Multiparametrisk tumor organoid narkotika screening ved hjelp av Widefield Live-Cell Imaging for bulk og single-organoid analyse

Humant pankreatisk duktalt adenokarsinom (PDAC) pasientavledede organoider ble brukt. Fragmenter av vevsreseksjon ble innhentet fra pasienter som gjennomgikk kurativ kirurgi ved Antwerpen universitetssykehus. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter, og studien ble godkjent av UZA Ethical Committee (ref. 14/47/480). Detaljer knyttet til alt materiale, reagenser, utstyr og programvare som brukes i denne protokollen, er gitt i materialtabellen. En oversikt over arbeidsflyten er presentert i figur 1. Eksempeldata er gitt i tilleggsmaterialet for å gjengi protokollen. 1. Dag 0: Tilberedning av 2- eller 3-dagers gamle organoider Forvarm mikroplatene ved 37 °C over natten og tine den ekstracellulære matriksen (ECM) ved 4 °C. Forbered fullt PDAC organoid kulturmedium: supplement ADF +++ (Advanced DMEM / F12, 1% glutamintilskudd, 1% HEPES og 1% penicillin / streptomycin) med 0,5 nM WNT surrogat-Fc-Fusion protein, 4% Noggin-Fc Fusion Protein betinget medium, 4% Rpso3-Fc Fusion Protein betinget medium, 1x B27, 1 mM N-acetylcystein (NAC), 5 mM nikotinamid, 500 nM A83-01, 100 ng / ml FGF10 og 10 nM Gastrin). Etablere PDTOene i henhold til den valgte metoden.MERK: En detaljert protokoll er levert av Driehuis et al., som beskriver den konvensjonelle metoden for å etablere, dyrke og passere PDTO-er i ECM-kupler4. Enzymatisk dissosiere organoider i ECM kupler.Aspirer mediet og vask 1x med fosfatbufret saltvann (PBS). Legg til dissosiasjonsenzym (f.eks. 2 ml i en 6-brønns mikroplate) og pipette opp og ned 10x med en 1 ml pipette for å mekanisk dissosiere organoider og ECM-kupler. Inkuber i 10 minutter ved 37 °C, pipette opp og ned, og sjekk om organoidene er dissosiert til enkeltceller. Gjenta dette trinnet om nødvendig. Samle cellesuspensjonen i et 15 ml rør, tilsett ADF+++ til et volum på 10 ml, sentrifuge i 5 minutter ved 450 × g ved romtemperatur, og aspirer supernatanten med en Pasteur-pipette og sugepumpe. Resuspend pelleten i 100-200 μL fullt medium avhengig av pelletens størrelse og telle antall celler ved hjelp av den valgte metoden. For eksempel: bland 10 μL av cellesuspensjonen + 10 μL Trypan Blue og telle med en automatisert celleteller. Plate enkeltceller i ECM-kupler.Fortynn cellesuspensjonen og tilsett 2/3 ECM i henhold til tabell 1. Pipette opptil ti 20 μL dråper per brønn i en forvarmet 6-brønns plate. Snu platen og inkuber i 30 minutter ved 37 °C. Overlegg med fullt medium supplert med 10 μM Y-27632 og inkuber i 2-3 dager i en inkubator.MERK: Ti kupler som inneholder 75 000 celler hver er vanligvis nok til å fylle en 384-brønns mikroplate i en konsentrasjon på 200 organoider / brønn, unntatt brønnene ved kanten. 2. Dag 2 – 3: Høst og frø 2- eller 3-dagers gamle organoider Samle intakte organoider fra ECM-kuplene.MERK: Organoider har en tendens til å feste seg til plastoverflater (f.eks. rør, pipettespisser). For å unngå dette kan plastikk forskylles med en 0,1% bovin serumalbumin (BSA) / PBS-løsning.Aspirer mediet og vask 1x med PBS. Tilsett 1-2 ml kald (4 °C) organoid høstingsløsning på en 6-brønns plate avhengig av antall ECM-kupler og inkuber på is på en ristingsplattform i 10 minutter. Pipette opp og ned med en 1 ml pipette for å dissosiere ECM-kuplene, inkubere i ytterligere 10 minutter på is, og kontroller visuelt under