Многопараметрический скрининг опухолевых органоидных препаратов с использованием широкоугольной визуализации живых клеток для объемного и одноорганоидного анализа
Summary
Этот протокол описывает полуавтоматизированный метод скрининга органоидных препаратов со средней и высокой пропускной способностью и не зависящее от микроскопа автоматизированное программное обеспечение для анализа изображений для количественной оценки и визуализации многопараметрических, одноорганоидных реакций на лекарственные средства для захвата внутриопухолевой гетерогенности.
Abstract
Органоиды опухолей, полученные от пациента (PDTO), имеют большие перспективы для доклинических и трансляционных исследований и прогнозирования ответа пациента на терапию от скрининга лекарств ex vivo . Однако современные анализы скрининга лекарств на основе аденозинтрифосфата (АТФ) не отражают сложность лекарственного ответа (цитостатического или цитотоксического) и внутриопухолевой гетерогенности, которая, как было показано, сохраняется в ФДО из-за объемного считывания. Визуализация живых клеток является мощным инструментом для преодоления этой проблемы и более глубокой визуализации реакций на лекарства. Однако программное обеспечение для анализа изображений часто не адаптировано к трехмерности PDTO, требует флуоресцентных красителей жизнеспособности или не совместимо с форматом микропластин с 384 лунками. В этой статье описывается полуавтоматизированная методология для посева, обработки и изображения PDTO в высокопроизводительном формате 384 скважины с использованием обычных, широкоугольных систем визуализации живых клеток. Кроме того, мы разработали программное обеспечение для анализа изображений без маркеров жизнеспособности для количественной оценки показателей лекарственного ответа на основе скорости роста, которые улучшают воспроизводимость и корректируют вариации скорости роста между различными линиями PDTO. Используя нормализованную метрику лекарственного ответа, которая оценивает реакцию на лекарство на основе скорости роста, нормализованной до положительного и отрицательного контрольного состояния, и флуоресцентного красителя гибели клеток, цитотоксические и цитостатические реакции на лекарства могут быть легко различимы, что значительно улучшает классификацию респондентов и неответчиков. Кроме того, гетерогенность лекарственного ответа может быть количественно определена на основе анализа реакции на одноорганоидное лекарственное средство для выявления потенциальных резистентных клонов. В конечном счете, этот метод направлен на улучшение прогнозирования ответа на клиническую терапию путем захвата многопараметрической сигнатуры лекарственного ответа, которая включает в себя кинетическую остановку роста и количественную оценку гибели клеток.
Introduction
В последние годы открытие лекарств от рака in vitro , скрининг лекарств и фундаментальные исследования переходят от использования традиционных двумерных (2D) моделей рака с увековеченными клеточными линиями к более физиологически значимым трехмерным (3D) моделям рака. Это стимулировало принятие опухолевых сфероидов с установленными линиями раковых клеток, которые воссоздают более сложные межклеточные взаимодействия и структуры, присутствующие в солидных опухолях. В настоящее время полученные от пациента опухолевые органоиды (PDTO) являются наиболее передовой и физиологически значимой 3D-моделью рака, доступной для исследований рака in vitro , поскольку они обеспечивают дополнительные преимущества по сравнению с сфероидами опухоли, а именно гетерогенность, обнаруженную у больных раком1. ФДО устанавливаются из опухолевой ткани, происходящей от больных раком, и, следовательно, сохраняют как фенотип опухоли, так и генотип. Таким образом, PDTO становятся бесценными для фундаментальных и трансляционных исследований рака и имеют потенциал для значительного улучшения точности онкологии2.
