejam submetidos a um exame de DXA para medir sua massa gorda, pois a atividade da MTD está inversamente correlacionada com a adiposidade34,35. Por 24 h antes de chegar para o estudo, certifique-se de que os participantes se abstenham de qualquer exercício ou atividade extenuante e estejam em jejum de água por 10 h antes de chegar ao laboratório. 3. Procedimentos no dia do estudo Certifique-se de que a temperatura ambiente na qual os dados são coletados esteja ajustada para uma temperatura constante para minimizar confundimentos externos devido a diferenças na temperatura ambiente.Observação : isso pode resultar em medições térmicas ou metabólicas incorretas. Para este experimento, foi utilizada uma sala com temperatura controlada, mantida a 22 °C em condições de neutralidade térmica. Peça aos participantes que cheguem ao laboratório às 08:00 para contabilizar os ritmos hormonais diários. Medir a altura e o peso dos participantes. Peça aos participantes que se deitem em um plinto por um período mínimo de 30 minutos antes das medidas basais serem tomadas. Durante um período de 120 min, medir a TRI, a calorimetria indireta, a glicemia e a temperatura central dos participantes a cada 15 min após a amostragem expiradade O 2 e CO2(Figura 1). Após as medições basais, certifique-se de que os participantes estejam carregados de carboidratos através do consumo de três géis de carboidratos (90 g de glicose cada) entre os momentos de 0 min e 15 min. Certifique-se de que os participantes ingerem o tratamento 45 min após a carga de carboidratos. Para seguir esse protocolo, utilizar 100 mg de cápsulas de cafeína como intervenção27.NOTA: É necessário um período de washout de 7 dias entre a intervenção e o placebo, o que significa que é necessário um período de 7 dias entre a cafeína e o tratamento com placebo. 4. Calorimetria indireta Estimar o gasto energético e os valores de utilização do substrato a partir do gás expirado, medidos por meio de um analisador de gases respiratórios. Conclua a calibração do analisador de gases respiratórios seguindo as instruções do fabricante. Ajustar a máscara de silicone esterilizada a frio ao participante para permitir a entrega de ar ambiente e a aquisição de dados metabólicos. Certifique-se de que a máscara esteja equipada com uma válvula pré-esterilizada não reinaladora (válvula bidirecional não reinalante) e fixe-a no rosto do participante com um acessório de malha e verifique se há vazamentos. Certifique-se de que os tubos inspiratórios e expiratórios estejam conectados. Exporte o arquivo de dados digitais em um formato de planilha. Amostra do expirado O 2 e CO2com média de 5 s. Esta mede o gasto energético e a razão de troca respiratória (Figura 1). Retire a máscara facial para completar as medidas adicionais. Calcular as taxas de oxidação do substrato (oxidação de carboidratos e lipídios) e o gasto energético total utilizando as equações não proteicas de Weir 1-331,36:Taxa de oxidação de gordura (g/min−1) = (1,695 VO 2)-(1,701 VCO 2) (1)Taxa de oxidação de carboidratos (g/min−1) = (4,585 VCO 2) -(3,226 VO 2) (2)Gasto Energético (kcal/min) = (3,94 × VO 2)+ (1,1 × VCO2) (3) 5. Medições de glicose no sangue plasmático Realizar leituras de glicemia por punção digital e glicosímetro após cada rodada de medições de gases expirados (Figura 2). 