Karakterisering van een pathogene Escherichia coli-stam afgeleid van Oreochromis spp. Boerderijen met behulp van whole-genome sequencing

Aquacultuur is een van de snelst groeiende voedselproducerende sectoren ter wereld en de productiepraktijken zijn bedoeld om te voldoen aan de stijgende vraag naar voedsel voor menselijke consumptie. De wereldwijde aquacultuurproductie is verdrievoudigd van 34 miljoen ton (Mt) in 1997 tot 112 Mt in 2017¹. De belangrijkste soortengroepen, die bijdroegen aan bijna 75% van de productie, waren zeewier, karpers, tweekleppigen, meervallen en tilapia (Oreochromis spp.) ¹. Het verschijnen van ziekten veroorzaakt door microbiële entiteiten is echter onvermijdelijk vanwege de intensieve viskweek, wat leidt tot potentiële economische verliezen².

Antibioticagebruik in viskweekpraktijken staat bekend om het voorkomen en behandelen van bacteriële infecties, de belangrijkste beperkende factor in productiviteit ^3,4. Niettemin hopen residuele antibiotica zich op in aquacultuursedimenten en water, waardoor selectieve druk wordt uitgeoefend en de vis-geassocieerde en de verblijvende bacteriële gemeenschappen worden gewijzigd 5,6,7,8. Bijgevolg dient de aquacultuuromgeving als reservoir voor antimicrobiële resistentiegenen (ARG’s) en de verdere opkomst en verspreiding van antibioticaresistente bacteriën (ARB) in het omringende milieu⁹. Naast de bacteriële pathogenen die vaak worden waargenomen bij het kweken van vissen, worden leden van de Enterobacteriaceae-familie vaak aangetroffen, waaronder menselijke pathogene stammen van Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp. en Salmonella spp.10. E. coli is het meest voorkomende micro-organisme geïsoleerd uit vismeel en water in de viskweek 11,12,13,14,15.

E. coli is een veelzijdige gramnegatieve bacterie die het maagdarmkanaal van zoogdieren en vogels bewoont als een commensaal lid van hun darmmicrobiota. E. coli bezit echter een zeer adaptief vermogen om te koloniseren en te volharden in verschillende milieuniches, waaronder bodem, sedimenten, voedsel en water¹⁶. Vanwege de genwinst en -verlies door het fenomeen horizontale genoverdracht (HGT), is E. coli snel geëvolueerd tot een goed aangepast antibioticumresistente ziekteverwekker, die een breed spectrum van ziekten bij mens en dier kan veroorzaken^17,18. Op basis van de oorsprong van de isolatie worden pathogene varianten gedefinieerd als intestinale pathogene E. coli (InPEC) of extra-intestinale pathogene E. coli (ExPEC). Bovendien zijn InPEC en ExPEC onderverdeeld in goed gedefinieerde pathotypes op basis van ziektemanifestatie, genetische achtergrond, fenotypische eigenschappen en virulentiefactoren (VFs)16,17,19.

Traditionele kweek- en moleculaire technieken voor pathogene E. coli-stammen hebben de snelle detectie en identificatie van verschillende pathotypen mogelijk gemaakt. Ze kunnen echter tijdrovend, bewerkelijk en vaak een hoge technische training vereisen¹⁹. Bovendien kan geen enkele methode worden gebruikt om alle pathogene varianten van E. coli betrouwbaar te bestuderen vanwege de complexiteit van hun genetische achtergrond. Momenteel zijn deze nadelen overwonnen met de komst van high-throughput sequencing (HTS) -technologieën. Whole-genome sequencing (WGS) benaderingen en bioinformatische hulpmiddelen hebben de exploratie van microbieel DNA betaalbaar en op grote schaal verbeterd, waardoor de diepgaande karakterisering van microben in één run is vergemakkelijkt, inclusief nauw verwante pathogene varianten 20,21,22. Afhankelijk van de biologische vragen kunnen verschillende bioinformatica-tools, algoritmen en databases worden gebruikt om gegevensanalyse uit te voeren. Als het hoofddoel bijvoorbeeld is om de aanwezigheid van ARGs, VFs en plasmiden te beoordelen, kunnen tools zoals ResFinder, VirulenceFinder en PlasmidFinder, samen met hun bijbehorende databases, een goed startpunt zijn. Carriço et ^al.22 gaven een gedetailleerd overzicht van de verschillende bioinformatica-software en gerelateerde databases die worden toegepast voor microbiële WGS-analyse, van ruwe datavoorbewerking tot fylogenetische inferentie.

Verschillende studies hebben het brede nut van WGS aangetoond voor genoomondervraging met betrekking tot antimicrobiële resistentieattributen, pathogeen potentieel en het volgen van de opkomst en evolutionaire relaties van klinisch relevante varianten van E. coli afkomstig van verschillende oorsprong 23,24,25,26 . WGS heeft de identificatie mogelijk gemaakt van moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de fenotypische resistentie tegen antimicrobiële stoffen, inclusief die zeldzame of complexe resistentiemechanismen. Dit gebeurt door het detecteren van verworven ARG-varianten, nieuwe mutaties in geneesmiddeldoelgenen of promotorregio’s^27,28. Bovendien biedt WGS het potentieel om antimicrobiële resistentieprofielen af te leiden zonder voorafgaande kennis over het resistentiefenotype van een bacteriestam²⁹. Als alternatief heeft WGS de karakterisering van de mobiele genetische elementen (MGE’s) met zowel antimicrobiële resistentie als virulentiekenmerken mogelijk gemaakt, wat de bacteriële genoomevolutie van bestaande pathogenen heeft aangedreven. De toepassing van WGS tijdens het onderzoek naar de Duitse E. coli-uitbraak in 2011 resulteerde bijvoorbeeld in het blootleggen van de unieke genomische kenmerken van een schijnbaar nieuw E. coli-pathotype; interessant is dat die uitbraakstammen afkomstig waren van de enteroaggregatieve E. coli (EGA) -groep, die de profaag verwierf die codeert voor het Shiga-toxine van het enterohemorragische E. coli (EHEC) pathotype³⁰.

Dit werk presenteert een methodologische aanpassing van de workflow voor bacteriële WGS met behulp van een benchtop sequencer. Bovendien wordt een bioinformatica-pijplijn geleverd met behulp van webgebaseerde tools om de resulterende sequenties te analyseren en onderzoekers met beperkte of geen bioinformatica-expertise verder te ondersteunen. De beschreven methoden maakten het mogelijk om de antimicrobiële resistentie, virulentie en mobiloomkenmerken van een pathogene E. coli-stam ACM5, geïsoleerd in 2011 uit in het binnenland gekweekt Oreochromis spp. in Sinaloa, Mexico, op^{te helderen}.