et mikroskop om ECM er dissosiert. Valgfritt: Hvis en mer jevn størrelsesfordeling foretrekkes, filtrer suspensjonen gjennom en 70 μm cellesil før sentrifugering. Samle organoidene i et 15 ml rør forbelagt med 0,1% BSA / PBS, tilsett ADF +++ opptil 10 ml og sentrifuge i 5 minutter ved 200 × g ved 4 ° C. Aspirer supernatanten og resuspendere pelleten i opptil 1,000 μL fullt PDAC-organoidmedium, avhengig av pelletens størrelse for å oppnå en konsentrasjon på >6,000 organoider / ml. Tell organoidene ved hjelp av en hvilken som helst valgt tellemetode, helst en bildebasert. Frø organoider.MERK: Se materialtabellen for minimumsvolum/brønn for to forskjellige typer 384-brønns mikroplater som brukes i denne protokollen.Forkjøl alt plasttøy ved -20 °C eller på is i minst 20 minutter før bruk for å unngå størkning av ECM. Klargjør såløsningen fra 1 ml organoid stamløsning (trinn 2.1.6) ved å bruke fullt medium til frø ~ 200 organoider per brønn i 50 μL, minimumsvolumet som brukes til å fylle en brønn. Bruk tilleggsfil 1 til å beregne mengden organoidsåingsløsning. Tilsett et restvolum på 1 500 μL når du bruker et 25 ml reservoar og flerkanals pipette eller pipetteringsrobot. Frø organoidene ved hjelp av en pipetteringsrobot.MERK: Både såløsningen og mikroplaten må avkjøles ved 4 °C under pipettering for å unngå størkning av ECM. Derfor ble et 25 ml reservoar og en mikroplateholder 3D-printet for å brukes i kombinasjon med pipetteringsroboten som kan holde kjøleelementer oppført i materialtabellen. STL-filer for 3D-utskrift av tilpasset labware (tilleggsfil 2 og tilleggsfil 3) og tilpassede labware JSON-filer for pipetteringsroboten (tilleggsfil 4 og tilleggsfil 5) er gitt.Utform dispenseringsprotokollen ved hjelp av det elektroniske protokollutformingsverktøyet. Et eksempel på en JSON-fil (tilleggsfil 6) er gitt, der det tilpassede laboratoriet allerede er lastet inn og en åttekanals p300 (Gen2) pipette med tilhørende pipettespisser brukes. Åpne pipetteringsrobotkontrollappen, velg protokoller, klikk på Importer, og dra og slipp Tilleggsfil 6 i det angitte feltet. Velg den importerte protokollen og plasser alt labware, inkludert kjøleelementer og plastikk, i dekkene i henhold til oppsettet som vises i Deck Setup-feltet . Bruk venstre spor for 25 ml reservoar og kjøleelement som vist i tilleggsfil 7. Klikk på Run Protocol og fortsett til Setup. Åpne kategorien Labware Setup, klikk på Run Labware Position Check, og følg instruksjonene for å kalibrere pipetteringsroboten til den nye maskinvaren.MERK: Labware offset data kan lagres for senere, men det anbefales å kjøre labware posisjonskontroll før hver kjøring. Fyll 25 ml reservoaret (plassert på toppen av kjøleelementet) med den avkjølte organoidsåingsløsningen og klikk på Start Run.MERK: De øverste og nederste brønnene blir også fylt med organoid suspensjonsløsning på grunn av bruken av åttekanalspipetten. Sentrifuger mikroplaten i 1 min ved 100 × g ved 4 °C. Inkuber ved 37 °C i minst 30 minutter. Fyll de ytre tomme brønnene med minst 50 μL H2O for å unngå fordampning. Rug ved 37 °C over natten for å fjerne eventuelle bobler i brønnen som kan forstyrre bildeanalysen. 