6. Temperatura central Registre a temperatura central (Tcore) após cada rodada de medições de gás expirado. O ideal é medir a temperatura central por via retal ou intra-auralmente (Figura 2).NOTA: Devido às práticas seguras da COVID-19, minimize o contato pessoa a pessoa. Certifique-se de que os participantes estejam em decúbito dorsal e que a cabeça esteja em posição neutra. Direcione consistentemente o termômetro sem contato para o centro da testa do participante. 7. Termografia infravermelha Realizar a TRI após cada rodada de medições de gases expirados (Figura 2). Peça aos participantes que se sentassem em uma postura ereta olhando para frente, com a região do tórax ao pescoço exposta (Figura 3). Use uma câmera de imagem térmica para adquirir imagens infravermelhas da região anterior do pescoço e da parte superior do tórax.Posicione a câmera em um tripé na altura do pescoço a 1 m da face do sujeito (Figura 4D). Use as seguintes configurações: tipo de detector = microbolômetro não resfriado; pitch do detector = 17 μm; faixa espectral da câmera = 7,5-14,0 μm; sensibilidade térmica = 20 mK a 30 °C; lentes = 36 mm; resolução = 1.024 pixels x 768 pixels. Ligue a câmera. Ajuste o foco da câmera girando o anel de foco.NOTA: É muito importante ajustar o foco corretamente. O ajuste incorreto do foco afeta a medição de temperatura. Aponte o ponteiro laser para a linha média do pescoço do participante. Pegue a imagem.NOTA: A imagem será salva automaticamente se um cartão de memória for usado. 8. Análise das imagens Escolher três regiões da região anterior do tórax e pescoço para a análise da temperatura da superfície: bilateralmente a pele recobrindo MTD na fossa supraclavicular (FEC) e a região lateral do pescoço, sendo a área esternal considerada como ponto de referência de controle (Tref), pois essa área não contém MTD (Figura 4A-C). Colocar regiões triangulares de interesse (ROIs) nas áreas do FEC direito e esquerdo e uma ROI circular sobre a região esternal. Quando as regiões necessárias tiverem sido cruzadas, confirme se o software exibe a média e o desvio padrão da temperatura para cada região selecionada. 9. Análise dos dados Utilizar uma abordagem duplo-cega para a análise das intervenções utilizando as técnicas descritas. Ter um pesquisador não envolvido na coleta ou análise de dados codificar as intervenções genericamente. Realizar a análise estatística.Calcule as médias para os dados de TRI, temperatura central e glicemia a partir do ponto de tempo único medido. Calcule médias para o RER, oxidação de gordura, oxidação de carboidratos e gasto energético em épocas de 10 min. Para o gasto energético, somar a taxa de gasto energético de cada grupo e separá-la em pré e pós-intervenção.NOTA: Consulte Van Shaik e col. para testes estatísticos para analisar os dados27.

