Multiparametrisches Tumor-Organoid-Wirkstoff-Screening mit Weitfeld-Live-Cell-Imaging für die Bulk- und Einzelorganoid-Analyse
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine halbautomatische Methode für Organoid-Wirkstoff-Screenings mit mittlerem bis hohem Durchsatz und mikroskopunabhängige, automatisierte Bildanalysesoftware zur Quantifizierung und Visualisierung multiparametrischer, einzelorganoider Arzneimittelreaktionen zur Erfassung der intratumoralen Heterogenität.
Abstract
Patienten-abgeleitete Tumor-Organoide (PDTOs) sind vielversprechend für die präklinische und translationale Forschung und die Vorhersage des Therapieansprechens von Patienten aus Ex-vivo-Medikamentenscreenings . Aktuelle Adenosintriphosphat (ATP)-basierte Wirkstoff-Screening-Assays erfassen jedoch nicht die Komplexität einer Arzneimittelreaktion (zytostatisch oder zytotoxisch) und die intratumorale Heterogenität, die nachweislich in PDTOs aufgrund einer Massenauslesung erhalten bleibt. Live-Cell-Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um dieses Problem zu überwinden und Arzneimittelreaktionen detaillierter zu visualisieren. Bildanalysesoftware ist jedoch oft nicht an die Dreidimensionalität von PDTOs angepasst, erfordert fluoreszierende Viabilitätsfarbstoffe oder ist nicht mit einem 384-Well-Mikrotiterplattenformat kompatibel. Dieser Artikel beschreibt eine halbautomatische Methodik zum Aussäen, Behandeln und Abbilden von PDTOs in einem Hochdurchsatz-Format mit 384 Vertiefungen unter Verwendung herkömmlicher Breitfeld-Live-Cell-Bildgebungssysteme. Darüber hinaus haben wir eine Bildanalysesoftware ohne Lebensfähigkeitsmarker entwickelt, um wachstumsratenbasierte Metriken für das Ansprechen auf Medikamente zu quantifizieren, die die Reproduzierbarkeit verbessern und Wachstumsratenschwankungen zwischen verschiedenen PDTO-Linien korrigieren. Unter Verwendung der normalisierten Medikamentenreaktionsmetrik, die das Arzneimittelansprechen basierend auf der Wachstumsrate bewertet, die auf einen positiven und negativen Kontrollzustand normalisiert wurde, und einem fluoreszierenden Zelltodfarbstoff können zytotoxische und zytostatische Arzneimittelreaktionen leicht unterschieden werden, was die Klassifizierung von Respondern und Non-Respondern erheblich verbessert. Darüber hinaus kann die Heterogenität der Arzneimittelreaktion anhand der Analyse der Arzneimittelantwort auf einzelne Organoide quantifiziert werden, um potenzielle, resistente Klone zu identifizieren. Letztendlich zielt diese Methode darauf ab, die Vorhersage des klinischen Therapieansprechens zu verbessern, indem eine multiparametrische Signatur des Arzneimittelansprechens erfasst wird, die den kinetischen Wachstumsstillstand und die Quantifizierung des Zelltods umfasst.
Introduction
In den letzten Jahren haben sich die In-vitro-Entdeckung von Krebsmedikamenten, das Screening von Medikamenten und die Grundlagenforschung von der Verwendung traditioneller zweidimensionaler (2D) Krebsmodelle mit immortalisierten Zelllinien zu physiologisch relevanteren dreidimensionalen (3D) Krebsmodellen entwickelt. Dies hat die Einführung von Tumor-Sphäroiden mit etablierten Krebszelllinien vorangetrieben, die komplexere Zell-zu-Zell-Interaktionen und Strukturen in soliden Tumoren nachbilden. Derzeit sind patientenabgeleitete Tumor-Organoide (PDTOs) das fortschrittlichste und physiologisch relevanteste 3D-Krebsmodell, das für die In-vitro-Krebsforschung zur Verfügung steht, da sie zusätzliche Vorteile gegenüber Tumor-Sphäroiden bieten, nämlich die Heterogenität bei Krebspatienten1. PDTOs werden aus Tumorgewebe von Krebspatienten etabliert und behalten daher sowohl den Tumorphänotyp als auch den Genotyp bei. Daher werden PDTOs für die Grundlagen- und translationale Krebsforschung von unschätzbarem Wert und haben das Potenzial, die Präzisionsonkologie erheblich zu verbessern2.