Несмотря на их многообещающий потенциал, эти сложные 3D-модели рака in vitro часто недостаточно используются из-за отсутствия передовых методов анализа. Наиболее часто используемый анализ определяет количество жизнеспособных клеток в PDTO посредством количественной оценки внутриклеточной АТФ3. Эти анализы обычно представляют собой одноточечный, объемный анализ, таким образом, игнорируя критические зависящие от времени ответы и пренебрегая клональными реакциями. В частности, способность контролировать рост ФДО (темпы роста) и их реакцию на специфические методы лечения представляет большой интерес 4,5. Нормализованный ответ на лекарство (NDR), который оценивает ответ на лекарство на основе скорости роста, нормализованной до положительного (ctrl +) и отрицательного контрольного (ctrl-) состояния, также недавно был зарегистрирован как решающий показатель для оценки чувствительности к лекарствам от рака с помощью скрининга на основе клеток, хотя это было преимущественно сделано для 2D-клеточных линий6. Поэтому необходимы более сложные методы анализа, чтобы в полной мере использовать эти более клинически репрезентативные и сложные 3D-модели рака. Микроскопия считается мощным подходом к изучению сложности этих органоидных моделей7.
В этой статье описывается метод мониторинга кинетических реакций лекарств в 3D-моделях рака с использованием обычных широкоугольных микроскопов и систем визуализации живых клеток. Адаптация была сделана к протоколу, описанному Driehuis et al.4 , чтобы быть совместимым с автоматизацией с использованием робота-пипетки, цифрового дозатора лекарств и системы визуализации живых клеток для повышения воспроизводимости и сокращения количества «практических» часов труда. Этот метод позволяет проводить скрининг лекарств со средней и высокой пропускной способностью как сфероидов опухоли с установленными линиями раковых клеток (см. Дополнительную таблицу S1 для тестируемых клеточных линий), так и PDTO в 384-луночном микропластине и мультиорганоидном формате. Используя сверточный сетевой процесс машинного обучения, автоматическая идентификация и отслеживание отдельных сфероидов опухолей или PDTO могут быть выполнены исключительно с помощью визуализации brightfield и без использования флуоресцентных красителей для маркировки живых клеток8. Это очень выгодно, так как большая часть идентификации с помощью визуализации яркого поля требует ручной аннотации (что является трудоемким и трудоемким) или требует добавления флуоресцентных красителей, которые могут запутать реакции лекарств, связанные с окислительным стрессом, вызванным фотоксичностью9.
Полученное программное обеспечение для анализа изображений, разработанное собственными силами, расширяет функциональность обычных систем визуализации живых клеток, поскольку модули анализа 3D-изображений либо недоступны, либо ограничены платформой, либо несовместимы с 384-луночными микропластинами и цельно-луночной визуализацией. Кроме того, эти модули часто имеют высокую цену и предлагают ограниченные объемные считывания органоидов. Поэтому этот метод очень актуален для ученых, которые имеют доступ к широко доступным системам визуализации живых клеток и стремятся извлечь больше информации о лекарственном ответе по сравнению с золотым стандартом, но рудиментарным анализом на основе АТФ. С добавлением специфических показателей гибели клеток реакции цитостатического препарата можно отличить от цитотоксических реакций, что обеспечивает дальнейшее понимание механистических действий лекарств, которые в настоящее время недостижимы из анализа с одной временной точкой. Наконец, визуализация живых клеток позволяет отслеживать отдельные органоиды для получения показателей ответа на отдельные органоидные препараты для захвата гетерогенности ответа и выявления потенциальных резистентных субклонов.
Целью этого метода и связанного с ним программного обеспечения для анализа изображений является внедрение недорогой автоматизации скрининга органоидных препаратов для ограничения вмешательства пользователя и снижения вариативности в обработке, анализе изображений и анализе данных. Чтобы сделать это программное обеспечение доступным для исследователей, оно не зависит от микроскопа и платформы, а также доступно облачное приложение. Таким образом, поддерживая обычные системы визуализации живых клеток, мы также стремимся улучшить их функциональность для приложений 3D-культивирования и анализа.