Representative Results

A Figura 1 e a Figura 2 apresentam um fluxograma do desenho do estudo. As imagens da configuração do protocolo estão representadas na Figura 3. As características dos participantes encontram-se na Tabela 1. Exemplos representativos de TRI das imagens de um participante, incluindo linha de base (Figura 4A), carga pós-carboidrato (Figura 4B) e 60 min após a suplementação com cafeína (Figura 4C), com uma imagem representativa do setup da câmera, são apresentados na Figura 4D. Notadamente, a Figura 4A-C fornece uma representação visual das mudanças na temperatura da fossa supraclavicular (Tscf) após a intervenção; as diferenças de temperatura são particularmente marcantes entre a Figura 4B e a Figura 4C. Na Figura 5A-C, os resultados de Van Schaik et al., mostram a Tscf (Figura 5A), a temperatura de um ponto de referência (Tref; Figura 5C) e a temperatura central (Tcore; Figura 5B) desde a linha de base (0 min) até o término da coleta de dados (120 min). Os dados mostram uma intervenção com cafeína em comparação com placebo27. Os resultados descritos neste manuscrito são puramente representativos deste artigo publicado. Além disso, os dados sobre Tscf não mostram um efeito de grupo. As estatísticas podem ser encontradas nos dados complementares de Van Schaik et al.27. O aumento acentuado da temperatura supraclavicular coincide com mudanças na utilização do substrato e rápida redução dos níveis glicêmicos após a intervenção, como mostra a Figura 6. Estes resultados, combinados com a ausência de mudança de temperatura para as temperaturas Tref e Tcore (Figura 5B,C) são indicativos de termogênese BAT. Além disso, à medida que o gasto energético aumenta (Figura 6E), o RER diminui (Figura 6A), o que coincide com o aumento da oxidação de gordura (Figura 6B) após a intervenção. Figura 1: Esquema das medidas com tempo de conclusão em cada período de 15 min. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Fluxograma esquemático do desenho do estudo. Processo experimental. Quadrado preto = tempo de carga de carboidratos; círculo preto = tempo de intervenção. Abreviações: TRI = termografia infravermelha; BGL = glicemia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Imagens representativas do protocolo. (A) Configuração sem a presença do participante; (B) coleta de dados dos participantes na linha de base; (C) calorimetria indireta computadorizada; (D) participante consumindo a carga de carboidratos após as medidas basais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Exemplos representativos da TRI e da configuração da câmera. Imagens térmicas de um participante, em (A) basal, (B) pós-carga de carboidrato e (C) 60 min após a intervenção da cafeína, com (D) uma imagem representativa da configuração da câmera. Abreviação: TRI = termografia infravermelha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Efeitos da intervenção sobre as medidas de temperatura. Mudanças basais da temperatura bruta de (A) Tscf, (B) Tcore e (C) Tref em participantes após uma carga de carboidratos (ponto de tempo = 0) e a administração de uma intervenção com cafeína ou uma cápsula placebo (tempo = 45 min a 120 min)27. Esse número é modificado de Van Schaik et al.27. (A-C) Caixa cinza claro 1 = tempo de carga de carboidratos; caixa 2 = pré-intervenção; caixa cinza escuro 3 = pós-intervenção; círculos azuis = intervenção cafeína; triângulos pretos = intervenção placebo. Os dados são expressos como mínimo a máximo, com todos os pontos mostrados na caixa e gráficos de bigode. A variância é expressa como média ± DP, n = 8 por intervenção; * representa o efeito de interação cafeína (*p < 0,05). Os valores dos dados foram analisados por meio da análise de variância de três fatores para medidas repetidas. Abreviações: Tscf = temperatura na fossa supraclavicular; Tcore = temperatura central; Tref = ponto de referência de controle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6: Efeitos da intervenção sobre as medidas metabólicas. Alterações em (A) RER, (B) taxa de oxidação de gordura, (C) taxa de oxidação de carboidratos, (D) níveis de glicose no sangue e (E) gasto energético em participantes após uma carga de carboidratos (tempo = 0) e a administração de uma cápsula de cafeína ou placebo (tempo = 45 min a 120 min). Caixa cinza claro 1 = tempo de carga de carboidratos; caixa 2= pré-intervenção; caixa cinza escuro 3 = pós-intervenção; círculos azuis = intervenção cafeína; triângulos pretos = intervenção placebo. Os dados são expressos como mínimo a máximo, com todos os pontos mostrados na caixa e gráficos de bigode. (E) Pré e pós-administração das intervenções; barra cinza = intervenção placebo; barra azul = intervenção cafeína. A variância é expressa como média ± DP, n = 8 por intervenção; * representa o efeito de interação cafeína (*p < 0,05). Os valores dos dados foram analisados por meio da análise de variância de três fatores para medidas repetidas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Todos os participantes n 8 Idade, anos 22 ± 2 Altura, cm 176 ± 5 Peso, kg 74 ± 8 IMC, kg/m2  23 ± 2 Gordura corporal, % 20 ± 8 Tabela 1: Dados demográficos dos participantes. Os valores são médios ± DP, salvo indicação em contrário. Esta tabela é de Van Schaik et al.27.

Discussion

O método que mostramos aqui é um protocolo tecnicamente simples, seguro e custo-efetivo para medir a termogênese BAT em humanos. O protocolo aborda preocupações relacionadas à confiabilidade do uso da TRI por conta própria para distinguir entre aquecimento local devido à alteração do fluxo sanguíneo da pele e aquecimento mais profundo devido à termogênese, correlacionando a TRI com ambas as medidas de gasto energético (EE) e utilização de substrato. Por não utilizar radiação ionizante, essa técnica permite a análise de medidas repetidas, o que não é possível com as técnicas de imagem por PET. Finalmente, embora as técnicas de imagem por PET possam identificar a ativação da BAT, elas não relatam os resultados fisiológicos (aumento da temperatura e EE) que este protocolo mede.