Trotz ihres vielversprechenden Potenzials werden diese ausgefeilten 3D-In-vitro-Krebsmodelle aufgrund fehlender fortschrittlicher Analysemethoden oft nicht ausreichend genutzt. Der am häufigsten verwendete Assay bestimmt die Anzahl der lebensfähigen Zellen in der PDTO über die Quantifizierung von intrazellulärem ATP3. Bei diesen Assays handelt es sich in der Regel um Einzelzeitpunkt-Massenanalysen, wodurch kritische zeitabhängige Reaktionen übersehen und klonale Reaktionen vernachlässigt werden. Insbesondere die Fähigkeit, das Wachstum von PDTOs (Wachstumsrate) und ihr Ansprechen auf bestimmte Therapien zu überwachen, ist von großem Interesse 4,5. Die normalisierte Arzneimittelreaktion (NDR), die die Arzneimittelreaktion auf der Grundlage der Wachstumsrate bewertet, die auf einen positiven (Strg +) und negativen Kontrollzustand (Strg-) normalisiert wurde, wurde kürzlich auch als eine entscheidende Metrik für die Bewertung der Empfindlichkeit von Krebsmedikamenten mit zellbasiertem Screening beschrieben, obwohl dies hauptsächlich für 2D-Zelllinien6 durchgeführt wurde. Daher sind ausgefeiltere Analysemethoden erforderlich, um diese klinisch repräsentativeren und komplexeren 3D-Krebsmodelle voll auszuschöpfen. Die Mikroskopie gilt als leistungsfähiger Ansatz, um die Komplexität dieser Organoidmodelle zu untersuchen7.
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Überwachung kinetischer Arzneimittelreaktionen in 3D-Krebsmodellen unter Verwendung herkömmlicher Weitfeldmikroskope und Live-Cell-Imaging-Systeme. Das von Driehuis et al.4 beschriebene Protokoll wurde so angepasst, dass es mit der Automatisierung unter Verwendung eines Pipettierroboters, eines digitalen Medikamentenspenders und eines Live-Cell-Imaging-Systems kompatibel ist, um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen und die Anzahl der “praktischen” Arbeitsstunden zu reduzieren. Diese Methode ermöglicht ein Mittel- bis Hochdurchsatz-Wirkstoff-Screening sowohl von Tumor-Sphäroiden mit etablierten Krebszelllinien (siehe Ergänzungstabelle S1 für getestete Zelllinien) als auch der PDTOs in einem 384-Well-Mikrotiterplatten- und Multi-Organoid-Format. Durch die Verwendung eines Convolutional Network Machine Learning-Verfahrens konnte die automatisierte Identifizierung und Verfolgung einzelner Tumor-Sphäroide oder PDTOs ausschließlich durch Hellfeld-Bildgebung und ohne die Verwendung von fluoreszierenden Lebendzell-Markierungsfarbstoffen durchgeführt werden8. Dies ist sehr vorteilhaft, da die meisten Identifikationen mit Hellfeld-Bildgebung eine manuelle Annotation erfordern (was mühsam und zeitaufwendig ist) oder die Zugabe von Fluoreszenzfarbstoffen erfordert, die Arzneimittelreaktionen im Zusammenhang mit Photoxizität-induziertem oxidativem Stress verwirren können9.