3. Dag 4: Medikamentell behandling og reagensdispensering med digital legemiddeldispenser Opprett protokollen for legemiddeldispensering ved hjelp av den digitale programvaren for kontroll av legemiddeldispensere.Hold markøren over plate 1 over plateoppsettet, velg rediger plateattributter, og fyll ut platetype: 384 brønn, tilleggsvolum (μL): 50 og DMSO-grense (%): 1. Legg til væsker ved å klikke på + -knappen ved siden av Fluids. Dobbeltklikk på det nyopprettede væsken og gi det et navn; velg klasse (DMSO-basert eller vandig+Tween 20) og konsentrasjon.MERK: Alle legemidler og reagenser må oppløses i 100% DMSO eller 0,3% Tween-20. En 1-10 mM lagerløsning kan brukes, med tanke på en maksimal DMSO-konsentrasjon på <1%. Tabell 2 gir eksempler på nødvendige fortynninger for vanlige fluorescerende reagenser og terapier. Plate layoutFor medikamenttitrering, velg brønner og klikk på Titrering. For væske, velg stoffet av interesse, velg den høyeste konsentrasjonen (f.eks. 2000 nM) og den laveste konsentrasjonen (f.eks. 10 nM); For replikasjoner velger du minimum 2 og velger ønsket titreringsmønster.MERK: Titreringsmønsteret vil avhenge av mange faktorer, inkludert hvor mye forbindelse som skal passe i en enkelt plate, om brønnene skal randomiseres, og antall replikasjoner og kontroller. For den positive kontrollen velger du tre brønner, klikker på Angi verdi og fyller ut 2 μM staurosporin fra 10 mM lager i DMSO, noe som vil indusere maksimal celledød. For Cytotox Green, velg alle brukte brønner, klikk på Angi verdi og skriv inn 60 nM / brønn.MERK: Cytotox Green fluorescerende farging indikerer celler som har dødd, og vil derfor ikke forstyrre overvåking av legemiddelrespons. Her er det ikke nødvendig med fluorescerende markør for levende celler. For negativ kontroll og DMSO-normalisering, velg alle brønnene med ytterligere fire brønner for kjøretøykontrollen, høyreklikk, velg normalisering, velg normaliser væskeklasse: DMSO-basert, og normaliser til høyeste klassevolum for å oppnå lik DMSO-konsentrasjon i hver brønn.MERK: DMSO-konsentrasjoner bør være <1%. Et eksempel på TDD-legemiddeltitreringsfil (tilleggsfil 8) er gitt. Klikk på pilen under Kjør øverst til venstre, velg Simuler alltid, og klikk på Simuler for å identifisere eventuelle feil og få volumene av hvert legemiddel som skal klargjøres. MERK: For å overvinne en advarsel når det første dispenseringsvolumet er for lavt, “Dispenser advarselsbrønn på 30 nL eller høyere anbefales for hver væske på hver plate,” velg to brønner på kanten som er fylt med vann, velg Angi verdi, og skriv inn 10 μM av legemidlet som advarselen oppstår for. Dette primer legemiddelpatronen med et volum høyere enn 30 nL. De samme brønnene kan brukes til å klargjøre DMSO-kassetten ved å sette en normalisering til % av total volumverdi (f.eks. 0,5 %). Fjern merket for Simuler alltid under Kjør-knappen ; klikk på Kjør for å starte legemiddeldispenseringsprotokollen og følg instruksjonene. Påfør tetningsmembranen på mikroplaten for å forhindre fordampning. Inkuber Cytotox Green-fargestoffet 1-2 timer ved 37 °C i inkubatoren og fortsett til trinn 4. 4. Skaff bilder med live-cell imager MERK: For veksthastighet og NDR må en skanning ved tidspunkt 0 (T0 = startbehandling) kjøpes 1-2 timer etter tilsetning av Cytotox Green. Åpne programvaren Live-Cell Imager Control, velg Method Editor New, gå til fil > import, og velg eksempelmetoden XML-fil (tilleggsfil 9). Alternativt kan du opprette en ny fil og velge Plate: (CORE384fb_OpticalImaging) – Corning 384 Flat Black (Corning #4588), No lid og No humidity cassette; Søknad: Bare bilder; Mål: 4x; Mønster: Sentral; Sjekk kanaler Brightfield og Green (Led intensitet (%) = 