Protocol
Representative Results
Discussion
Скрининг на лекарства PDTO со средней и высокой пропускной способностью часто опирается на показания, которые извлекают только часть информации, которую органоиды потенциально могут предоставить. Становится все более очевидным, что для того, чтобы быстро развивающаяся органоидная технология реализовала больший научный и клинический потенциал, критически необходимы более продвинутые 3D-анализы, показания и методы анализа. Здесь описан усовершенствованный конвейер скрининга, который не только повышает воспроизводимость, но и значительно повышает клиническую переводимость за счет включения считывания изображений живых клеток на основе ИИ. В дополнение к программному обеспечению для анализа, разработанному собственными силами, реализовано использование нормализованной метрики лекарственного ответа (NDR), которая ясно демонстрирует ее способность определять специфические для пациента различия в ответе на лечение6.
Включение этого показателя нормализации, несомненно, будет иметь огромное значение, напоминая, что многочисленные исследования направлены на то, чтобы очертить ответы на лечение на основе незначительных различий в площади под кривой (AUC) или полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC50) (поскольку большинство кривых «доза-реакция» перекрываются / расположены близко друг к другу)11,12 . Показатели скорости роста уже внедрены в протоколы скрининга органоидных препаратов с использованием анализа на основе АТФ, но полагаются на нормализацию эталонных скважин, лизированных в точке времени 04. Напротив, этот метод позволяет нормализовать скорость роста внутри скважины, что учитывает не только межпациентные различия в скорости роста PDTO, но и межскважинные различия, возникающие в результате изменений плотности посева и эффектов, зависящих от местоположения пластин, для повышения воспроизводимости. Кроме того, мы адаптировали NDR для дальнейшего увеличения разделения межпациентного ответа PDTO путем включения положительного контроля для нормализации 6,8.
Кроме того, анализ, который совместим с высокопроизводительными и автоматизированными форматами, может точно обнаруживать отдельные органоидные реакции, что позволяет количественно оценить субклональную резистентность – основную движущую силу рецидива и прогрессирования опухоли13. Например, хотя PDAC052 и PDAC060 показали хороший ответ на лечение in vitro (на основе NDR), дополнительный одноорганоидный анализ смог обнаружить небольшую (большую популяцию с PDAC060) популяцию субклонов, которые не реагируют на лечение. Интересно, что это в значительной степени соответствовало клиническим наблюдениям, учитывая, что PDAC052 и PDAC060 имели длительный ответ (опухолевая активность не обнаружена), но в конечном итоге оба были диагностированы с местной опухолевой прогрессией (из-за присутствия резистентных клонов). По сравнению с обычными 3D-показаниями (анализ на основе АТФ и размер / числа), ожидается, что этот усовершенствованный конвейер скрининга повысит прогностическую производительность за счет извлечения более клинически значимой информации из этих «пациентов в лаборатории». Эта гипотеза в настоящее время проверяется путем скрининга клинических образцов PDTO в лаборатории авторов с помощью этого метода, чтобы соотнести ex vivo с ответом in vivo и клиническим исходом.
Чтобы получить больше информации о механизмах лекарственного ответа, обычные флуоресцентные реагенты визуализации живых клеток, в дополнение к красителям цитотоксичности, совместимы с этим методом для изучения механизмов гибели клеток. Ранее мы показали совместимость этого метода с зеленым реагентом Sartorius Caspase 3/7 для изучения каспазозависимой индукции апоптоза после лечения цисплатином8. Совместимость с другими красителями для изучения окислительного стресса (реагенты CellROX) или гипоксии (реагенты Image-iT Hypoxia) еще предстоит проверить. Однако эти реагенты уже успешно использовались в 3D моделях in vitro 14,15.
Программное обеспечение для анализа изображений также совместимо с другими форматами пластин или методами культивирования (например, пластинами микрополости, куполами ECM), если могут быть получены четкие, сфокусированные изображения органоидов. Это часто является сложной задачей для органоидов, культивируемых в куполах, поскольку они растут в разных z-плоскостях, что требует функциональности z-укладки микроскопа, которая не всегда доступна. Поэтому мы советуем использовать микропластины с плоским дном ULA 384-well для обеспечения изображения достаточного качества.