Die daraus resultierende eigens entwickelte Bildanalysesoftware erweitert die Funktionalität herkömmlicher Live-Cell-Imaging-Systeme, da 3D-Bildanalysemodule entweder nicht verfügbar, plattformbeschränkt oder nicht kompatibel mit 384-Well-Mikrotiterplatten und Whole-Well-Imaging sind. Darüber hinaus sind diese Module oft sehr preisgünstig und bieten begrenzte Organoid-Auslesungen. Daher ist diese Methode von großer Relevanz für Wissenschaftler, die Zugang zu weit verbreiteten Live-Cell-Imaging-Systemen haben und darauf abzielen, mehr Informationen über eine Arzneimittelreaktion im Vergleich zum Goldstandard, aber rudimentärem ATP-basierten Assay zu extrahieren. Durch die Hinzufügung spezifischer Zelltodindikatoren können zytostatische Arzneimittelreaktionen von zytotoxischen Reaktionen unterschieden werden, wodurch weitere Einblicke in mechanistische Arzneimittelwirkungen gewährt werden, die derzeit durch eine Einzelzeitpunktanalyse nicht erreicht werden können. Schließlich ermöglicht die Live-Cell-Bildgebung das Tracking einzelner Organoide, um Metriken für das Ansprechen einzelner Organoide zu erhalten, um die Heterogenität der Reaktion zu erfassen und potenziell resistente Subklone zu identifizieren.
Das Ziel dieser Methode und der zugehörigen Bildanalysesoftware ist es, eine kostengünstige Automatisierung im Organoid-Wirkstoff-Screening zu implementieren, um Benutzereingriffe zu begrenzen und die Variabilität in der Handhabung, Bildanalyse und Datenanalyse zu reduzieren. Um diese Software den Forschern zur Verfügung zu stellen, ist sie mikroskop- und plattformunabhängig und wird eine Cloud-basierte Anwendung zur Verfügung gestellt. Durch die Unterstützung herkömmlicher Live-Cell-Imaging-Systeme wollen wir daher auch deren Funktionalität für 3D-Kultivierungsanwendungen und -analysen verbessern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das PDTO-Screening mit mittlerem bis hohem Durchsatz beruht häufig auf Messwerten, die nur einen Bruchteil der Informationen extrahieren, die Organoide potenziell liefern könnten. Es wurde immer deutlicher, dass fortschrittlichere 3D-Assays, Auslesungen und Analysemethoden von entscheidender Bedeutung sind, damit die sich schnell entwickelnde Organoidtechnologie ein größeres wissenschaftliches und klinisches Potenzial entfalten kann. Hier wird eine fortschrittliche Screening-Pipeline beschrieben, die nicht nur die Reproduzierbarkeit erhöht, sondern auch die klinische Übersetzbarkeit durch die Einbindung einer KI-gesteuerten Live-Cell-Bildgebung erheblich verbessert. Zusätzlich zu einer eigens entwickelten Analysesoftware wird die Normalized Drug Response Metric (NDR) eingesetzt, die ihre Fähigkeit, patientenspezifische Unterschiede im Behandlungsansprechen zu definieren, deutlich macht6.
Die Einbeziehung dieser Normalisierungsmetrik wird zweifellos von unschätzbarem Wert sein, wenn man bedenkt, dass zahlreiche Studien darauf abzielen, das Ansprechen auf die Behandlung auf der Grundlage geringfügiger Unterschiede in der Fläche unter der Kurve (AUC) oder der halbmaximalen Hemmkonzentration (IC50) abzugrenzen (da sich die meisten Dosis-Wirkungs-Kurven überlappen bzw. nahe beieinander liegen)11,12 . Wachstumsratenmetriken wurden bereits in Organoid-Screening-Protokollen unter Verwendung des ATP-basierten Assays implementiert, beruhen jedoch auf der Normalisierung von Referenzbohrungen, die zum Zeitpunkt 04 lysiert wurden. Im Gegensatz dazu ermöglicht diese Methode eine Normalisierung der Wachstumsrate innerhalb der Vertiefung, die nicht nur Unterschiede zwischen Patienten in der PDTO-Wachstumsrate berücksichtigt, sondern auch Unterschiede zwischen den Schichten, die sich aus Variationen der Seeding-Dichte und von Plattenstandort-abhängigen Effekten ergeben, um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen. Darüber hinaus haben wir den NDR angepasst, um die Trennung der intermediären PDTO-Reaktion weiter zu erhöhen, indem wir eine Positivkontrolle für die Normalisierung 6,8 einbeziehen.