A força do protocolo aqui descrito é que existem quatro linhas de evidência que apoiam a conclusão da termogênese MTD evocada: (1) aumento da TSCF medida, em paralelo com temperatura central inalterada e temperatura cutânea estável sobre a região de referência adjacente; (2) aumento do gasto energético; (3) mudança na utilização do substrato; e (4) queda da glicemia. As observações convergentes são todas consistentes com os resultados previstos para a termogênese BAT. A parte essencial do protocolo é a carga de carboidratos dos participantes para garantir o metabolismo de carboidratos antes da intervenção. A termogênese BAT muda o metabolismo do substrato de carboidratos para ácidos graxos livres, como mostrado pela queda no RER. Enquanto o substrato preferido para a termogênese MTD são os ácidos graxos livres, uma captação significativa de glicose nas MTD ativas está bem estabelecida 5,6,7. Portanto, observamos uma queda nos níveis glicêmicos concomitante à termogênese BAT. Não seria possível observar o deslocamento mútuo na utilização do substrato (RER) e a queda da glicemia em jejum.

Estudos anteriores concluíram que o aumento da Tscf (medida pela TRI) é suficiente para concluir a termogênese BAT. No entanto, esta conclusão só é certa se o Tscf exceder a temperatura central. Se o Tscf for menor ou igual à temperatura central, uma mudança local na temperatura devido ao aumento do fluxo sanguíneo da pele não pode ser excluída. Uma revisão sistemática concluiu que a TRI isoladamente é incapaz de determinar se o aumento da temperatura cutânea supraclavicular é devido à termogênese MTD37. A revisão observou que o método mais comum (18F-FDG PET/CT) mede a captação de glicose na MTD37. Entretanto, o substrato preferido para a termogênese MTD são os ácidos graxos13. Essa questão metodológica impede qualquer comparação significativa entre os dados de PET/CT na validação dos dados da TRI, pois qualquer uma dessas medidas isoladamente não é uma medida adequada da verdadeira atividade metabólica da MTD, pois não pode indicar a mudança no gasto energético e na utilização de substratos devido à termogênese das MTD. No entanto, com o protocolo aqui descrito, não só podemos quantificar a mudança de temperatura, mas também podemos confirmar um aumento no gasto energético – um resultado fisiológico chave da termogênese BAT. A TRI é um método sem contato, não invasivo e relativamente barato para medir mudanças de temperatura e temperatura associadas à termogênese BAT. Em contrapartida, a PET-CT é cara e expõe os indivíduos à radiação ionizante, restringindo sua aplicabilidade a pequenas análises retrospectivas de exames de imagem clínica. A aplicação do protocolo atual a ensaios clínicos randomizados em larga escala seria relativamente simples e custo-efetiva.

É importante notar que a diminuição na oxidação de carboidratos após a intervenção com cafeína pode ser explicada pela mudança na utilização do substrato como resultado do aumento da termogênese BAT devido à intervenção. Medidas de sinalização insulínica tornariam os resultados deste estudo mais robustos. No entanto, com base nos resultados deste estudo, não está claro se a cafeína afetaria a sinalização da insulina via ação nas MTD ou se a queda da glicemia é resultado da MTD ocupar mais substratos energéticos.

O método 18F-FDG PET/CT apresenta várias limitações inerentes quando utilizado para quantificar e medir a atividade fisiológica da MTD, particularmente quando se investiga a influência de nutrientes ou ingredientes dietéticos na atividade das MTD. O método 18F-FDG PET/CT requer que os indivíduos estejam em jejum para evitar aumentos induzidos pela alimentação na captação de glicose pelo tecido muscular, o que pode reduzir significativamente a detecção da função MTD e MTD38. Além disso, essa técnica sozinha não pode medir o impacto fisiológico ou a extensão da ativação das MTD. Além disso, o uso de radiação ionizante em estudos de imagem por PET é um obstáculo ético e de saúde e segurança para o desenho de estudos cruzados de medidas repetidas. Além disso, 18F-FDG representa apenas a captação de glicose, o que não é o mesmo que medir o metabolismo da glicose. Este método de carregar carboidratos antes de medir a temperatura MTD e combinar os níveis de glicose no sangue com calorimetria indireta nos permite medir rigorosamente o impacto fisiológico da termogênese e da utilização alterada do substrato, que de outra forma não estaria disponível em jejum.