40; Eksponeringstid (ms) = 200).MERK: De grønne kanalinnstillingene fungerer bra for en konsentrasjon på 60 nM Cytotox Green. Live viewer-alternativet kan brukes til å justere fokusforskyvningen og / eller LED-innstillingene i sanntid. Klikk på Start for å starte skanning på T0. Gjenta skanningen hver 24. time i opptil 5 dager med samme metode. Hvis du vil kjøre timelapse-målingen automatisk, kan du også justere metoden i programvaren for live-cell imager-kontroll til et kinetisk eksperiment ved å klikke og dra kategorien Kinetisk løkke inn i metodefeltet. På samme måte må temperatur- og gassfanene dras inn i metodefeltet for å sette systemet til 37 °C og 5 % CO2 for å sikre de riktige forholdene i levende cellebilder under forsøket. 5. Bilde- og dataanalyse Slå sammen og komprimere dataLive-cell imager Control-programvaren genererer en mappe for hver skanning på hvert tidspunkt. Opprett en ny mappe, kopier de individuelle eksperimentmappene til denne nye overordnede mappen, og legg til _0h, _24h, _48h, _72h, _96h og _120h til de tilsvarende eksperimentmappenavnene. Forbered et XLSX-platekart fra den digitale programvaren for legemiddeldispenserkontroll ved å høyreklikke på platekartoppsettet fra legemiddeldispenserprotokollen og kopier alle brønnene; lime inn dataene i en XLSX-fil. Fjern data fra Cytotox Green og staurosporin og legg til en matrise for Cell Line og Replicate. Skriv inn ctrl- og ctrl+. Se tilleggsfil 10 for et eksempel på platekart. Åpne datakomprimeringsverktøyet, klikk på Bla gjennom, velg den overordnede mappen, og klikk på Kjør for å starte komprimering av bildedata. Alle TIFF-bildefiler for de forskjellige tidspunktene komprimeres til en enkelt HDF5 for hver brønn i en ny datasettmappe i foreldremappen. Bilde analyseGå til webappplattformen for bildeanalyse, logg inn og klikk på Legg til nytt prosjekt i Hjem-fanen . Skriv inn prosjektnavnet, fortsett, velg Legg til nytt eksperiment, og last opp datasettmappen som inneholder HDF5-filene. Etter opplasting, gå til prosjekt- og eksperimentmappen og klikk på Last opp platekart for flere funksjoner. Klikk på Kjør analyse, velg Multi-Organoid analyse, Standardparametere, og klikk på Analyser for å starte bildeanalyse. Klikk på Last ned resultater for å laste ned rådatatabellene som inneholder målingene for hver brønn (f.eks. totalt lysfeltområde, totalt fluorescensgrønt område osv.) og de segmenterte bildene/videoene for å bekrefte nøyaktigheten av analysen og videre databehandling. Vekstratebaserte legemiddelresponsmålinger og normalisert legemiddelresponsVelg Raw_NDR.xlsx fil fra resultatmappen (plate kart kreves) (Tilleggsfil 11) og last dette inn i Official_NDR_7point R-script (tilleggsfil 12) for automatisk å generere GR (normalisert til ctrl-) og NDR (normalisert til ctrl- og ctrl+) verditabeller (tilleggsfil 13, tilleggsfil 14, tilleggsfil 15 og tilleggsfil 16 ). GR- og NDR-verdier beregnes fra parameteren som vist i ligning (1) ved hjelp av R-skriptet (tilleggsfil 12).Totalt overlevelsesareal = Totalt Brightfield-område – Totalt grønt område (1)Ved 0 < NDR <1 = cytostatisk effekt (vekststans) og NDR < 0 = cytotoksisk respons (celledød).MERK: R-skriptet ble tilpasset fra Gupta et al.6. Fra clonal_data.xlsx-tabellen henter du enkeltorganoidresponsdata og plotter dem som et bobleplott. Bruk Z-faktor10 for å vurdere kvaliteten på en løpetur (se ligning (2)). Kast et eksperiment med en Z-faktor < 0,5.(2)