Darüber hinaus kann die Analyse, die mit Hochdurchsatz- und Automatisierungsformaten kompatibel ist, einzelne Organoidreaktionen genau erkennen, was die Quantifizierung der subklonalen Resistenz ermöglicht – die Hauptantriebskraft für Tumorrückfall und -progression13. Obwohl PDAC052 und PDAC060 beispielsweise ein gutes Ansprechen auf die Behandlung in vitro zeigten (basierend auf dem NDR), konnte die zusätzliche Einzelorganoid-Analyse eine kleine (größere Population mit PDAC060) Population von Subklonen nachweisen, die nicht auf die Behandlung ansprechen. Interessanterweise stimmte dies in hohem Maße mit der klinischen Beobachtung überein, da PDAC052 und PDAC060 ein dauerhaftes Ansprechen aufwiesen (keine Tumoraktivität nachgewiesen), aber schließlich beide mit einer lokalen Tumorprogression diagnostiziert wurden (aufgrund des Vorhandenseins resistenter Klone). Im Vergleich zu den herkömmlichen 3D-Auslesungen (ATP-basierter Assay und Größe/Zahlen) wird erwartet, dass diese fortschrittliche Screening-Pipeline die Vorhersageleistung erhöht, indem sie mehr klinisch relevante Informationen aus diesen “Patienten im Labor” extrahiert. Diese Hypothese wird nun getestet, indem klinische PDTO-Proben im Labor der Autoren mit dieser Methode untersucht werden, um ex vivo mit dem In-vivo-Ansprechen und dem klinischen Ergebnis zu korrelieren.
Um mehr Einblicke in die Mechanismen einer Medikamentenreaktion zu erhalten, sind konventionelle fluoreszierende Live-Cell-Imaging-Reagenzien neben Zytotoxizitätsfarbstoffen mit dieser Methode kompatibel, um die Mechanismen des Zelltods zu untersuchen. Wir haben bereits die Kompatibilität dieser Methode mit dem Sartorius Caspase 3/7 Green Reagenz gezeigt, um die Caspase-abhängige Induktion der Apoptose nach Cisplatin-Behandlungzu untersuchen 8. Die Verträglichkeit mit anderen Farbstoffen zur Untersuchung von oxidativem Stress (CellROX-Reagenzien) oder Hypoxie (Image-iT Hypoxia-Reagenzien) muss noch getestet werden. Diese Reagenzien wurden jedoch bereits erfolgreich in 3D-In-vitro-Modellen eingesetzt 14,15.
Die Bildanalysesoftware ist auch mit anderen Plattenformaten oder Kultivierungsmethoden (z. B. Mikrohohlraumplatten, ECM-Kuppeln) kompatibel, wenn klare, scharfe Bilder der Organoide aufgenommen werden können. Dies ist oft eine Herausforderung für Organoide, die in Kuppeln kultiviert werden, da sie in verschiedenen Z-Ebenen wachsen, was eine Z-Stacking-Funktionalität des Mikroskops erfordert, die nicht immer verfügbar ist. Daher empfehlen wir die Verwendung von ULA 384-Well-Mikrotiterplatten mit flachem Boden, um eine ausreichende Bildqualität zu gewährleisten.