Pontos fortes e limitações
Esse protocolo tem implicações mais amplas do que o simples estudo da BAT. Ao carregar carboidratos antes da intervenção, pode-se observar a oscilação dos níveis de glicose no sangue em resposta tanto à carga de carboidratos quanto à intervenção com cafeína, bem como mudanças na utilização do substrato. Portanto, esta técnica pode ser usada para melhorar os estudos de calorimetria indireta humana e medidas metabólicas. Ainda não se sabe se os resultados deste estudo podem ser replicados após outras intervenções, como exposição ao frio ou estimulação adrenérgica. No entanto, os resultados deste estudo foram replicados após intervenção com um ingrediente dietético diferente, o Capsicum annuum27. Maior rigor e confiança nos resultados poderiam ser obtidos utilizando-se uma abordagem duplo-cega para a análise das intervenções utilizando as técnicas descritas, e isso poderia ser facilmente implementado27.

O potencial de confundimento da variação da temperatura ambiente não é relevante neste protocolo, uma vez que a temperatura ambiente foi mantida estável de participante para participante. Além disso, a umidade foi levada em consideração durante a calibração do analisador de gases respiratórios. Isso é inferido na montagem desse equipamento, pois a calibração é concluída conforme as instruções do fabricante.

Os intervalos de tempo para a mensuração e tratamento foram determinados após um pequeno estudo piloto no qual a solução de problemas do protocolo foi conduzida. Essencialmente, os intervalos de tempo para a mensuração foram determinados com base no tempo necessário para o pesquisador realizar as medidas e para o conforto do participante. O tempo para a intervenção foi determinado com base no tempo necessário para que o metabolismo de carboidratos ocorresse após a carga de carboidratos, para investigar se a intervenção aumentava a oxidação de ácidos graxos livres (isto é, termogênese BAT) e diminuía a oxidação de carboidratos.

Notadamente, há diferenças entre os níveis de glicose capilar e venosa39. No entanto, no contexto do atendimento extra-hospitalar, a forma mais comum de mensuração da glicemia é por meio de amostra de sangue de origem capilar analisada por glicosímetro portátil40. Além disso, em indivíduos saudáveis (semelhantes aos incluídos neste protocolo) em um ambiente não clínico, há uma diferença estatisticamente significativa, mas não clinicamente significativa, entre os níveis de glicemia capilar e venosa quando medidos usando um glicosímetro de base capilar no ponto de atendimento41. Nesse contexto, a amostragem capilar continuaria sendo a abordagem ideal devido ao fato de que a maioria dos glicosímetros de ponto de atendimento disponíveis no mercado são projetados para analisar amostras de sangue capilar41. Do ponto de vista clínico, pode-se argumentar que a glicemia venosa é o método superior de análise. No entanto, a coleta de sangue venoso não só é cara e requer equipamentos especializados (ibidem), como também é invasiva. As considerações éticas de aumento do risco de eventos adversos durante o protocolo precisam ser ponderadas com a literatura relatada que mostra a alta correlação e confiabilidade da glicemia capilar como medida proxy da glicemia venosa42. A chave aqui, é claro, é que não nos propusemos a diagnosticar o diabetes, mas a medir as alterações nos níveis de glicose no sangue, para os quais o monitoramento da glicemia capilar é um protocolo mais do que adequado.

