Ein effizientes Clearing-Protokoll zur Untersuchung der Saatgutentwicklung bei Tomaten (Solanum lycopersicum L.)

Tomate (S. lycopersicum L.) ist eine der wichtigsten Gemüsekulturen der Welt, mit einer Produktion von 186,8 Millionen Tonnen fleischigen Früchten von 5,1 Millionen Hektar im Jahr 2020¹. Es gehört zur großen Familie der Solanaceae mit etwa 2.716 Arten², darunter viele kommerziell wichtige Kulturen wie Auberginen, Paprika, Kartoffeln und Tabak. Die Kulturtomate ist eine diploide Art (2n = 2x = 24) mit einer Genomgröße von ca. 900^Mb3. Seit langem werden große Anstrengungen unternommen, um Tomatendomestizierung und -züchtung zu züchten, indem wünschenswerte Merkmale aus wilden Solanum spp. Es gibt über 5.000 Tomatenakzessionen, die im Tomato Genetics Resource Center aufgeführt sind, und mehr als 80.000 Keimplasma von Tomaten werden weltweit gelagert⁴. Die Tomatenpflanze ist mehrjährig im Gewächshaus und vermehrt sich durch Samen. Ein reifer Tomatensamen besteht aus drei Hauptkompartimenten: einem ausgewachsenen Embryo, einem zellulären Endosperm und einer harten Samenschale ^5,6 (Abbildung 1A). Nach doppelter Befruchtung geht die Entwicklung von zellulärem Endosperm der Entwicklung von Zygoten voraus. Bei ~5-6 Tagen nach der Blüte (DAF) wird erstmals ein zweizelliger Proembryo beobachtet, wenn das Endosperm aus sechs bis acht Kernen besteht⁷. Bei Solanum pimpinellifolium nähert sich der Embryo nach 20 DAF seiner endgültigen Größe, und die Samen sind nach 32 DAF⁸ für die Keimung geeignet. Wenn sich der Embryo entwickelt, wird das Endosperm allmählich absorbiert und nur eine kleine Menge Endosperm verbleibt im Samen. Das restliche Endosperm besteht aus mikropylarem Endosperm, das die Radikelspitze umgibt, und seitlichem Endosperm im Rest des Samens ^9,10. Die äußere Samenhülle wird aus verdickter und verholzter äußerer Epidermis des Integuments entwickelt, und mit den abgestorbenen Schichten von Integumentresten bilden sie eine harte Schale, um den Embryo und das Endosperm zu schützen⁵.

Abbildung 1: Schematische Darstellung eines reifen Samens in Solanum lycopersicum und Arabidopsis thaliana. (A) Längsanatomie eines reifen Tomatensamens. (B) Längsanatomie eines reifen Arabidopsis-Samens. Ein reifer Tomatensamen ist etwa 70-mal größer als ein Arabidopsis-Samen. Maßstabsbalken = (A) 400 μm, (B) 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Produktion hochwertiger Tomatensamen hängt von der Koordination zwischen dem Embryo, dem Endosperm und den mütterlichen Samenbestandteilen ab¹¹. Die Analyse von Schlüsselgenen und Netzwerken in der Samenentwicklung erfordert eine tiefe und vollständige phänotypische Aufzeichnung von mutierten Samen. Konventionelle Einbettungsschnitttechniken, wie der Halbdünnschliff und der Paraffinschnitt, werden häufig auf Tomatensamen angewendet, um die lokalen und feineren Strukturen des Embryos^{zu beobachten 12,13,14,15}. Die Analyse der Seed-Entwicklung aus dünnen Schnitten ist jedoch in der Regel mühsam und es fehlt die räumliche Auflösung der z-Achse. Im Vergleich dazu ist die Gewebereinigung eine schnelle und effiziente Methode, um das Entwicklungsstadium von embryonalen Defekten zu bestimmen, die am wahrscheinlichsten auftreten¹⁶. Das Clearing-Verfahren verringert die Undurchsichtigkeit des inneren Gewebes durch Homogenisierung des Brechungsindex mit einem oder mehreren biochemischen Mitteln¹⁶. Die gesamte Gewebereinigung ermöglicht die Beobachtung einer pflanzlichen Gewebestruktur, ohne ihre Integrität zu zerstören, und die Kombination von Clearing-Technologie und dreidimensionaler Bildgebung ist zu einer idealen Lösung geworden, um Informationen über die Morphologie und den Entwicklungszustand eines Pflanzenorgans zu erhalten^17,18. Im Laufe der Jahre wurden Samenreinigungstechniken bei verschiedenen Pflanzenarten eingesetzt, darunter Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare und Beta vulgaris 19,20,21,22,23. Unter diesen war die Whole-mount-Eizellenreinigungstechnologie ein effizienter Ansatz zur Untersuchung der Samenentwicklung von Arabidopsis, aufgrund ihrer geringen Größe, 4-5 Schichten der Samenhüllenzelle und des nuklearen Endosperms^24,25. Mit der kontinuierlichen Aktualisierung verschiedener Clearing-Mischungen, wie dem Auftauchen der Hoyer-Lösung²⁶, wurden die inneren Strukturen der Gerstenzelle mit einem hohen Grad an Klarheit abgebildet, obwohl ihr Endosperm den Großteil der Samen ausmacht. Die Embryogenese von Zuckerrüben kann durch Reinigung in Kombination mit Vakuumbehandlung und Erweichung mit Salzsäure^{beobachtet werden 19}. Im Gegensatz zu den oben genannten Arten wurden jedoch keine embryologischen Beobachtungen durch Clearing-Protokolle in Tomatensamen berichtet. Dies verhindert eine detaillierte Untersuchung der Embryonal- und Samenentwicklung von Tomaten.

Chloralhydrat wird üblicherweise als Reinigungslösung verwendet, die es ermöglicht, die eingetauchten Gewebe und Zellen auf verschiedenen optischen Ebenen darzustellen und die Zellen oder Gewebekomponenten im Wesentlichen zu erhalten 27,28,29. Das auf Chloralhydrat basierende Clearing-Protokoll wurde erfolgreich für die gesamte Reinigung von Samen verwendet, um den Embryo und das Endosperm von Arabidopsis^21,28 zu beobachten. Diese Clearing-Lösung ist jedoch nicht effizient bei der Reinigung von Tomatensamen, die undurchlässiger sind als Arabidopsis-Samen. Zu den physischen Barrieren gehören: (1) das Tomatenintegument hat fast 20 Zellschichten bei 3 bis 15 DAF 30,31, (2) das Tomatenendosperm ist zellulär, nicht vom Kerntyp 32, und (3) Tomatensamen sind etwa^70-mal größer in der Größe^33,34 und (4) produzieren große Mengen an Samenmantelschleimstoffen^, die das Eindringen von Reinigungsreagenzien blockieren und die Visualisierung von Embryozellen beeinträchtigen.

Daher stellt dieser Bericht eine optimierte Chloralhydrat-basierte Clearing-Methode für die vollständige Reinigung von Tomatensamen in verschiedenen Stadien vor, die eine tiefe Bildgebung des Embryo-Entwicklungsprozesses ermöglicht (Abbildung 2).