Darüber hinaus ist die Analyse mit anderen Live-Cell-Bildgebungssystemen kompatibel, wie zuvor für Phasenkontrastbilder gezeigt wurde, die mit einem IncuCyte ZOOM-Systemaufgenommen wurden 8. Eine Einschränkung des Spark Cyto-Live-Cell-Imaging-Systems, das in diesem Manuskript verwendet wurde, ist die Ein-Platten-Kapazität für kinetische Messungen. Die Spark Motion-Erweiterung erhöht jedoch die Kapazität auf bis zu 40 Mikrotiterplatten, die in großen Mengen gesiebt werden können. Die Kompatibilität der selbst entwickelten Software wird auf diese und andere Systeme ausgeweitet, um eine plattformunabhängige Lösung anzubieten, mit dem Ziel, Bild- und Datenanalyse-Pipelines zu standardisieren und zu automatisieren. Die webbasierte Anwendung wird auch interaktive Grafikwerkzeuge und automatisierte Berechnungen der Arzneimittelmetrik enthalten, wie in diesem Artikel gezeigt, um die manuelle Analysezeit zu reduzieren.
Der markierungsfreie PDTO-Segmentierungsalgorithmus wurde an verschiedenen selbst gezüchteten Sphäroid- und PDTO-Modellen mit deutlichen morphologischen Unterschieden (fest, halbfest, zystisch) trainiert und getestet und kann diese daher mit hoher Genauigkeit erkennen8. Eine Einschränkung des Modells besteht darin, dass der Einschluss von zystischen PDTOs die unerwünschte Detektion von Blasen erhöht, die in der nach der Aussaat vorhandenen Blasen vorhanden sind. Die Inkubation über Nacht war jedoch ausreichend, um die meisten dieser Blasen zu entfernen, was einen qualitativen Zeitpunkt 0-Scan ermöglichte. Die Genauigkeit der organoiden Bildsegmentierung und der Methode muss von anderen Anwendern validiert werden, und basierend auf ihrem Feedback kann die Software weiter trainiert werden, um einen robusten und automatisierten Bildanalysealgorithmus zu erhalten. Darüber hinaus wollen wir mehr klinische Daten erhalten, um das mit dieser Methode quantifizierte ex vivo Arzneimittelansprechen mit dem klinischen Ansprechen beim Patienten zu korrelieren, um die besten Parameter zur Vorhersage des Therapieansprechens zu identifizieren und diese Methode für die funktionelle Präzisionskrebsmedizin weiterzuentwickeln16.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ein Teil dieser Forschung wurde durch Spenden verschiedener Spender finanziert, darunter Dedert Schilde vzw und Willy Floren. Diese Arbeit wird teilweise von der Flämischen Forschungsstiftung, 12S9221N (A.L.), G044420N (S.V., A.L., E.G.), 1S27021N (M.L), und vom Industrial Research Fund der Universität Antwerpen, PS ID 45151 (S.V., A.L., C.D.), finanziert. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt.
Materials
| 6-well plate | Greiner | 657160 | |
| 8-Channel p300 (GEN 2) pipette | Opentrons | ||
| 300 µL Tips | Opentrons | ||
| 384-well flat-bottom ULA microplate | Corning | 4588 | minimum volume 50 µL |
| 384-well flat-bottom ULA Phenoplate | Perkin Elmer | 6057802 | minimum volume 75 µL |
| A8301 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| ADF+++ | Advanced DMEM/F12, 1% GlutaMAX, 1% HEPES, 1% penicillin/streptomycin | ||
| Advanced DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 12634 | |
| B27 | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| Breathe easy sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z380059 | |
| Caspase 3/7 Green | Sartorius | 4440 | |
| Cell Counting Slides for TC10/TC20 | Bio-Rad Laboratories | 1450017 | |
| CellTiter-Glo 3D | Promega | G9681 | ATP-assay |
| Cooler for 25 mL reservoir | VWR (Diversified Biotech) | 490006-908 | |
| Cooling element 12 x 8 x 3 cm | Bol.com | 9200000107744702 | For custom microplate holder OT-2 |
| Cultrex Organoid Harvesting Solution | R&D systems | 3700-100-01 | |
| Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 | R&D systems | 3533-010-02 | extracellular matrix (ECM) |
| Cytotox Green | Sartorius | 4633 | |
| Cytotox Red | Sartorius | 4632 | |
| D300e | Tecan | Digital drug dispenser | |