Кроме того, анализ совместим с другими системами визуализации живых клеток, как было показано ранее для фазоконтрастных изображений, снятых с помощью системы IncuCyte ZOOM8. Ограничением системы визуализации живых клеток Spark Cyto, которая использовалась в этой рукописи, является емкость одной пластины для кинетических измерений. Тем не менее, расширение Spark Motion увеличивает его емкость до 40 микропластин, которые могут быть экранированы оптом. Совместимость программного обеспечения, разработанного собственными силами, будет распространена на эти и другие системы, чтобы предложить платформенно-независимое решение с целью стандартизации и автоматизации конвейеров анализа изображений и данных. Веб-приложение также будет включать интерактивные графические инструменты и автоматизированные расчеты метрик лекарств, как показано в этом документе, для сокращения времени ручного анализа.
Алгоритм сегментации PDTO без меток был обучен и протестирован на различных собственных моделях сфероидов и PDTO с различными морфологическими различиями (твердое, полутвердое, цистическое) и, следовательно, может обнаруживать их с высокой точностью8. Ограничение модели заключается в том, что включение кистозных PDTO увеличило нежелательное обнаружение пузырьков, присутствующих в скважине после посева. Тем не менее, ночной инкубации было достаточно, чтобы удалить большинство из этих пузырьков, что позволило провести качественное сканирование точки времени 0. Точность сегментации органоидного изображения и метода должна быть проверена другими пользователями, и на основе их отзывов программное обеспечение может быть обучено дополнительно для получения надежного и автоматизированного алгоритма анализа изображений. Кроме того, мы стремимся получить больше клинических данных для корреляции лекарственного ответа ex vivo , количественного с помощью этого метода, с клиническим ответом у пациента, чтобы определить наилучшие параметры для прогнозирования ответа на терапию и дальнейшей разработки этого метода для функциональной прецизионной медицины рака16.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Часть этого исследования финансировалась за счет пожертвований от различных доноров, включая Дедерта Шильда vzw и г-на Вилли Флорена. Эта работа частично финансируется Фламандским исследовательским фондом, 12S9221N (A.L.), G044420N (S.V., A.L., E.G), 1S27021N (M.L),и Фондом промышленных исследований Университета Антверпена, PS ID 45151 (S.V., A.L., C.D.). Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com.
Materials
| 6-well plate | Greiner | 657160 | |
| 8-Channel p300 (GEN 2) pipette | Opentrons | ||
| 300 µL Tips | Opentrons | ||
| 384-well flat-bottom ULA microplate | Corning | 4588 | minimum volume 50 µL |
| 384-well flat-bottom ULA Phenoplate | Perkin Elmer | 6057802 | minimum volume 75 µL |
| A8301 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| ADF+++ | Advanced DMEM/F12, 1% GlutaMAX, 1% HEPES, 1% penicillin/streptomycin | ||
| Advanced DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 12634 | |
| B27 | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| Breathe easy sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z380059 | |
| Caspase 3/7 Green | Sartorius | 4440 | |
| Cell Counting Slides for TC10/TC20 | Bio-Rad Laboratories | 1450017 | |
| CellTiter-Glo 3D | Promega | G9681 | ATP-assay |
| Cooler for 25 mL reservoir | VWR (Diversified Biotech) | 490006-908 | |
| Cooling element 12 x 8 x 3 cm | Bol.com | 9200000107744702 | For custom microplate holder OT-2 |
| Cultrex Organoid Harvesting Solution | R&D systems | 3700-100-01 | |
| Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 | R&D systems | 3533-010-02 | extracellular matrix (ECM) |
| Cytotox Green | Sartorius | 4633 | |
| Cytotox Red | Sartorius | 4632 | |
| D300e | Tecan | Digital drug dispenser | |
| D300e Control v3.3.5 | Tecan | Control software D300e | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| Full Medium | ADF+++ supplemented with 0.5 nM WNT surrogate-Fc-Fusion protein, 4% Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium, 4% Rpso3-Fc Fusion Protein conditioned medium, 1x B27, 1 mM N-acetyl cysteine (NAC), 5 mM nicotinamide, 500 nM A83-01, 100 ng/mL FGF10, and 10 nM Gastrin | ||
| Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| Gemcitabine | Selleck Chemicals | S1714 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 35050 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62259 | |
| Human pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) patient-derived organoids | Biobank@uza (Antwerp, Belgium; ID: BE71030031000; Belgian Virtual Tumorbank funded by the National Cancer Plan) | ||
| N-acetyl-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-25G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium | Immunoprecise | N002 | |
| Opentrons App v6.0.1 | Opentrons | OT-2 control software | |
| Opentrons Protocol Designer Tool | Opentrons | https://designer.opentrons.com/ | |
| Orbits data compression tool | www.orbits-oncology.com or contact corresponding author | ||
| Orbits image analysis webapp | University of Antwerp | www.orbits-oncology.com or contact corresponding author | |
| OT-2 | Opentrons | Pipetting robot | |
| Paclitaxel | Selleck Chemicals | S1150 | |
| Pasteur Pipette 230 mm | Novolab | A33696 | |
| Peniciline-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Rspo3-Fc Fusion Protein conditioned medium | Immunoprecise | N003 | |
| Spark Cyto 600 | Tecan | Live-cell imaging and multi-mode platereader | |
| SparkControl v3.1 | Tecan | Spark Cyto control software | |
| Staurosporine | Tocris Bioscience | 1285 | |
| Sterile 25 mL reservoir | VWR (Diversified Biotech) | 10141-922 | |
| T8 plus cassette | Tecan | ||
| TC20 | Bio-Rad Laboratories | automated cell counter | |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12604-021 | dissociation enzyme |
| Tween-20 | Acros Organics | 233360010 | |
| WNT Surrogate-Fc-Fusion protein | Immunoprecise | N001 | |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 |
References
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Veninga, V., Voest, E. E. Tumor organoids: Opportunities and challenges to guide precision medicine. Cancer Cell. 39 (9), 1190-1201 (2021).
- Le Compte, M., et al. Patient-derived organoids as individual patient models for chemoradiation response prediction in gastrointestinal malignancies. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 157, 103190 (2021).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs. Nature Methods. 13 (6), 521-527 (2016).
- Gupta, A., Gautam, P., Wennerberg, K., Aittokallio, T. A normalized drug response metric improves accuracy and consistency of anticancer drug sensitivity quantification in cell-based screening. Communications Biology. 3 (1), 42 (2020).
- Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
- Deben, C., Cardenas, E., et al. OrBITS: label-free and time-lapse monitoring of patient derived organoids for advanced drug screening. Cellular Oncology. , (2022).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. Bioessays. 39 (8), (2017).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Engel, R. M., et al. Patient-derived colorectal cancer organoids upregulate revival stem cell marker genes following chemotherapeutic treatment. Journal of Clinical Medicine. 9 (1), 128 (2020).
- Hennig, A., et al. Detecting drug resistance in pancreatic cancer organoids guides optimized chemotherapy treatment. The Journal of Pathology. 257 (5), 607-619 (2022).
- D’Alterio, C., Scala, S., Sozzi, G., Roz, L., Bertolini, G. Paradoxical effects of chemotherapy on tumor relapse and metastasis promotion. Seminars in Cancer Biology. 60, 351-361 (2020).
- Njoroge, R. N., et al. Organoids model distinct Vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution. Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).
- Godet, I., et al. Fate-mapping post-hypoxic tumor cells reveals a ROS-resistant phenotype that promotes metastasis. Nature Communications. 10 (1), 4862 (2019).
- Letai, A. Functional precision cancer medicine-moving beyond pure genomics. Nature Medicine. 23 (9), 1028-1035 (2017).