A glicose pode induzir a termogênese, e refeições isoladas podem ativar a MTD43. No entanto, e de forma bastante importante, os dados incluídos neste manuscrito não mostram efeito significativo da carga de glicose no grupo intervenção ou no grupo placebo. Além disso, os dados incluídos no manuscrito foram derivados dos resultados de Van Schaik e col., que incluíram uma terceira intervenção (Capsicum annuum), e a carga de glicose não produziu efeito significativo sobre as medidas27.

Ressalta-se que esse protocolo só tem sido utilizado em participantes do sexo masculino com baixa gordura corporal e MTD ativa (para reduzir o número de variáveis controláveis, o sexo feminino foi excluído do estudo). Sabe-se que existe uma correlação inversa entre adiposidade e massa de MTD em humanos44. Além disso, sabe-se que pessoas previamente obesas que perderam peso por meio de dieta e exercício físico apresentam menor taxa metabólica basal e necessitam consumir dietas menos calóricas para manter o peso normal45,46. Além disso, a atividade das MTD pode estimular o crescimento das MTD8. O método aqui descrito permitirá estudos de longo prazo para investigar alterações na atividade da MTD associadas a doenças metabólicas de uma forma não proporcionada por outras técnicas.

Conclusão
Em conclusão, demonstramos uma abordagem de mensuração para quantificar a atividade do tecido adiposo marrom humano usando TRI e calorimetria indireta após uma carga de carboidratos. As etapas críticas incluem: 1) carga de carboidratos dos participantes que estão em jejum antes de medir a temperatura BAT, combinando calorimetria indireta e níveis de glicose no sangue para permitir a quantificação da extensão fisiológica da termogênese MTD e utilização alterada do substrato; 2) avaliar os depósitos e as temperaturas relevantes das MTD da TRI a partir de um ponto de referência e da temperatura central para demonstrar qualquer aumento na Tscf que seja indicativo de ativação das MTD com base na localização anatômica. Acreditamos que essas medidas quantitativas permitem uma avaliação mais precisa da contribuição das MTD para o metabolismo energético humano adulto e a termorregulação. Esta abordagem completa deve ser usada pelos pesquisadores para estudar a fisiologia da MTD e servir como um novo padrão para o desenvolvimento de abordagens de ativação da MTD humana no futuro.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a todos os voluntários do estudo pela participação em nosso estudo. Este trabalho foi apoiado pela Holsworth Research Initiative, La Trobe University e pelo Defence Science Institute (DSI, Austrália).

Materials

Automated Sphygmomanometer Omron SEM-2 advanced, Omron, Kyoto, Japan
Dual-energy X-ray absorptiometry scanner  Hologic Horizon, Hologic Inc., Bedford, MA, USA
ECG electrodes Ambu Blue Sensor R, Malaysia
Five lead ECG Medilog AR12 plus; Schiller, Germany
FLIR E60 camera FLIR Systems Australia, Melbourne , Australia
FLIR Research Studio Professional Edition FLIR Systems Australia, Melbourne , Australia
Freestyle Optium Xceed Abbott Diabetes Care, Alameda, Canada
Glucose Gel Winners Sports Nutrition, Mt Martha, Victoria, Australia
MaskA cold-sterilized silicone mask 7400 series Oro-Nasal Mask, Hans Rudolph
Medilog Darwin2 software Professional; Schiller, Germany
Non-contact Infrared Thermometer  Berrcom, JXB-178, Guangdong, China
Optium Glucose Strip Xceed Abbott Diabetes Care, Alameda, Canada
ParvoMedics TrueOne 2400 respiratory gas analyser ParvoMedics Inc, East Sandy, UT, USA
Pre-sterilized Non-rebreathing Valve Two-way non-rebreathing valve T-Shape configuration, 2600 Medium or 2700 Large, Hans Rudolph
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References

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Van Schaik, L., Kettle, C., Green, R. A., Irving, H. R., Rathner, J. A. Using a Combination of Indirect Calorimetry, Infrared Thermography, and Blood Glucose Levels to Measure Brown Adipose Tissue Thermogenesis in Humans. J. Vis. Exp. (196), e64451, doi:10.3791/64451 (2023).
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