| D300e Control v3.3.5 | Tecan | Control software D300e | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| Full Medium | ADF+++ supplemented with 0.5 nM WNT surrogate-Fc-Fusion protein, 4% Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium, 4% Rpso3-Fc Fusion Protein conditioned medium, 1x B27, 1 mM N-acetyl cysteine (NAC), 5 mM nicotinamide, 500 nM A83-01, 100 ng/mL FGF10, and 10 nM Gastrin | ||
| Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| Gemcitabine | Selleck Chemicals | S1714 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 35050 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62259 | |
| Human pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) patient-derived organoids | Biobank@uza (Antwerp, Belgium; ID: BE71030031000; Belgian Virtual Tumorbank funded by the National Cancer Plan) | ||
| N-acetyl-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-25G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium | Immunoprecise | N002 | |
| Opentrons App v6.0.1 | Opentrons | OT-2 control software | |
| Opentrons Protocol Designer Tool | Opentrons | https://designer.opentrons.com/ | |
| Orbits data compression tool | www.orbits-oncology.com or contact corresponding author | ||
| Orbits image analysis webapp | University of Antwerp | www.orbits-oncology.com or contact corresponding author | |
| OT-2 | Opentrons | Pipetting robot | |
| Paclitaxel | Selleck Chemicals | S1150 | |
| Pasteur Pipette 230 mm | Novolab | A33696 | |
| Peniciline-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Rspo3-Fc Fusion Protein conditioned medium | Immunoprecise | N003 | |
| Spark Cyto 600 | Tecan | Live-cell imaging and multi-mode platereader | |
| SparkControl v3.1 | Tecan | Spark Cyto control software | |
| Staurosporine | Tocris Bioscience | 1285 | |
| Sterile 25 mL reservoir | VWR (Diversified Biotech) | 10141-922 | |
| T8 plus cassette | Tecan | ||
| TC20 | Bio-Rad Laboratories | automated cell counter | |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12604-021 | dissociation enzyme |
| Tween-20 | Acros Organics | 233360010 | |
| WNT Surrogate-Fc-Fusion protein | Immunoprecise | N001 | |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 |
References
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Veninga, V., Voest, E. E. Tumor organoids: Opportunities and challenges to guide precision medicine. Cancer Cell. 39 (9), 1190-1201 (2021).
- Le Compte, M., et al. Patient-derived organoids as individual patient models for chemoradiation response prediction in gastrointestinal malignancies. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 157, 103190 (2021).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs. Nature Methods. 13 (6), 521-527 (2016).
- Gupta, A., Gautam, P., Wennerberg, K., Aittokallio, T. A normalized drug response metric improves accuracy and consistency of anticancer drug sensitivity quantification in cell-based screening. Communications Biology. 3 (1), 42 (2020).
- Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
- Deben, C., Cardenas, E., et al. OrBITS: label-free and time-lapse monitoring of patient derived organoids for advanced drug screening. Cellular Oncology. , (2022).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. Bioessays. 39 (8), (2017).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Engel, R. M., et al. Patient-derived colorectal cancer organoids upregulate revival stem cell marker genes following chemotherapeutic treatment. Journal of Clinical Medicine. 9 (1), 128 (2020).
- Hennig, A., et al. Detecting drug resistance in pancreatic cancer organoids guides optimized chemotherapy treatment. The Journal of Pathology. 257 (5), 607-619 (2022).
- D’Alterio, C., Scala, S., Sozzi, G., Roz, L., Bertolini, G. Paradoxical effects of chemotherapy on tumor relapse and metastasis promotion. Seminars in Cancer Biology. 60, 351-361 (2020).
- Njoroge, R. N., et al. Organoids model distinct Vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution. Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).
- Godet, I., et al. Fate-mapping post-hypoxic tumor cells reveals a ROS-resistant phenotype that promotes metastasis. Nature Communications. 10 (1), 4862 (2019).
- Letai, A. Functional precision cancer medicine-moving beyond pure genomics. Nature Medicine. 23 (9), 1028-1035 (2017).
